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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons un protocole décrivant l'isolement et la culture des explants de cartilage des genoux bovins. Cette méthode fournit un outil facile et accessible pour décrire les changements tissulaires en réponse à des stimuli biologiques ou de nouvelles thérapies ciblant l'articulation.

Résumé

Les systèmes de culture ex vivo couvrent un large éventail d'expériences consacrées à l'étude des tissus et de la fonction cellulaire dans un milieu autochtone. Le cartilage est un tissu unique important pour le bon fonctionnement de l'articulation synoviale et est constitué par une matrice extracellulaire dense (ECM), riche en protéoglycane et collagène de type II. Les chondrocytes sont le seul type de cellules présents dans le cartilage et sont répandus et relativement peu nombreux. Des stimuli externes altérés et la signalisation cellulaire peuvent entraîner des changements dans la composition et la détérioration de l'ECM, qui sont d'importantes caractéristiques pathologiques dans des maladies telles que l'arthrose (Arthrose) et la polyarthrite rhumatoïde.

Les modèles de cartilage ex vivo permettent 1) profilage des altérations médiées de chondrocyte du chiffre d'affaires de tissu de cartilage, 2) visualisant la composition d'ECM de cartilage, et 3) le réarrangement de chondrocyte directement dans le tissu. Le profilage de ces altérations en réponse à des stimuli ou des traitements sont d'une grande importance dans divers aspects de la biologie du cartilage, et complètent des expériences in vitro chez des chondrocytes isolés, ou des modèles plus complexes chez des animaux vivants où les conditions expérimentales sont plus difficiles à contrôler.

Les explants de cartilage présentent une méthode translationnelle et facilement accessible pour évaluer le tissu remodelant dans l'ECM de cartilage dans des arrangements contrôlables. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver les explants vivants de cartilage bovin. La méthode utilise des tissus du genou bovin, qui est facilement accessible à partir de la boucherie locale. Les explantes et le milieu de culture conditionné peuvent être analysés pour étudier le renouvellement des tissus, la composition de l'ECM et la fonction de chondrocyte, profilant ainsi la modulation de l'ECM.

Introduction

Les chondrocytes produisent et maintiennent la matrice de cartilage. Afin d'étudier la biologie des chondrocytes et comment eux et l'ECM environnant réagissent aux stimuli externes, il est crucial de les interroger dans leur environnement natif1,2. L'étude du renouvellement des tissus cartilagineux est importante pour améliorer la compréhension des mécanismes sous-jacents dans les maladies articulaires telles que l'arthrose, une maladie pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement modifiant la maladie. Par conséquent, il y a un besoin important de meilleurs modèles de traduction2.

La caractérisation ex vivo des effets cellulaires et tissulaires est essentielle pour compléter d'autres modèles précliniques, à la fois in vitro, tels que les cultures monocouches de chondrocytes, et in vivo, tels que les modèles d'arthrose induits par la chirurgie ou le modèle d'arthrite auto-immune induit par le collagène (CIA ). De nombreuses études ont mis en évidence les différences entre le se comporter dans les cultures monocouches 2D et les structures 3D ou dans leur tissu indigène3,4. Beaucoup de cellules dans les couches 2D adoptent des morphologies non naturelles, y compris des différences dans la polarité cellulaire et l'attachement de tissu, ayant pour résultat des différences visuelles et fonctionnelles dans les cellules dans les tissus indigènes5. Les différences sont également apparentes dans la fonctionnalité des cellules, qui peuvent changer l'expression des protéines, conduisant à des modèles de différenciation profondément modifiés, les machines de régulation, et la fonctionnalité cellulaire5,6,7 ,8.

Le cartilage ECM se compose principalement de collagène de type II fournissant un cadre de matrice, et l'aggrecan, un protéoglycane qui aide à retenir le liquide dans le tissu. D'autres molécules de matrice telles que le collagène de type IV, VI, IX, X, XI, XII, la fibronectin, la protéine oligomeric de cartilage (COMP), le biglycan, la décoration, et la perlecan sont également présentes9.

Tandis que l'étiologie de l'arthrose reste peu claire10,11, le début de la maladie est censé être causé par des déséquilibres dans le renouvellement des tissus et les processus de réparation12,13. La dégradation du cartilage articulaire est une caractéristique de l'arthrose. Les chondrocytes ou les cellules du cartilage-résident dans les tissus environnants augmentent leur libération de cytokines, stimulant la production élevée de protéinases telles que les métalloprotéinases de matrice (MMP) et les aggrecanases, qui augmentent la dégradation de l'ECM de cartilage 14. Cette dégradation entraîne la libération de petits fragments de protéines uniques appelés néo-épitopes, qui peuvent être quantifiés dans le sérum, l'urine ou le milieu de culture15. Lors de la formation et de la maturation du collagène, des soi-disant profragments sont également libérés ; ceux-ci peuvent être quantifiés comme mesure de la production de matrice16.

Le but de ce protocole est d'établir un modèle de cartilage ex vivo pour comparer l'effet de la stimulation et/ou du traitement médicamenteux sur le renouvellement des tissus ECM. Le renouvellement du cartilage est profilé en mesurant les biomarqueurs néoépitope dérivés de la matrice directement dans le milieu de culture conditionné à l'aide d'ELISA : AGNx1 (reflétant l'activité de l'aggrecanase), C2M (reflétant l'activité MMP de matrice) et ProC2 (reflétant le collagène de type II formation). Les résultats peuvent être vérifiés par la coloration histologique de l'ECM, qui visualise également l'organisation des chondrocytes dans les explants individuels. Le protocole décrit peut être employé pour tester l'effet des traitements nouveaux sur la fonction de chondrocyte et le chiffre d'affaires d'ECM de cartilage. Un certain nombre d'études ont utilisé des explants de cartilage pour décrire les processus biologiques ou l'effet de l'intervention sur les explants cytokine-contestés utilisant des approches histologiques ou immunohistochimiques quantitatives, arnAS, expression de protéine, ou protéomique2 ,17,18. Cependant, ces protocoles ne sont pas du champ d'application du manuscrit actuel.

Protocole

1. Isolement tissulaire

  1. Approvisionnement en tissus
    1. Effectuez toute la section d'approvisionnement en tissu à l'extérieur d'une hotte à flux laminaire dans un environnement aseptique.
    2. De l'abattoir local, obtenir une articulation du genou tibiofemoral bovin frais entier des veaux entre 1,5 et 2 ans.
    3. Disséquez doucement le genou du mollet en enlevant d'abord l'excès de chair, en découvrant les condyles, ménisques, tendons et membrane synoviale. Couper les tendons et la membrane synoviale, ce qui permet à l'articulation de se démembrer. Enlever le ménisque pour exposer les condyles fémoraux.
    4. Isoler les explants de la zone porteuse des condyles fémoraux à l'aide d'un poinçonneur de biopsie de 3 mm et les libérer de la surface articulaire en coupant avec un scalpel parallèle à l'os subchondral et aussi près que possible. La structure dure de l'os subchondral devrait s'assurer que les explants ne contiennent pas de matrice calcifiée. Efforcez-vous pour les explantations à hauteur uniforme.
    5. Entreposez immédiatement les explants dans DMEM/F12- GlutaMAX - 1% P/S culture medium dans un tube de 50 ml ou un plat Petri. Ne mélangez pas les explants de différents genoux de vache, mais restez séparés pour chaque étude.
  2. Culture de tissu
    1. Transférer les explants dans une plaque stérile de 96 puits dans une hotte à écoulement laminaire.
    2. Laver les explants 3 fois dans le milieu de culture ou PBS et les culture dans 200 L de milieu de culture par puits jusqu'au début de l'expérience. Utilisez une période de lavage de 1 jour pour synchroniser l'activité cellulaire de biopsie et la libération passive de biomarqueurs.
    3. Culture les explantations jusqu'à 10 semaines dans un incubateur de 37 oC avec 5% de CO2. Placez toutes les répliques dans chaque groupe en diagonale dans la plaque de culture pour minimiser la variation induite par l'évaporation. Pour éviter davantage l'évaporation du supernatant, ajouter du PBS aux puits extérieurs de la plaque de culture.

2. Le traitement et l'évaluation d'explantation de cartilage bovin

  1. Changement et traitement de la culture
    1. Changer le milieu de culture tous les 2-3 jours dans une hotte à flux laminaire.
    2. Si vous appliquez des traitements, préparez-les avant de changer le milieu. Préparer les traitements à la concentration souhaitée dans les puits d'explantation par dilution dans le milieu de culture.
    3. Retirez délicatement le supernatant de chaque puits et transférez-le dans une nouvelle plaque de puits de 96. Entreposer le supernatant avec du ruban adhésif à 20 oC pour l'analyse des biomarqueurs du chiffre d'affaires des tissus et de l'expression des protéines.
    4. Ajouter immédiatement 200 L de milieu de culture frais ou de traitement par puits. Ne laissez pas les explants sécher pendant le changement moyen et assurez-vous que toutes les explants sont complètement immergés dans le nouveau milieu.
  2. Coloration de résine
    1. Mesurer l'activité métabolique une fois par semaine comme mesure indirecte de la viabilité cellulaire. Le test de résazurine est un moyen facile d'évaluer si l'activité métabolique des explants se détériore pour une explantation individuelle en raison de la mort cellulaire ou des changements cellulaires. Les explantes dans le milieu de culture seulement ont une lecture relativement stable de resazurin tout au long de la période d'expérience.
    2. Faire une solution de milieu de culture avec 10% de resazurin.
    3. Récoltez le supernatant tel que décrit à l'étape 2.1.3.
    4. Immerger les explantations dans une solution de résine de 10 % pendant 3 h à 37 oC ou jusqu'à ce que les supernatants deviennent violets. Inclure 4 puits sans explants comme commandes d'arrière-plan.
    5. Transférer la solution de resazurin conditionnée et de contrôle de fond sur une plaque de microtimètre noir et mesurer la fluorescence à 540 nm d'excitation/590 nm d'émission.
    6. Laver soigneusement 3 fois dans le milieu de culture ou PBS et immerger les explants dans le milieu de lavage pendant 5-10 min pour permettre à la résine de se diffuser complètement. Ajoutez un nouveau milieu de culture ou des traitements s'ils sont utilisés.

3. Termination, fixation et stockage d'échantillons

  1. Fin de la période de culture
    1. Mesurer l'activité métabolique telle que décrite à l'étape 2.2. Ajouter 200 L de PBS par puits.
  2. Fixation et stockage
    1. Retirer le PBS, ajouter 200 l de formaldéhyde par puits et laisser reposer 2 h à température ambiante.
    2. Disposer du formaldéhyde et ajouter 200 L de PBS par puits. Couvrir la plaque de ruban adhésif et conserver à 4 oC pour une analyse histochimique. Nous vous recommandons d'effectuer une analyse histochimique dans les 3 mois.

4. Biomarqueurs de rotation des tissus (ELISA)

  1. ELISAs concurrents indirects
    1. Enrober une plaque de streptavidine avec la cible-peptide d'analyse biotinylated spécifique diluée 1:100 dans le tampon d'analyse (100 l par puits) pendant 30 min à 20 oC.
    2. Laver 5 fois avec un tampon de lavage standard et ajouter l'échantillon-supernatant (20 L par puits) avec l'anticorps monoclonal primaire contre la cible d'analyse-peptide dilué 1:93.3 pour ProC2 et 1:100 dans le tampon d'analyse pour AGNx1 (100 l par puits) et incuber pendant 2 h à 20 oC avec des secousses pour ProC2 et 3 h à 20 oC pour AGNx1.
      REMARQUE : Le volume de l'échantillon est directement prélevé sur les plaques de supernatant stockées. Si la concentration mesurée est hors de la plage de mesure d'analyse, diluer le supernatant dans une plaque de dilution à fond en V dans PBS ou tampon d'analyse.
    3. Laver 5 fois avec un tampon de lavage standard et incuber avec un anticorps secondaire étiqueté peroxidase dilué 1:100 dans un tampon d'analyse (100 l par puits) pendant 1 h à 20 oC.
    4. Laver 5 fois avec un tampon de lavage standard et incuber en secouant pendant 15 min dans l'obscurité à 20 oC avec de la tétramethylbenzidine (TMB) comme substrat peroxidase (100 l par puits).
    5. Terminez la réaction avec une solution d'arrêt standard, 0,1 M H2SO4 (100 l par puits).
    6. Lisez la réaction colorimétrique à 450 nm absorbance à l'aide d'une absorption de référence à 650 nm sur un lecteur de plaque de laboratoire standard.
  2. ELISAs compétitifs directs pour la mesure du renouvellement du tissu cartilagineux dans le supernatant
    REMARQUE: Cela quantifie C2M.
    1. Enrober une plaque de streptavidine d'un taux d'analyse biotinylated spécifique dilué 1:100 dans un tampon d'analyse (100 l par puits) pendant 30 min à 20 oC.
    2. Laver 5 fois avec un tampon de lavage et ajouter l'échantillon-supernatant ainsi que 100 l d'anticorps monoclonal étiqueté peroxidase contre la cible d'analyse-peptide dilué 1:100 dans le tampon d'analyse (20 L par puits). Incuber pendant 20 h à 2'8 oC en secouant.
      REMARQUE : Le volume de l'échantillon est directement prélevé sur les plaques de supernatant stockées. Si la concentration mesurée est hors de la plage de mesure d'analyse, diluer le supernatant dans une plaque de dilution à fond en V dans PBS ou tampon d'analyse.
    3. Laver 5 fois avec un tampon de lavage standard et couver avec secouer pendant 15 min dans l'obscurité à 20 oC avec TMB comme substrat peroxidase (100 l par puits).
    4. Terminez la réaction avec une solution d'arrêt standard, 0,1 M H2SO4 (100 l par puits).
    5. Lisez la réaction colorimétrique à 450 nm absorbance avec une absorption de référence à 650 nm sur un lecteur de plaque de laboratoire standard.
  3. AGNx1 (en)
    1. Quantifier la dégradation de l'aggrecan en mesurant la libération du néo-épitoptop agNx1. Cet analyse ELISA indirecte compétitive vise le peptide aggrecan C-terminal (NITEGE373) généré par adamTS-4 et 5 clivage. L'anticorps monoclonal reconnaît tous les fragments avec un épitope NITEGE exposé. Les détails expérimentaux de l'essais ont été publiés ailleurs19.
  4. ProC2 (En)
    1. Quantifier la formation de collagène de type II en mesurant la libération du profragment du collagène de type II. Cet analyse ELISA indirecte compétitive cible l'épitopie du propeptide PIIBNP (QDVRQPG) généré par les propeptidases N lors de l'élagage du collagène de type II nouvellement synthétisé. Les détails expérimentaux de l'essais ont été publiés ailleurs16.
  5. C2M (En)
    1. Quantifier la dégradation du collagène de type II en mesurant la libération du fragment de néoépitopène C2M. Cette ELISA compétitive directe reconnaît le peptide C-terminal C clivé MMP (KPPGRDGAAG1053). Cet analyse diffère de AGNx1 et ProC2 car c'est l'anticorps primaire qui est peroxidase étiqueté et donc, utilisé comme détecteur. Les détails expérimentaux de l'essais ont été publiés ailleurs20.

5. Analyse histologique

  1. Infiltration, intégration et coupe
    1. Placez les explants fixes (voir l'étape 3.2) dans des cassettes étiquetées individuellement. Inclure à la fois une étiquette dans les cassettes et les cassettes pour assurer l'identification.
    2. Transférer les cassettes contenant des explantations à un robot culinaire. Ensuite, infiltrer les explantations avec de la paraffine dans une série de déshydratation et d'infiltration de paraffine étapes.
      1. Déshydrater avec 96 % d'éthanol pendant 90 min sans réglage de température. Répétez cette étape 3 fois.
      2. Effacer l'éthanol avec du toluène pendant 90 min sans réglage de température. Répétez cette étape 2 fois.
      3. Effacer l'éthanol avec du toluène pendant 90 min à 60 oC.
      4. Infiltrer avec de la cire de paraffine pendant 30 min à 60 oC.
      5. Infiltrer à l'infiltrer avec de la cire de paraffine pendant 60 min à 60 oC.
      6. Infiltrer avec de la cire de paraffine pendant 90 min à 60 oC.
      7. Pour chaque étape, ajoutez les solutions dans la chambre d'échantillon avec des débits lents de pompage et de pompage sous 33-34 kPa. Exécuter le processus d'infiltration dans un cycle de pression/vide avec un vide maximum de 65 à 70 kPa.
    3. Après l'infiltration, placez les cassettes sur un bloc chauffant pour permettre le retrait minutieux des explants de la cassette. Incorporez délicatement les explantations infiltrées dans des blocs de paraffines individuels. Avec des forceps chauffés, placez les explants avec le cartilage articulaire superficiel et les côtés subchondral d'os perpendiculaires à la surface de coupe, assurant la visualisation des différentes couches de cartilage dans chaque section de spécimen.
    4. Couper des sections de 5 m de paraffines refroidies avec des explantations intégrées sur un microtome. Transférer les sections coupées dans un bain d'eau froide. Si nécessaire, les sections peuvent être séparées à l'aide d'un scalpel ou d'un verre de couverture.
    5. À l'aide d'un toboggan en verre non couché, transférer les sections dans un bain d'eau chaude (50 oC), où les sections se déploient. Soulevez chaque section sur un toboggan de couverture étiqueté et placez-les sur une plaque chaude pendant 30 min.
    6. Placer les toboggans dans un panier et les incuber à 60 oC pendant 1 h, puis les garder toute la nuit à 37 oC. Par la suite, entreposez les glissières dans des contenants fermés à 4 oC jusqu'à ce qu'elles soient tachées.
  2. Safranin O/Fast Green coloration et visualisation
    1. Placer les toboggans pour les souir dans un panier et les couver à 60 oC pendant 1 h.
    2. Préparer et filtrer tous les réactifs à l'intérieur d'un filtre de 0,45 mm.
    3. En préparation de la coloration, versez les réactifs filtrés dans des béchers à un volume qui permet aux solutions de couvrir complètement les diapositives lors de l'immersion du panier. Les béchers utilisés nécessitaient un volume de 250 ml pour couvrir les glissières.
    4. Déparaffiniser les lames fondues en submergeant le panier dans du toluène pendant 10 min deux fois, 99 % d'éthanol deux fois, 96 % d'éthanol deux fois et 70 % d'éthanol deux fois. Ensuite, hydrater les toboggans dans l'eau pendant 2 min.
    5. Tainr les toboggans déparaffinisés et hydratés en submergeant le panier dans la solution d'hématoxyline de fer de Weigert (pH 1,5) pendant 10 min, tremper dans 1 % de HCl une fois, et rincer à l'eau courante du robinet pendant environ 5 minutes ou jusqu'à ce que l'excès de couleur ait disparu.
    6. Ensuite, tachez dans la solution Fast Green de 0,05% (pH: 5,75) pour 5 min, trempez dans 1% CH3COOH une fois, et tachez dans 0,1% Safranin O (pH: 6,5) pour 20 min.
    7. Déshydrater et effacer les lames en trempant deux fois dans 70 % d'éthanol, 96 % d'éthanol pour 2 min deux fois, 99 % d'éthanol pendant 2 min deux fois et le toluène 2 min deux fois.
    8. Montez les lames de verre non couchées avec le milieu résineux couvrant les glissières d'histologie.

Résultats

Les explants bovins en profondeur ont été isolés, cultivés et traités pendant 3 semaines(figure 1). Le milieu de culture a été changé avec l'ajout du traitement 3 fois par semaine. Une fois par semaine, l'activité métabolique a été mesurée par l'analyse de resazurin. Les biomarqueurs du chiffre d'affaires de l'ECM ont été mesurés dans le supernatant récolté à partir de la plaque de culture 3 fois par semaine. Les explantations ont été divisées en 4 groupes pour le trait...

Discussion

Le protocole présenté ici pour le profilage du renouvellement des tissus cartilagineux dans les explants de cartilage bovin peut être utilisé pour caractériser les effets de traitement de nombreux types de médicaments, y compris les inhibiteurs des voies intracellulaires inflammatoires, inhibiteurs de protéolytiques, ou facteurs de croissance anabolisants.

Deux configurations différentes ont été décrites dans ce protocole : une configuration anabolisante où des explants ont été s...

Déclarations de divulgation

CST, ACBJ et MK sont des employés de Nordic Bioscience. ACBJ et MK détiennent des actions de Nordic Bioscience. Les autres auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le personnel technique de Nordic Bioscience pour son soutien en laboratoire, ainsi que la Fondation danoise de la recherche pour son soutien général à notre recherche.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
45% Iron(III) chloride solutionSigma-Aldrich12322
Acetic acidMerck1.00056.2500
Alamar BlueLife tech InvitrogenDAL1100
Biopsy processing cassettes – greenIHCWORLDBC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)ScandidatMTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)Local slaughterhouse
C2MNordic BioscienceFee for service
Corning 96-well plateSigma-AldrichCLS7007
Cover Glass Ø 13 mmVWR631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPESGibco31331-028
Ethanol ≥96%VWR83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%VWR83813.36
exAGNx1Nordic BioscienceFee for service
exPRO-C2Nordic BioscienceFee for service
Fast greenSigma-AldrichF7252
Formaldehyde solution 4%Merck1004965000
GM6001Sigma-AldrichM5939-5MG
HematoxylinSigma-AldrichH3136
Hydrochloric acidMerck30721-M
IGF-1Sigma-AldrichI3769-50UG
Oncostatin MSigma-AldrichO9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)Sigma-AldrichP4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)HistoLab811
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Safranin OSigma-AldrichS2255
Sterile Standard ScalpelsIntegra Miltex12-460-451
Sulfuric acidSigma-Aldrich30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope SlidesThermo scientificJ1800AMNT
TNF-alphaR&D Systems210-TA-100
TolueneMerck1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-FiltermaxTPP99955

Références

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