JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتغير تركيز Na + داخل الخلايا ([Na +]i) في الخلايا العضلية القلبية أثناء أمراض القلب. [Na +]أنا منظم مهم ل Ca2+ داخل الخلايا. نقدم نهجا جديدا لقياس [Na +] i في الخلايا العضلية الأذينية المعزولة حديثا في الفئران باستخدام كاميرا جهاز مقترن مشحون مضاعف للإلكترون (EMCCD) وإضاءة سريعة يمكن التحكم فيها.

Abstract

تركيز الصوديوم داخل الخلايا ([Na +]i) هو منظم مهم ل Ca2+ داخل الخلايا. توفر دراستها نظرة ثاقبة لتنشيط مبادل Na +/Ca2+ السركوليم، وسلوك قنوات Na+ ذات الجهد الكهربائي و Na+,K +-ATPase. يتم تغيير إشارات Ca2+ داخل الخلايا في الأمراض الأذينية مثل الرجفان الأذيني. في حين أن العديد من الآليات الكامنة وراء التوازن المتغير داخل الخلايا Ca2+ تتميز ، فإن دور [Na +]i وعدم تنظيمه في أمراض الأذينين غير مفهوم جيدا. [Na +]أنا في الخلايا العضلية الأذينية يزيد استجابة لزيادة معدلات التحفيز. لذلك فإن الاستجابة لتحفيز المجال الخارجي أمر بالغ الأهمية لقياسات [Na +] i في هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب التحضير الطويل (تحميل الصبغة) ومدة التجربة (المعايرة) بروتوكول عزل ينتج عنه خلايا عضلية أذينية ذات جودة استثنائية. نظرا لصغر حجم أذينات الفئران وتكوين المصفوفة بين الخلايا ، فإن عزل الخلايا العضلية الأذينية للفئران البالغة عالية الجودة يصعب. هنا ، نصف بروتوكول عزل محسن قائم على نضح Langendorff يوفر باستمرار إنتاجية عالية من الخلايا العضلية الفئرانية الأذينية عالية الجودة.

إيزوفثاليت البنزوفوران المرتبط بالصوديوم (SBFI) هو مؤشر Na + الفلوري الأكثر استخداما. يمكن تحميل SBFI في الخلايا العضلية القلبية إما في شكلها الملحي من خلال ماصة زجاجية أو كإستر أسيتوكسي ميثيل (AM) الذي يمكنه اختراق الغشاء السارمي للخلايا العضلية. داخل الخلايا ، يتم إزالة الأسترة SBFI-AM بواسطة استيرازات العصارة الخلوية. نظرا للتغيرات في اختراق الغشاء وإزالة الأسترة العصارية الخلوية ، يجب معايرة كل خلية في الموقع. عادة ، يتم إجراء قياسات [Na +]i باستخدام التألق اللوبي فلوري للخلية الكاملة SBFI باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي (PMT). يسمح هذا الإعداد التجريبي بقياس خلية واحدة فقط في وقت واحد. نظرا لطول تحميل صبغة الخلايا العضلية والمعايرة بعد كل تجربة ، يكون إنتاجية البيانات منخفضة. لذلك قمنا بتطوير تقنية قائمة على كاميرا EMCCD لقياس [Na +]i. يسمح هذا النهج بقياسات متزامنة [Na +] i في الخلايا العضلية المتعددة وبالتالي زيادة كبيرة في العائد التجريبي.

Introduction

في الأمراض الأذينية (على سبيل المثال ، الرجفان الأذيني [AF]) تتغير إشارات Ca2+ داخل الخلايا بشكلعميق 1. في حين أن العديد من الآليات الأساسية لإشارات Ca2+ "المعاد تشكيلها" داخل الخلايا في AF قد تم تمييزها جيدا2،3 ، فإن الدور الذي قد يلعبه تركيز الصوديوم المتغير داخل الخلايا ([Na +]i) غير مفهوم جيدا. [Na +]أنا منظم مهم ل Ca2+ داخل الخلايا. يمكن أن توفر دراسة [Na +] i نظرة ثاقبة لتنشيط مبادل Na + / Ca2+ (NCX) ، وسلوك قنوات Na + و Na + ، K + -ATPase (NKA) 4. لقد أظهرنا سابقا أن معدلات التنشيط الأذيني العالية ، كما تحدث أثناء الرجفان الأذيني ، تؤدي إلى انخفاض كبير في [Na +] i 1. أظهر العمل السابق زيادة في كثافة التيار NCX (INCX) ومستويات التعبير عن البروتين في AF3. كما تم الإبلاغ عن زيادة في المكون المتأخر لتيار Na + المعتمد على الجهد (INa ، متأخر) في الخلايا العضلية الأذينية المعزولة من المرضى الذين يعانون من الرجفان الأذيني5. وبالتالي ، هناك دليل على وجود تغييرات عميقة في التوازن داخل الخلايا Na + في الرجفان الأذيني. لذلك هناك حاجة إلى قياسات موثوقة وقابلة للتكرار ل [Na +] i في الخلايا العضلية الأذينية المعزولة لتعزيز فهمنا لأمراض الرجفان الأذيني. هنا ، نوضح كيفية عزل الخلايا العضلية الأذينية عالية الجودة في الفئران بشكل متكرر والتي تكون مناسبة لقياسات [Na +]i. لقد ركزنا بروتوكول عزل الخلايا الأذينية المحسن على الخلايا العضلية الأذينية في الفئران لأن نماذج الفئران المعدلة وراثيا (TG) للرجفان الأذيني أصبحت جزءا حيويا من أبحاث الرجفان الأذيني6. غالبا ما تكون هذه الفئران متوفرة بأعداد محدودة فقط وغالبا ما تكون الأذينين ليفية مما يؤدي إلى تحديات لعزل الخلايا.

بشكل عام ، يمكن قياس [Na +] i في الخلايا القابلة للحياة باستخدام مؤشرات الفلورسنت7،8 ، أو بأنواع مختلفة من الأقطاب الكهربائيةالدقيقة 9. تتطلب التقنيات القائمة على الأقطاب الكهربائية الدقيقة اختراق الغشاء السارم. لذلك تقتصر هذه التقنية على الخلايا الأكبر حجما وهي غير مناسبة للخلايا العضلية الأذينية الصغيرة والضيقة التي تتعرض سلامة خلايتها للخطر بسهولة.

إيزوفثاليت البنزوفوران المرتبط بالصوديوم (SBFI) هو مؤشر فلوري ، يخضع لتحول كبير في الطول الموجي عند ربط Na + 7. يتم إثارة SBFI بالتناوب عند 340 نانومتر و 380 نانومتر ويتم جمع التألق المنبعث بعد المرور عبر مرشح انبعاث (510 نانومتر). يمكن لنسب الإشارات عند طولي موجي الإثارة (F340/380) أن تلغي طول المسار المحلي وتركيز الصبغة والاختلافات المستقلة عن الطول الموجي في شدة الإضاءة وكفاءة الكشف. عندما يتم إجراء معايرة في الموقع باستخدام محاليل ذات تركيز معروف للصوديوم ([Na +]) في كل خلية ، فإن نسبة F340/380 التي تم الحصول عليها أثناء التجربة تعطي قياسات دقيقة وحساسة ل [Na +]i. مثل جميع مؤشرات Na + ، يعرض SBFI أيضا بعض التقارب ل K +. يسمح استخدام طريقة المعايرة الموضحة هنا ب "المشبك" بشكل موثوق [Na +]i وتركيز البوتاسيوم داخل الخلايا ([K +]i) أثناء عملية المعايرة بحيث يمكن معايرة [Na +] i بشكل موثوق حتى عندما يكون <10٪ من [K +] i 10.

نقدم تقنية جديدة تعتمد على كاميرا EMCCD للقياسات النسبية ل [Na +] i باستخدام SBFI. تسمح كاميرا EMCCD ، لأول مرة ، بقياسات [Na +] i المتزامنة (والمعايرة) في خلايا متعددة. هذا مفيد بشكل خاص في بيئة تجريبية حيث تكون أعداد محدودة (على سبيل المثال ، نماذج الفئران المعدلة وراثيا). عادة ، يتم إجراء قياسات [Na +]i باستخدام SBFI باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) لجمع التألق الفائق للخليةبأكملها 1،11. بينما توفر PMTs دقة زمنية جيدة جدا لإشارة التألق ، فإن الدقة المكانية منخفضة جدا وتقتصر التجارب على خلية واحدة في كل مرة.

يسهل بروتوكولنا الجديد قياسات حساسة وقابلة للتكرار للغاية ل [Na +]i. تم تحسينه للاكتساب المتزامن للتغيرات في [Na +]i في الخلايا العضلية الأذينية المتعددة في الفئران ، ولكنه قابل للتكيف مع العديد من أنواع الخلايا الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) بجامعة ماريلاند ، بالتيمور.

1. عزل الخلايا العضلية الأذينية عن قلوب الفئران البالغة

  1. ضع كل فأر في مبخر دقيق وغرفة تحريض مملوءة بغاز الأيزوفلوران في أكسجين بنسبة 100٪.
  2. اضبط تدفق الأيزوفلوران على 1٪ حتى لا يستجيب قبل إعطاء حقن الهيبارين داخل الصفاق (1-1.25 وحدة / جم) قبل 15 دقيقة من القتل الرحيم.
  3. تخدير الفأر بعمق عن طريق زيادة تخدير الأيزوفلوران إلى 5٪ وتأكيد مستوى التخدير العميق عن طريق قرصة القدم.
  4. إجراء القتل الرحيم عن طريق إجراء بضع الصدر السريع12. استخدم ملقط نمط قياسي ومقص جراحي لفتح الصدر. قم بتعبئة القلب والرئة بشكل سلبي ، وعزل قوس الأبهر ، وامسك بالملقط وقطع الشريان الأورطي لإزالة القلب.
  5. ضع القلب في محلول عزل الخلايا الخالي من Ca2+ (CIB ، الجدول 1).
  6. قم بتسلية الشريان الأورطي بقنية 22 جم وربطة عنق باستخدام خياطة حريرية تحت مجهر ضوئي بتكبير 3x في محلول CIB (الشكل 1 أ ، ب).
  7. تأكد من أن القنية أعلى بكثير من الجيوب الأبهرية عن طريق توصيل محلول CIB من خلال القنية المتصلة بحقنة وتأكيد نضح الشريان التاجي تحت المجهر.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لضمان التروية المناسبة للأنسجة الأذينية لأنه ثبت أن تشريح الشريان التاجي متغير للغاية في الفئران13.
  8. قم بتركيب القلب على Langendorff القائم على الجاذبية وقم بتثبيته باستخدام محلول CIB الخالي من Ca2+ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لغسل الدم المتبقي حتى يصبح الشطف صافيا (الشكل 1C).
  9. قم بالتبديل إلى المحلول الأنزيمي (الجدول 2) وقم بتسخينه لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى يصبح النسيج الأذيني ناعما ومترهلا.
  10. استئصال الأذين الأيمن والأيسر باستخدام ملقط فائق الإمساك ومقص زنبركي صغير وانقله إلى طبق استزراع صغير يحتوي على محلول إنزيمي CIB المستخدم في الخطوة 1.8 ولكن مع 0.15 ملي كلوريدالكالسيوم 2 وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق (الشكل 1 د).
  11. انقل الأذينين إلى طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على 4 مل من محلول التخزين الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) (محلول Tyrode المعدل (الجدول 3) الذي يحتوي على 15 ملي مولار من ألبومين مصل الأبقار و 30 ملي مولار 2،3-بوتانيديون مونوكسيم).
  12. قطع الأذينين إلى شرائح مناديل صغيرة (10-20 ، حسب حجم الأذين) باستخدام مقص زنبركي صغير وملقط فائق الإمساك.
  13. للتفكك الميكانيكي ، قم بشفط تعليق الأنسجة برفق باستخدام ماصات باستور زجاجية مختلفة مصقولة بالنار مع فتحات تتراوح بين 2-5 مم. ابدأ بأكبر طرف ماصة وانتقل إلى أصغر طرف ماصة، مع الشفط من 5 إلى 10 مرات لكل ماصة.
  14. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مرشح 200 ميكرومتر وأضف CaCl2 ثلاث مرات كل 10 دقائق لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.3 ملليمتر.

2. تقييم جودة الخلية

  1. ضع 200 ميكرولتر من معلق الخلية الذي يحتوي على الخلايا العضلية الأذينية المعزولة حديثا على غطاء زجاجي.
  2. استخدم هدفا 10x لحساب جميع الخلايا في مجال الرؤية وتصنيفها على أنها مستديرة أو على شكل قضيب. حدد عدد الخلايا على شكل قضيب تظهر خطا متقاطعا واضحا (قم بالتبديل إلى هدف 25x إذا كان من الصعب تحديد ذلك ، انظر الشكل 2C).
  3. كرر الخطوات 2.1–2.2.
  4. احسب النسب المئوية للمستديرة والشكل القضيب وشكل قضيب مع خلايا مخطط متقاطعة واضحة.
  5. قم بتعديل إجراء عزل الخلايا حتى تصبح 80٪ من الخلايا على شكل قضيب مع خط متقاطع واضح.
  6. ضع 500 ميكرولتر من تعليق الخلية الأذينية على غطاء زجاجي مطلي بطبقة من اللامينين وضع حجرة الخلية على المجهر المقلوب. دع الخلايا تستقر لمدة 5 دقائق. Perfuse مع محلول Tyrode الذي يحتوي على 1.8 ملي مولار Ca2+.
  7. استخدم نظام محفز الخلية لبدء تحفيز المجال الكهربائي (نبضة ثنائية القطب 2 مللي ثانية ، 30 فولت) عند 0.5 هرتز وحساب عدد الخلايا التي تنقبض في مجال رؤية هدف 10x.
  8. كرر مع تحفيز المجال الخارجي عند 3 هرتز.
  9. احسب النسبة المئوية للخلايا التي تستجيب لمعدلات التحفيز 0.5 و 3 هرتز (انظر الشكل 2 ب). صقل بروتوكول عزل الخلايا حتى تستجيب 50٪ من الخلايا لتحفيز المجال 3 هرتز.

3. تحميل مؤشر Na + للخلايا العضلية الأذينية المعزولة حديثا في الفئران

  1. استخدم إستر أسيتوكسي ميثيل الخلية (AM) لمؤشر الفلورسنت المرتبط بالصوديوم البنزوفوران (SBFI-AM).
  2. لتسهيل تشتت الصبغة وتحقيق تحميل خلوي متجانس ، قم بإذابة SBFI في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) والبوليولات الخافضة للتوتر السطحي المناسبة (على سبيل المثال ، الجنب) لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر SBFI في تعليق الخلية.
  3. قم بتحميل الخلايا باستخدام SBFI لمدة 60 دقيقة محمية من الضوء على الروك في درجة حرارة الغرفة.
  4. دع الخلايا تستقر لمدة 30 دقيقة ، وقم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في محلول التخزين (1-2 مل).
    ملاحظة: يجب إجراء التجارب في غضون 4 ساعات من عزل الخلية. يتم غسل BDM عن طريق التروية بمحلول Tyrode قبل بدء التجارب14.

4. الأجهزة ، قياسات [Na +] i ومعايرة [Na +] i

ملاحظة: يوضح الشكل 3 مخطط مسار الضوء للأجهزة التجريبية.

  1. إعداد محاليل المعايرة مع زيادة تركيزات Na + كما هو موضح في الجداول 4-6.
  2. يضاف عامل النفاذية gramicidin D (10 ميكرومتر؛ من محلول مخزون مخزن عند -20 درجة مئوية) ومثبط Na + و K + ATPase ستروفانتيدين (100 ميكرومتر، من محلول مخزون مخزن عند -20 درجة مئوية) إلى كل محلول معايرة. دوامة جيدا ، أو استخدم مكبر صوتي للتأكد من إذابة الجراميسيدين والستروفانتدين تماما.
  3. املأ نظام التروية متعدد الأسطوانات بمحاليل المعايرة التي تحتوي على [Na +] O المتزايد المحضر في الخطوتين 4.1 و 4.2. قم بتوصيله بغرفة الخلية باستخدام معدلات التروية البطيئة (~ 1 مل / دقيقة ؛ يمكن أن تختلف معدلات التروية باختلاف حجم حجرة الخلية).
  4. قم بتوصيل الشفط بغرفة الخلية وجمع الطرد في حاوية (زجاجية) مناسبة على الأرض.
  5. توقف عن التروية والشفط.
  6. بعد السماح لمدة 30 دقيقة من إزالة الأسترة SBFI ، ضع 100 ميكرولتر من معلق الخلية المركز (الخطوة 3.5) المحمل بالصبغة على غطاء زجاجي مطلي باللامينين فوق مجال رؤية هدف المجهر المقلوب 40x.
  7. استخدم مصباح التبديل السريع مع مصدر ضوء زينون بقدرة 300 وات. حقق تصويرا واسعا بطولين موجيين للإثارة (340 نانومتر و 380 نانومتر) باستخدام مرايا المسح الضوئي سريعة التبديل ومرشحات الإثارة ذات النطاق الترددي الضيق (340 نانومتر ± 10 نانومتر ؛ 380 نانومتر ± 10 نانومتر).
  8. تحسين مجال رؤية كاميرا EMCCD. تتطلب منطقة المراقبة الأكبر أوقات إطارات أطول. تؤدي أوقات الإطارات الأطول إلى مزيد من تبييض المؤشر. وبالتالي ، قم بموازنة حجم مجال الرؤية ووقت الإطار بحيث لا يحدث تبييض ملحوظ للمسبار.
  9. حدد أنه لا يوجد سوى الحد الأدنى من التألق الجوهري في مجموعة فرعية من الخلايا الأذينية غير المحملة ب SBFI من خلال التأكد من أن التألق الجوهري للخلايا مشابه لمضان الخلفية (كما هو موضح في الشكل 4).
  10. تحديد معدل أخذ العينات المناسب اعتمادا على التصميم التجريبي (يمكن أن تكون معدلات أخذ العينات منخفضة لأن التغييرات في [Na +]i بطيئة نسبيا (على سبيل المثال ، يتم الحصول على نقطة بيانات واحدة كل 10-20 ثانية).
  11. خفف ضوء الإثارة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة المناسبة (ND) وتقليل شدة مصدر الضوء بشكل مناسب (على سبيل المثال ، عن طريق تغيير الشدة في برنامج التشغيل).
  12. اجمع ضوء الانبعاث عند 510 ± 40 نانومتر باستخدام المرشحات المناسبة مع كاميرا EMCCD متصلة بالمجهر المقلوب.
  13. حدد منطقة الاهتمام (ROI) لكل خلية وعائد استثمار في الخلفية (انظر الشكل 4). اطرح الخلفية من إشارات F340 و F380 المسجلة (إما عبر الإنترنت أو أثناء تحليل البيانات).
  14. ابدأ الحصول على البيانات.
  15. أعد تشغيل التروية والشفط. قم بعمل النفخ لمدة 10-15 دقيقة باستخدام محلول Tyrode الذي يحتوي على 1.8 ملي مولار من Ca2+ وسجل خط أساس F340/380 مستقرا قبل بدء التجربة.
    ملاحظة: تأكد من تسجيل خط أساس ثابت لمدة 10-15 دقيقة. في حالة حدوث التبييض (على سبيل المثال ، تقليل خط الأساس F340/380 ) ، يهدف إلى زيادة تخفيف شدة الإضاءة إما عن طريق زيادة كثافة مرشح الكثافة المحايدة ، وتقليل شدة إشارة ضوء الإثارة و / أو وقت إطار الاستحواذ (انظر الخطوات 4.10-4.11).
  16. ابدأ قياس [Na +] i وفقا لسؤال البحث.

5. [Na +] أنا معايرة

  1. بعد الانتهاء من التجربة (الخطوة 4.16) قم بإجراء معايرة لإشارة F340/380 في كل خلية في الموقع.
  2. معايرة إشارة F340/380 عن طريق نفخ الخلايا العضلية المحملة ب SBFI مع محاليل المعايرة (المعدة في الخطوات 4.1-4.3).
  3. قم بإجراء الفتيات خطوة بخطوة لرفع [Na +] o من 0 إلى 20 ملم. انتظر إشارة F340/380 مستقرة قبل الانتقال إلى التركيز التالي (~ 5 دقائق حسب معدل التدفق ؛ انظر الشكل 3 ب والشكل 5 أ).
    ملاحظة: يجب أن تكون العلاقة بين إشارة F340/380 و[Na +] لحلول المعايرة خطية لمعايرة صحيحة لإشارة F340/380 (الشكل 5 والشكل 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تقييم جودة الخلايا الأذينية
تم تقييم الخلايا العضلية الأذينية المعزولة حديثا بناء على مورفولوجيا الخلية والاستجابة للتحفيز الميداني كما هو موضح في البروتوكول في ست عزلات متتالية للخلايا الأذينية. تظهر البيانات الموضحة في الشكل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نقدم هنا تقنية جديدة قائمة على كاميرا EMCCD للقياس الكمي المتزامن ل [Na +] i في الخلايا العضلية الأذينية المتعددة القابلة للحياة باستخدام إيزوفثالات البنزوفوران المرتبطة بالصوديوم (SBFI). النهج الموصوف هنا هو الأول الذي يسمح بالقياس المتزامن ل [Na +] i في خ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة تطوير العلماء من جمعية القلب الأمريكية (14SDG20110054) إلى MG. منحة التدريب متعددة التخصصات من المعاهد الوطنية للصحة في بيولوجيا العضلات (T32 AR007592) ومنحة تدريب أمراض القلب والأوعية الدموية من المعاهد الوطنية للصحة (2T32HL007698-22A1) إلى LG ؛ منحة تطوير العلماء من جمعية القلب الأمريكية (15SDG22100002) إلى LB ومن خلال المعاهد الوطنية للصحة تمنح R01 HL106056 و R01 HL105239 و U01 HL116321 إلى WJL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
340 Excitation FilterChromaET40X25 mm
380 Excitation FilterChromaET80X25 mm
510 Emission FilterChromaET510/80m25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA7906
Bubble trapBD Medical Technologies904477Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solutionSigma-Aldrich21115
CannulaBD Medical Technologies305167Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell ChamberCustom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water BathVWR
Collagenase IIWorthingtonLS004176Specific activity 290 U/g
CreatinineSigma-AldrichC0780
DG5-plus illuminatorSutter InstrumentLambda DG-4/DG-5 Plus
DMSOThermo FischerBP231
EGTASigma-AldrichE4378
EMCCD cameraPrinceton InstrumentsProEM-HS
Fine HemostatsFine Science Tools130-20
Fine ScissorsFine Science Tools14060-10
Forceps SupergripFine Science Tools00632-11
Glass Cover slipsVWR483808925 mm circle
GlucoseSigma-AldrichG7528
Gramicidin DSigma-AldrichG5002
HEPESSigma-AldrichH3375
Inner silicon TubingVWRVWRselect brand silicon tubing
Inverted microscopeNikon InstrumentsNikonTE 2000 U
Isolation Tools
K GluconateSigma-AldrichP1847
KCISigma-AldrichP5405
KH2PO4Calbiochem529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *Sigma-AldrichM0250
MyoPacer Cell StimulatorIonOptix
Na GluconateSigma-AldrichS2054
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS9390
Natural Mouse LamininThermo Fischer230170150.5-2.0 mg/ml
Outer tubingVWR
Petri dish 35X10 mmFalcon351008
PowerLoadThermo FischerP10020
Protease XXIVSigma-AldrichP8038
SBFI-AMThermo FischerS1264
Silk sutureFine Science Tools18020-500.12 mm diameter
Small Spring scissorsFine Science Tools15000-03
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12
StrophanthidinSigma-AldrichG5884
Surgical Scissors Tough CutFine Science Tools14054-13
Suture Tying ForcepsFine Science Tools00272-13
TaurineSigma-AldrichT0625
TrisbaseSigma-AldrichTRIS-RO
TrypsinSigma-AldrichT0303
UVFS Reflective 0.1 ND FilterThorlabsNDUV01B25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND FilterThorlabsNDUV02B25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND FilterThorlabsNDUV03B25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND FilterThorlabsNDUV05B25 mm
UVFS Reflective 1 ND FilterThorlabsNDUV010B25 mm

References

  1. Greiser, M., et al. Tachycardia-induced silencing of subcellular Ca2+ signaling in atrial myocytes. Journal of Clinical Investigation. , (2014).
  2. Greiser, M., Lederer, W. J., Schotten, U. Alterations of atrial Ca(2+) handling as cause and consequence of atrial fibrillation. Cardiovascular Research. 89, 722-733 (2011).
  3. Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125, 2059-2070 (2012).
  4. Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
  5. Sossalla, S., et al. Altered Na(+) currents in atrial fibrillation effects of ranolazine on arrhythmias and contractility in human atrial myocardium. Journal American College of Cardiology. 55, 2330-2342 (2010).
  6. Wan, E., et al. Aberrant sodium influx causes cardiomyopathy and atrial fibrillation in mice. Journal of Clinical Investigation. 126, 112-122 (2016).
  7. Minta, A., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. Journal of Biological Chemistry. 264, 19449-19457 (1989).
  8. Donoso, P., Mill, J. G., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. Fluorescence measurements of cytoplasmic and mitochondrial sodium concentration in rat ventricular myocytes. Journal of Physiology. 448, 493-509 (1992).
  9. Friedman, S. M., Jamieson, J. D., Hinke, J. A., Friedman, C. L. Use of glass electrode for measuring sodium in biological systems. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 99, 727-730 (1958).
  10. Harootunian, A. T., Kao, J. P., Eckert, B. K., Tsien, R. Y. Fluorescence ratio imaging of cytosolic free Na+ in individual fibroblasts and lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 264, 19458-19467 (1989).
  11. Despa, S., Islam, M. A., Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Intracellular [Na+] and Na+ pump rate in rat and rabbit ventricular myocytes. Journal of Physiology. 539, 133-143 (2002).
  12. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. Journal of Phsiological Sciences. 57, 327-335 (2007).
  13. Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. Journal of Anatomy. 199, 473-482 (2001).
  14. Yu, Z. B., Gao, F. Non-specific effect of myosin inhibitor BDM on skeletal muscle contractile function]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 21, 449-452 (2005).
  15. Levi, A. J., Lee, C. O., Brooksby, P. Properties of the fluorescent sodium indicator "SBFI" in rat and rabbit cardiac myocytes. Journal of Cardiovasc Electrophysiology. 5, 241-257 (1994).
  16. Baartscheer, A., Schumacher, C. A., Fiolet, J. W. Small changes of cytosolic sodium in rat ventricular myocytes measured with SBFI in emission ratio mode. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 3375-3383 (1997).
  17. Despa, S., Tucker, A. L., Bers, D. M. Phospholemman-mediated activation of Na/K-ATPase limits [Na]i and inotropic state during beta-adrenergic stimulation in mouse ventricular myocytes. Circulation. 117, 1849-1855 (2008).
  18. Correll, R. N., et al. Overexpression of the Na+/K+ ATPase alpha2 but not alpha1 isoform attenuates pathological cardiac hypertrophy and remodeling. Circulation Research. 114, 249-256 (2014).
  19. Hinke, J. Glass micro-electrodes for measuring intracellular activities of sodium and potassium. Nature. 184 (Suppl 16), 1257-1258 (1959).
  20. Thomas, R. C. New design for sodium-sensitive glass micro-electrode. Journal of Physiology. 210, 82P-83P (1970).
  21. Thomas, R. C. Membrane current and intracellular sodium changes in a snail neurone during extrusion of injected sodium. Journal of Physiology. 201, 495-514 (1969).
  22. Slack, C., Warner, A. E., Warren, R. L. The distribution of sodium and potassium in amphibian embryos during early development. Journal of Physiology. 232, 297-312 (1973).
  23. Eisner, D. A., Lederer, W. J., Vaughan-Jones, R. D. The control of tonic tension by membrane potential and intracellular sodium activity in the sheep cardiac Purkinje fibre. Journal of Physiology. 335, 723-743 (1983).
  24. Despa, S., Kockskamper, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. Na/K pump-induced [Na](i) gradients in rat ventricular myocytes measured with two-photon microscopy. Biophysical Journal. 87, 1360-1368 (2004).
  25. Kornyeyev, D., et al. Contribution of the late sodium current to intracellular sodium and calcium overload in rabbit ventricular myocytes treated by anemone toxin. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310, H426-H435 (2016).
  26. Szmacinski, H., Lakowicz, J. R. Sodium Green as a potential probe for intracellular sodium imaging based on fluorescence lifetime. Annals of Biochemistry. 250, 131-138 (1997).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Na i Na Ca2 Na Na K ATPase Langendorff SBFI Na EMCCD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved