Sığır Diz Eksbitkilerinde Kıkırdak Remodeling Ex Vivo Doku Kültür Modeli

Özet

Burada, büyükbaş dizleri kıkırdak eksültasyonunun izole edilmesi ve kültürlenmesini açıklayan bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, eklemi hedefleyen biyolojik uyaranlara veya yeni terapötiklere yanıt olarak doku değişikliklerini tanımlamak için kolay ve erişilebilir bir araç sağlar.

Özet

Ex vivo kültür sistemleri, doğal bir ortamda doku ve hücresel fonksiyon eğitimine adanmış çok çeşitli deneyleri kapsar. Kıkırdak sinovyal eklemin düzgün çalışması için önemli benzersiz bir dokudur ve proteoglikan ve tip II kollajen açısından zengin yoğun bir ekstrasellüler matriks (ECM) tarafından oluşturulmuştur. Kondrositler kıkırdak içinde bulunan tek hücre tipidir ve yaygın ve sayıları nispeten düşüktür. Değiştirilmiş dış uyaranlar ve hücresel sinyalizasyon ECM bileşiminde değişikliklere ve bozulmaya yol açabilir, osteoartrit gibi hastalıklarda önemli patolojik özellikleri olan (OA) ve romatoid artrit.

Ex vivo kıkırdak modelleri izin 1) kıkırdak doku ciro kondrosit aracılı değişiklikler profilleme, 2) kıkırdak ECM kompozisyongörselleştirme, ve 3) doku da doğrudan kondrosit rearrangement. Bu değişikliklerin uyaranlara veya tedavilere yanıt olarak profilleilmesi kıkırdak biyolojisinin çeşitli yönlerinde yüksek öneme sahiptir ve izole kondrositlerde in vitro deneyleri veya deneysel koşulların olduğu canlı hayvanlarda daha karmaşık modellerde in vitro deneyleri tamamlamaktadır. kontrol etmek daha zordur.

Kıkırdak eksperleri, kontrol edilebilir ortamlarda kıkırdak ECM doku remodeling değerlendirmek için bir çeviri ve kolay erişilebilir bir yöntem salar. Burada canlı büyükbaş kıkırdak ekskbitkileri izole etmek ve kültüre etmek için bir protokol uyguluyoruz. Yöntem kolayca yerel kasaplık erişilebilir sığır diz, doku kullanır. Doku cirosu, ECM bileşimi ve kondrosit fonksiyonunu araştırmak için hem ekskbitkiler hem de şartlı kültür ortamı analiz edilerek ECM modülasyonu profillenebilmiştir.

Giriş

Kondrositler kıkırdak matrisini üretir ve korurlar. Kondrositlerin biyolojisini ve onların ve çevredeki ECM'nin dış uyaranlara nasıl tepki verdiğini incelemek için, onları yerel^ortam1,2'desorgulamak çok önemlidir. Kıkırdak doku cirosunun incelenmesi, şu anda tedaviyi değiştiren bir hastalık bulunmayan OA gibi eklem hastalıklarında altta yatan mekanizmaların anlaşılmasını sağlamak açısından önemlidir. Sonuç olarak, daha iyi çeviri^modelleri2 için önemli bir ihtiyaç vardır.

Hücre ve doku etkilerinin ex vivo karakterizasyonu kondrosit monolayer kültürler gibi in vitro, ve in vivo, cerrahi kaynaklı OA modelleri veya otoimmün kollajen kaynaklı artrit modeli (CIA) gibi diğer preklinik modelleri tamamlamak için gereklidir ). Çok sayıda çalışma hücrelerin 2D monolayer kültürlerde ve 3D yapılarda veya kendi doğal doku^3,4nasıl davranışlarını arasındaki farkları vurgulamıştır. 2D tabakalardaki birçok hücre, hücre polaritesi ve doku eki farklılıkları da dahil olmak üzere doğal olmayan morfolojileri benimseyerek, doğal dokulardaki hücrelerde hem görsel hem de fonksiyonel farklılıklara yol açar⁵. Farklılıklar da hücrelerin işlevselliği belirgindir, hangi protein ekspresyonu kayması olabilir, derinden değişmiş farklılaşma desenleri yol, düzenleyici makine, ve hücre işlevselliği^{5,6,7 ,8}.

Kıkırdak ECM bir matris çerçeve sağlayan tip II kollajen esas oluşur, ve aggrecan, doku içinde sıvı tutmaya yardımcı olan bir proteoglikan. Kollajen tip IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronektin, kıkırdak oligomerik protein (COMP), biglycan, decorin ve perlecan gibi diğer matris molekülleri de mevcut⁹.

OA etiyolojisi belirsiz kalırken^10,11, hastalığın başlangıcı doku ciro ve onarım süreçlerinde dengesizlikler neden olduğuna inanılmaktadır^12,13. Eklem kıkırdağının bozulması OA'nın bir özelliğidir. Kıkırdak yerleşik kondrositler veya çevre dokularda hücreler sitokin salınımını artırmak, matris metalloproteinazlar gibi proteinlerin yüksek üretimini uyarıcı (MDP) ve aggrecanases, kıkırdak ECM bozulmasını artırmak ¹⁴. Bu bozulma, serum, idrar veya kültür ortamı^15'teölçülebilen neo-epitoponlar adı verilen küçük benzersiz protein parçalarının salınımına neden olur. Kollajen oluşumu ve olgunlaşması üzerine, sözde profragments da serbest bırakılır; bu matris üretiminin bir ölçüsü olarak ölçülebilir¹⁶.

Bu protokolün amacı, stimülasyon ve/veya ilaç tedavisinin ECM doku cirosu üzerindeki etkisini karşılaştırmak için bir ex vivo kıkırdak modeli oluşturmaktır. Kıkırdak cirosu, elisa: AGNx1 (agrega aktivitesini yansıtan), C2M (matriks MMP aktivitesini yansıtan) ve ProC2 (tip II kollajeni yansıtan) kullanılarak doğrudan şartlı kültür ortamında matris kaynaklı neo-epitop biyobelirteçlerin ölçülmesiyle profillenir. oluşumu). Bulgular, ecm histolojik boyama ile doğrulanabilir, aynı zamanda bireysel ekstremite kondrosit organizasyonu görselleştirir. Açıklanan protokol kondrosit fonksiyonu ve kıkırdak ECM ciro üzerinde yeni tedavilerin etkisini test etmek için kullanılabilir. Bir dizi çalışmada, nicel histolojik veya immünhistokimyasal yaklaşımlar, mRNA, protein ekspresyonu veya proteomik ler kullanılarak biyolojik süreçleri veya müdahalenin sitokin-meydan lı ekstremiteler üzerindeki etkisini tanımlamak için kıkırdak eksplorleri kullanılmıştır^{2 ,17,18}. Ancak, bu protokoller geçerli makalenin kapsamı dışındadır.

Protokol

1. Doku izolasyonu

1. Doku kaynak
   1. Bir aseptik ortamda bir laminar akış başlık dışında tüm doku kaynak bölümü gerçekleştirin.
   2. Yerel mezbaha dan, 1.5 ve 2 yaş ları arasında buzağılardan bütün bir taze sığır tibiofemoral diz eklemi elde.
   3. Yavaşça ilk aşırı eti kaldırarak buzağı diz incelemek, konisileler ortaya, menisküs, tendin, ve sinovyal membran. Tendonu ve sinovyal membranı keserek eklemin parçalanmasına izin verin. Femoral kondiles ortaya çıkarmak için menisküs çıkarın.
   4. 3 mm biyopsi zımba layıcı kullanarak femoral konilerin yük taşıyan alanından ekskbitkileri izole edin ve subkondral kemiğe paralel ve subkondral kemiğe mümkün olduğunca yakın bir neşterle keserek eklem yüzeyinden serbest bırakın. Subkondral kemiğin sert yapısı eksektirlerin kalsifiye matris içermemesini sağlamalıdır. Tek tip yüksekliği ile explants için çalışıyoruz.
   5. Explants'i hemen DMEM/F12- GlutaMAX + %1 P/S kültür ortamında 50 mL'lik bir tüpveya Petri kabında saklayın ve karıştırın. Farklı dizlerinden ekseforları karıştırmayın ama her çalışma için ayrı tutun.
2. Doku culturing
   1. Bir laminar akış kaputunda steril 96-iyi plaka eksplants aktarın.
   2. Ekspertizleri kültür ortamında veya PBS'de 3 kez yıkayın ve deney başlayana kadar her kuyuda 200 μL kültür ortamında kültürleyin. Biyopsi hücresel aktivite ve pasif biyomarker salınımını senkronize etmek için 1 günlük bir yıkama süresi kullanın.
   3. Kültür% 5 CO₂ile 37 ° C inkübatör 10 haftaya kadar explants . Buharlaşmanın neden olduğu varyasyonu en aza indirmek için her grup taki tüm kopyaları çapraz olarak kültür plakasına yerleştirin. Supernatant buharlaşmasını önlemek için, kültür plakasının dış kuyularına PBS ekleyin.

2. Büyükbaş kıkırdak eksplant tedavisi ve metabolik aktivitenin değerlendirilmesi

1. Kültür orta değişim ve tedavi
   1. Laminar akış kaputunda her 2-3 günde bir kültür ortamını değiştirin.
   2. Herhangi bir tedavi uyguluyorsanız, ortamı değiştirmeden önce bunları hazırlayın. Kültür ortamında seyreltme ile eksplant kuyularında istenen konsantrasyona tedavileri hazırlayın.
   3. Yavaşça her kuyudan supernatant çıkarın ve yeni bir 96 kuyu plaka aktarın. Doku cirosu ve protein ekspresyonunun biyomarker analizi için mühürleme bandı ile süpernatantı −20 °C'de saklayın.
   4. Hemen taze kültür orta veya tedavi kuyu başına 200 μL ekleyin. Eksplants orta değişim sırasında kurumasını izin vermeyin ve tüm ekstenler tamamen yeni ortamda batırılmış olduğundan emin olun.
2. Resazurin boyama
   1. Hücre canlılığının dolaylı bir ölçümü olarak metabolik aktiviteyi haftada bir kez ölçün. Resazurin testi, eksplantların metabolik aktivitesinin hücre ölümü veya hücresel değişiklikler nedeniyle bireysel ekstryen için bozulursa değerlendirmek için kolay bir yoldur. Sadece kültür ortamındaki eksperler deney dönemi boyunca nispeten kararlı bir resazurin okumalarına sahiptir.
   2. % 10 resazurin ile kültür ortamı bir çözüm olun.
   3. Adım 2.1.3'te açıklandığı gibi supernatant hasat.
   4. Eksplanları 37 °C'de 3 saat veya süpernatantlar mora dönüşene kadar %10 resazurin çözeltisi içine batırın. Arka plan kontrolleri olarak explants olmadan 4 kuyu ekleyin.
   5. Şartlı ve arka plan kontrol resazurin çözeltisini siyah mikrotiter plakaya aktarın ve 540 nm uyarma/590 nm emisyonda floresan'ı ölçün.
   6. Kültür orta veya PBS iyice 3 kez yıkayın ve resazurin tamamen dağıtmak için izin 5-10 dakika boyunca yıkama ortamı ekspesleri batırın. Yeni kültür ortamı veya kullanılırsa tedaviler ekleyin.

3. Sonlandırma, fiksasyon ve numune depolama

1. Kültür süresinin sona ermesi
   1. 2.2. adımda açıklandığı gibi metabolik aktiviteyi ölçün. Kuyu başına 200 μL PBS ekleyin.
2. Fiksasyon ve depolama
   1. PBS çıkarın, iyi başına formaldehit 200 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat bekletin.
   2. Formaldehitatın ve kuyu başına 200 μL PBS ekleyin. Plakayı sızdırmazbantla kapatın ve histokimyasal analiz için 4 °C'de saklayın. Histokimyasal analizini 3 ay içinde yapmanızı öneririz.

4. Doku ciro biyobelirteçleri (ELISA)

1. Dolaylı rekabet ELISA'lar
   1. Coat bir streptavidin-plaka özel biyotinylated asay hedef-peptid ile 1:100 ispat tampon (iyi başına 100 μL) için 30 dakika 20 °C seyreltilmiş.
   2. Standart yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın ve numune-supernatant (kuyu başına 20 μL) ile birlikte proc2 için 1:93.3 seyreltilmiş ve 1:100 AGNx1 için test tamponunda seyreltilmiş test hedef-peptid karşı birincil monoklonal antikor ile birlikte ekleyin (iyi başına 100 μL) ve 20 °C'de 2 saat için kuluçka AGNx1 için 20 °C'de ProC2 ve 3 saat için sallayarak.
      NOT: Örnek hacmi doğrudan depolanan supernatant plakalardan alınır. Ölçülen konsantrasyon, titreşme aralığının dışındaysa, PBS veya sayma tamponundaki v-dipli seyreltme plakasında ki süpernatantı seyreltin.
   3. Standart yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın ve peroksidaz etiketli ikincil antikor ile 1:100'de 20 °C'de 1 saat boyunca test sonucu (kuyu başına 100°L) seyreltin.
   4. Standart yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın ve 20 °C'de karanlıkta 15 dakika sallayarak peroksidaz substrat (kuyu başına 100 μL) olarak tetrametilbenzidin (TMB) ile yıkayın.
   5. Reaksiyonu standart durdurma çözeltisi olan 0,1 M H₂SO₄ (kuyu başına 100°L) ile sonlayın.
   6. Standart bir laboratuvar plakası okuyucusunda 650 nm'de referans emicilik kullanarak 450 nm emici renklendirici reaksiyonu okuyun.
2. Supernatant kıkırdak doku ciroölçümü için Doğrudan Rekabetçi ELISAs
   NOT: Bu C2M ölçer.
   1. Coat bir streptavidin plakası ile spesifik biyotinylated asay hedef-peptid 20 °C'de 30 dakika boyunca 1:100'ü ispret tamponunda (kuyu başına 100°L) seyreltilmiş.
   2. Yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın ve numune-supernatant ile birlikte 100 μL peroksidaz etiketli monoklonal antikor ile test hedef-peptid 1:100 test sonucu test (kuyu başına 20 μL) karşı ekleyin. 2-8 °C'de 20 saat boyunca titreyerek kuluçkaya yatın.
      NOT: Örnek hacmi doğrudan depolanan supernatant plakalardan alınır. Ölçülen konsantrasyon, titreşme aralığının dışındaysa, PBS veya sayma tamponundaki v-dipli seyreltme plakasında ki süpernatantı seyreltin.
   3. Standart yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın ve 20 °C'de karanlıkta 15 dakika sallayarak peroksidaz substrat (kuyu başına 100 μL) olarak TMB ile yıkayın.
   4. Reaksiyonu standart durdurma çözeltisi olan 0,1 M H₂SO₄ (kuyu başına 100°L) ile sonlayın.
   5. Standart bir laboratuvar plakası okuyucusunda 650 nm'de referans emicilik ile 450 nm emici renklendirici reaksiyonu okuyun.
3. AGNx1
   1. AGNx1 neo-epitop salınımını ölçerek aggrecan yıkımını ölçün. Bu dolaylı rekabetçi ELISA test, ADAMTS-4 ve 5 dekoltesi tarafından üretilen aggrecan C-terminal peptidini (NITEGE³⁷³⁾hedefler. Monoklonal antikor, maruz kalmış NITEGE epitopu olan tüm parçaları tanır. Tofaşın deneysel detayları başka bir yerde¹⁹olarak yayınlanmıştır.
4. ProC2
   1. Tip II kollajen profragment salınımını ölçerek tip II kollajen oluşumunu ölçün. Bu dolaylı rekabetçi ELISA tonu, yeni sentezlenen tip II kollajenin budaşımı sırasında N-propeptidazlar tarafından oluşturulan PIIBNP propeptidin (QDVRQPG) epitopesini hedefler. T.C. denemenin deneysel detayları başka bir yerde¹⁶olarak yayınlanmıştır.
5. C2M
   1. C2M neo-epitop parçasının salınımını ölçerek tip II kollajen yıkımını ölçün. Bu doğrudan rekabetçi ELISA MMP-cleaved C-terminal peptid tanır (KPPGRDGAAG^1053). Bu teşp AGNx1 ve ProC2'den farklıdır, çünkü peroksidaz etiketli ve böylece dedektör olarak kullanılan birincil antikordur. Denemenin deneysel detayları başka bir yerde²⁰olarak yayınlanmıştır.

5. Histolojik analiz

1. Sızma, gömme ve kesme
   1. Sabitlenmiş eksplants yerleştirin (adım 3.2 bakınız) tek tek etiketli kasetler içine. Kimlik tespiti için hem kasete hem de etiket kasetlerine bir etiket ekleyin.
   2. Eksploris içeren kasetleri bir doku işlemci makinesine aktarın. Sonra dehidratasyon ve parafin infiltrasyon adımları bir dizi parafin ile explants sızma.
      1. Sıcaklık ayarı olmadan 90 dakika boyunca %96 etanol ile susuz kalın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
      2. Hiçbir sıcaklık ayarı ile 90 dakika için toluen ile etanol temizleyin. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
      3. Etanol'ü toluen ile 60 °C'de 90 dk temizleyin.
      4. 60 °C'de 30 dk parafin balmumu ile sızın.
      5. 60 °C'de 60 dk parafin balmumu ile sızın.
      6. 60 °C'de 90 dk parafin balmumu ile sızın.
      7. Her adım için, 33-34 kPa altında yavaş pompa-out ve pompa-in akışları ile örnek odasına çözümleri ekleyin. Sızma işlemini maksimum vakum −65 ila −70 kPa vakumile basınç/vakum döngüsünde çalıştırın.
   3. Sızmayı takiben, kasetleri bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve ekskamaların kasetten dikkatlice çıkarılmasını bekleyin. Sızmış ekspbitkileri tek tek parafin bloklarına nazikçe yerleştirin. Isıtmalı çalgılarile, eksperleri yüzeysel eklem kıkırdağı ve subkondral kemik kenarları kesme yüzeyine dik olarak yerleştirerek her numune bölümündeki farklı kıkırdak tabakalarının görüntülenmesini sağlar.
   4. Bir mikrotom üzerinde gömülü eksplants ile soğutulmuş parafin blokları 5 μm bölümleri kesin. Kesilen bölümleri soğuk su banyosuna aktarın. Gerekirse, kesitler neşter veya kapak camı kullanılarak ayrılabilir.
   5. Kaplamasız cam bir kaydırak kullanarak, bölümleri, bölümlerin açıldığı ılık su banyosuna (50 °C) aktarın. Her bölümü etiketli bir kapak kaydırağı üzerine kaldırın ve 30 dakika boyunca sıcak bir tabağa yerleştirin.
   6. Slaytları bir sepete yerleştirin ve 60 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın ve gece boyunca 37 °C'de tutun. Daha sonra, slaytları 4 °C'de kapalı kaplarda boyama kadar saklayın.
2. Safranin O/Hızlı Yeşil boyama ve görselleştirme
   1. Bir sepete boyanacak slaytları yerleştirin ve slaytları 60 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
   2. 0,45 mm filtre ile tüm reaktifleri hazırlayın ve filtreleyin.
   3. Boyama için hazırlanırken, süzülen reaktifleri beaers'e dökün ve bu da çözeltilerin sepeti batırırken slaytları tamamen kaplamasını sağlayan bir ses eve dökün. Kullanılan gagalar slaytları kapsayacak şekilde 250 mL hacim gerektiriyor.
   4. Sepeti toluene iki kez, %99 etanol 2 dk iki kez, %96 etanol 2 dk iki kez ve %70 etanol 2 dk iki kez toluene batırarak erimiş slaytları deparafinize edin. Daha sonra, 2 dakika suda slaytlar nemlendirin.
   5. Weigert'in Demir Hematoksilin çözeltisindeki (pH 1.5) sepeti 10 dakika boyunca batırarak, %1 HCl'ye bir kez batırarak ve fazla renk yıkanana kadar akan musluk suyuyla durulayın.
   6. Sonra, 5 dk için % 0.05 Hızlı Yeşil çözelti (pH: 5.75), bir kez% 1 CH₃COOH daldırma ve 20 dakika için% 0.1 Safranin O (pH: 6.5) leke leke.
   7. Dehydrate ve iki kez% 70 etanol, 2 dakika için% 96 etanol iki kez daldırma slaytlar temizleyin, 2 dk için% 99 etanol iki kez, ve toluen 2 dk iki kez.
   8. Histoloji slaytlarını kaplayan rekartlı orta ile kaplamasız cam slaytları monte edin.

Sonuçlar

Büyükbaş tam derinlemesine eksüleler izole edildi, kültürlendi ve 3 hafta boyunca tedavi edildi(Şekil 1). Haftada 3 kez tedavinin eklenmesiyle kültür ortamı değiştirildi. Haftalık bir kez, metabolik aktivite resazurin tsay ile ölçüldü. ECM cirobiyobelirteçleri haftada 3 kez kültür plakasından hasat supernatant ölçüldü. Eksektifler tedavi için 4 gruba ayrılmıştır: 1) Onkostatin M ve TNFα (O+T); 2) O+T + GM6001 (GM6001); 3) Büyüme Faktörü-1 (IGF-1) gibi insü...

Tartışmalar

Büyükbaş kıkırdak ekskatörlerinde kıkırdak doku cirosunun profilini çıkarmak için burada sunulan protokol, inflamatuar hücre içi yolların inhibitörleri, inhibitörleri de dahil olmak üzere birçok ilaç çeşidinin tedavi edici etkilerinin karakterize edilmesinde kullanılabilir. proteolitik enzimler veya anabolik büyüme faktörleri.

Bu protokolde iki farklı kurulum tanımlanmıştır: eksplalerin insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) ile uyarıldığı anabolik bir ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955