Mediciones basadas en cámara de [Na+] intracelular en miocitos auriculares murinos

Resumen

La concentración intracelular de Na⁺ ([Na⁺]_i) en los miocitos cardíacos se altera durante las enfermedades cardíacas. [Na⁺]_i es un importante regulador del Ca²⁺ intracelular. Presentamos un enfoque novedoso para medir [Na⁺]_i en miocitos auriculares murinos recién aislados utilizando una cámara de dispositivo acoplado cargado multiplicador de electrones (EMCCD) y un iluminador rápido y controlable.

Resumen

La concentración intracelular de sodio ([Na⁺]_i) es un importante regulador del Ca²⁺ intracelular. Su estudio proporciona información sobre la activación del intercambiador sarcolemal Na⁺/Ca²⁺, el comportamiento de los canales de Na⁺ dependientes de voltaje y la Na⁺,K⁺-ATPasa. La señalización intracelular de Ca²⁺ está alterada en enfermedades auriculares como la fibrilación auricular. Si bien se caracterizan muchos de los mecanismos subyacentes a la homeostasis intracelular alterada del ^Ca2+, el papel de [Na+]_i y su desregulación en las patologías auriculares es poco conocido. [Na⁺]_i en los miocitos auriculares aumenta en respuesta al aumento de las tasas de estimulación. Por lo tanto, la capacidad de respuesta a la estimulación del campo externo es crucial para las mediciones de [Na⁺]_i en estas células. Además, la larga preparación (carga de colorante) y la duración del experimento (calibración) requieren un protocolo de aislamiento que produzca miocitos auriculares de una calidad excepcional. Debido al pequeño tamaño de las aurículas de ratón y a la composición de la matriz intercelular, es difícil el aislamiento de miocitos auriculares murinos adultos de alta calidad. Aquí, describimos un protocolo de aislamiento optimizado basado en la perfusión de Langendorff que proporciona consistentemente un alto rendimiento de miocitos murinos auriculares de alta calidad.

El isoftalato de benzofurano unido a sodio (SBFI) es el indicador fluorescente de Na⁺ más utilizado. El SBFI puede cargarse en el miocito cardíaco en su forma de sal a través de una pipeta de vidrio o como un éster de acetoximetilo (AM) que puede penetrar en la membrana sarcolemal del miocito. Intracelularmente, SBFI-AM es desesterificado por esterasas citosólicas. Debido a las variabilidades en la penetración de la membrana y la desesterificación citosólica, cada célula debe calibrarse in situ. Por lo general, las mediciones de [Na⁺]_i mediante epifluorescencia de células enteras SBFI se realizan utilizando un tubo fotomultiplicador (PMT). Esta configuración experimental permite medir solo una célula a la vez. Debido a la longitud de la carga de colorante de los miocitos y a la calibración después de cada experimento, el rendimiento de los datos es bajo. Por lo tanto, desarrollamos una técnica basada en cámaras EMCCD para medir [Na⁺]_i. Este enfoque permite mediciones simultáneas de [Na⁺]_i en múltiples miocitos, lo que aumenta significativamente el rendimiento experimental.

Introducción

En las enfermedades auriculares (p. ej., fibrilación auricular [FA]) la señalización intracelular de Ca²⁺ está profundamente alterada¹. Si bien muchos de los mecanismos subyacentes de la señalización intracelular "remodelada" de Ca²⁺ en la FA han sido bien caracterizados ^2,3, el papel que puede desempeñar una concentración intracelular de sodio alterada ([Na⁺]_i) es poco conocido. [Na⁺]_i es un importante regulador del Ca²⁺ intracelular. El estudio de [Na⁺]_i puede proporcionar información sobre la activación del intercambiador sarcolemal de Na⁺/Ca²⁺ (NCX), el comportamiento de los canales de Na⁺ y Na⁺,K⁺-ATPasa (NKA)⁴. Hemos demostrado previamente que las altas tasas de activación auricular, como ocurre durante la FA, conducen a una reducción significativa de [Na⁺]_i ¹. Trabajos previos han demostrado un aumento en la densidad de corriente NCX (I,_NCX) y en los niveles de expresión de proteínas en AF³. También se reportó un aumento en el componente tardío de la corriente de Na⁺ dependiente de voltaje (I_{Na, tardío}) en miocitos auriculares aislados de pacientes con FA⁵. Por lo tanto, hay evidencia de cambios profundos en la homeostasis intracelular de Na⁺ en la FA. Por lo tanto, se necesitan mediciones fiables y reproducibles de [Na⁺]_i en miocitos auriculares aislados para mejorar nuestra comprensión de la patología de la FA. Aquí, demostramos cómo aislar de manera reproducible miocitos auriculares murinos de alta calidad que son adecuados para mediciones de [Na⁺]_i. Hemos centrado nuestro protocolo optimizado de aislamiento de células auriculares en miocitos auriculares murinos porque los modelos de ratón transgénicos (TG) de fibrilación auricular se han convertido en una parte vital de la investigación de la FA⁶. Estos ratones a menudo solo están disponibles en cantidades limitadas y las aurículas a menudo son fibróticas, lo que dificulta el aislamiento celular.

En general, el [Na⁺]_i en células viables puede medirse con indicadores fluorescentes ^7,8, o con diferentes tipos de microelectrodos⁹. Las técnicas basadas en microelectrodos requieren la penetración de la membrana sarcolema. Por lo tanto, esta técnica se limita a las células más grandes y no es adecuada para los miocitos auriculares pequeños y estrechos, cuya integridad celular se ve fácilmente comprometida.

El isoftalato de benzofurano unido a sodio (SBFI) es un indicador fluorescente, que sufre un gran cambio de longitud de onda al unirse a Na^{+ 7}. El SBFI se excita alternativamente a 340 nm y 380 nm y la fluorescencia emitida se recoge después de pasar por un filtro de emisión (510 nm). Las relaciones de las señales en las dos longitudes de onda de excitación (F_340/380) pueden cancelar la longitud de la ruta local, la concentración de colorante y las variaciones independientes de la longitud de onda en la intensidad de la iluminación y la eficiencia de detección. Cuando se realiza una calibración in situ utilizando soluciones con concentración de sodio conocida ([Na⁺]) en cada celda, la relación F_340/380 obtenida durante el experimento produce mediciones precisas y sensibles de [Na⁺]_i. Como todos los indicadores de Na⁺ , SBFI también muestra cierta afinidad por K⁺_. El uso del método de calibración que se muestra aquí permite "sujetar" de manera confiable [Na⁺]_i y la concentración de potasio intracelular ([K⁺]_i) durante el proceso de calibración, de modo que [Na⁺]_i se puede calibrar de manera confiable incluso cuando es <10% de [K⁺]_i ¹⁰.

Presentamos una nueva técnica basada en cámaras EMCCD para mediciones radiométricas de [Na⁺]_i utilizando SBFI. La cámara EMCCD permite, por primera vez, mediciones simultáneas de [Na⁺]_i (y calibración) en múltiples celdas. Esto es especialmente beneficioso en un entorno experimental donde el número de animales es limitado (por ejemplo, modelos de ratones transgénicos). Típicamente, las mediciones de [Na⁺]_i usando SBFI se realizan usando un tubo fotomultiplicador (PMT) para recolectar epifluorescencia de célula completa ^1,11. Si bien las PMT ofrecen una muy buena resolución temporal de la señal de fluorescencia, la resolución espacial es muy baja y los experimentos se limitan a una célula a la vez.

Nuestro novedoso protocolo facilita mediciones altamente reproducibles y sensibles de [Na⁺]_i. Está optimizado para la adquisición simultánea de cambios en [Na⁺]_i en múltiples miocitos auriculares murinos, pero es adaptable a muchos otros tipos de células.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Maryland, Baltimore.

1. Aislamiento de miocitos auriculares de corazones murinos adultos

1. Coloque cada ratón en un vaporizador de precisión y una cámara de inducción gaseada con isoflurano en oxígeno al 100%.
2. Ajustar el flujo de isoflurano al 1% hasta que el animal deje de responder antes de administrar una inyección intraperitoneal (IP) de heparina (1-1,25 U/g) 15 minutos antes de la eutanasia.
3. Anestesiar profundamente al ratón aumentando la anestesia de isoflurano al 5% y confirmar el plano profundo de la anestesia mediante el pellizco del pie.
4. Realizar la eutanasia mediante la realización de una toracotomía rápida¹²; Use pinzas de patrón estándar y tijeras quirúrgicas para abrir el tórax. Movilizar pasivamente el corazón y el pulmón, aislar el arco aórtico, sujetar con fórceps y cortar la aorta para extraer el corazón.
5. Coloque el corazón en un tampón de aislamiento de células libres de Ca²⁺ nominalmente frío como hielo (CIB, Tabla 1).
6. Cánula de la aorta con una cánula de 22 G y atada con una sutura de seda bajo un microscopio óptico con aumento de 3x en solución CIB (Figura 1A,B).
7. Confirmar que la cánula está muy por encima de los senos aórticos administrando solución CIB a través de la cánula conectada a una jeringa y confirmar la perfusión de la arteria coronaria bajo el microscopio.
   NOTA: Este paso es importante para asegurar una correcta perfusión del tejido auricular porque se ha demostrado que la anatomía de la arteria coronaria es muy variable en ratones¹³.
8. Monte el corazón en una configuración de Langendorff basada en la gravedad y perfunde con la solución CIB libre de Ca²⁺ durante 5 min a 37 °C para lavar la sangre restante hasta que el eluido esté claro (Figura 1C).
9. Cambiar a solución enzimática (Tabla 2) y perfundir durante 3-5 min a 37 °C hasta que el tejido auricular esté blando y flácido.
10. Extirpar la aurícula derecha e izquierda con pinzas de superagarre y tijeras de resorte pequeñas y transferirla a una pequeña placa de cultivo que contenga solución enzimática CIB utilizada en el paso 1.8 pero con 0,15 mM de CaCl₂ y colocarla en una incubadora a 37 °C durante 5-8 min (Figura 1D).
11. Transfiera las aurículas a una placa de cultivo celular que contenga 4 mL de solución de almacenamiento precalentada (37 °C) (solución de Tyrode modificada (Tabla 3) que contenga 15 mM de albúmina sérica bovina y 30 mM de monóxido de 2,3-butanediona).
12. Corta las aurículas en pequeñas tiras de tejido (de 10 a 20, dependiendo del tamaño de la auricular) con unas tijeras de resorte pequeñas y unas pinzas de súper agarre.
13. Para la disociación mecánica, aspire suavemente la suspensión de tejido con diferentes pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego con aberturas de entre 2 y 5 mm. Comience con la punta de pipeta más grande y pase a la punta de pipeta más pequeña, aspirando de 5 a 10 veces por pipeta.
14. Cuele la suspensión celular a través de un filtro de 200 μm y agregue CaCl₂ tres veces cada 10 min para lograr una concentración final de 0,3 mM.

2. Evaluación de la calidad celular

1. Coloque 200 μL de la suspensión celular que contiene los miocitos auriculares recién aislados en un cubreobjetos de vidrio.
2. Utilice un objetivo 10x para contar todas las celdas en el campo de visión y clasificarlas como redondeadas o en forma de varilla. Determine cuántas de las células en forma de bastón muestran una clara estría cruzada (cambie a un objetivo de 25x si esto es difícil de determinar, consulte la Figura 2C).
3. Repita los pasos 2.1 y 2.2.
4. Calcule los porcentajes de celdas redondeadas, en forma de varilla y en forma de varilla con estrías cruzadas claras.
5. Modificar el procedimiento de aislamiento celular hasta que el 80% de las células tengan forma de bastón con estrías cruzadas claras.
6. Coloque 500 μL de la suspensión de células auriculares en un cubreobjetos de vidrio recubierto de laminina y coloque la cámara celular en el microscopio invertido. Deje que las células se asienten durante 5 minutos. Perfunde con la solución de Tyrode que contiene 1,8 mM de Ca²⁺.
7. Utilice un sistema estimulador de células para iniciar la estimulación del campo eléctrico (pulso bipolar de 2 ms, 30 V) a 0,5 Hz y cuente el número de células que se contraen en el campo de visión de un objetivo de 10x.
8. Repita con estimulación de campo externo a 3 Hz.
9. Calcule el porcentaje de células que responden a las tasas de estimulación de 0,5 y 3 Hz (ver Figura 2B). Perfeccionar el protocolo de aislamiento celular hasta que el 50% de las células respondan a la estimulación de campo de 3 Hz.

3. Carga del indicador de Na⁺ de miocitos auriculares murinos recién aislados

1. Utilice el éster de acetoximetilo (AM) del indicador fluorescente isoftalato de benzofurano de unión a sodio (SBFI-AM).
2. Para facilitar la dispersión del colorante y lograr una carga celular homogénea, disuelva SBFI en dimetilsulfóxido (DMSO) y polioles tensioactivos adecuados (por ejemplo, plurónico) para lograr una concentración final de 10 μM de SBFI en la suspensión celular.
3. Cargue las celdas con SBFI durante 60 minutos protegidas de la luz en un balancín a temperatura ambiente.
4. Deje que las células se asienten durante 30 minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en solución de almacenamiento (1-2 mL).
   NOTA: Los experimentos deben realizarse dentro de las 4 horas posteriores al aislamiento celular. El BDM se lava por perfusión con la solución de Tyrode antes del inicio de los experimentos¹⁴.

4. Instrumentación, mediciones de [Na⁺]_i y calibración de [Na⁺]_i

NOTA: La Figura 3 muestra el esquema de la trayectoria de la luz para la instrumentación experimental.

1. Prepare soluciones de calibración con concentraciones crecientes de Na⁺ como se describe en las Tablas 4-6.
2. Añadir el agente permeabilizante gramicidina D (10 μM; de una solución madre almacenada a -20 °C) y el inhibidor de la ATPasa Na⁺, K⁺ estrofantidina (100 μM, de una solución madre almacenada a -20 °C) a cada solución de calibración. Pozo de vórtice, o use un sonicador para asegurarse de que la gramicidina y la estrofantidina se disuelven por completo.
3. Llene un sistema de perfusión de varios barriles con las soluciones de calibración que contienen el aumento de [Na⁺]_o preparadas en los pasos 4.1 y 4.2. Conéctese a una cámara celular utilizando velocidades de perfusión lentas (~ 1 mL/min; las tasas de perfusión pueden variar con el volumen de la cámara celular).
4. Conecte la succión a la cámara de la celda y recoja la perfusión en un recipiente (de vidrio) apropiado en el suelo.
5. Detener la perfusión y la succión.
6. Después de permitir 30 minutos de desesterificación de SBFI, coloque 100 μL de la suspensión celular concentrada (paso 3.5) cargada de colorante en un deslizamiento de cubierta de vidrio recubierto de laminina por encima del campo de visión del objetivo 40x del microscopio invertido.
7. Utilice una lámpara de conmutación rápida con una fuente de luz de xenón de 300 W. Logre imágenes de campo amplio con dos longitudes de onda de excitación (340 nm y 380 nm) utilizando espejos de escaneo de conmutación rápida y filtros de excitación de ancho de banda estrecho (340 nm ± 10 nm; 380 nm ± 10 nm).
8. Optimice el campo de visión de la cámara EMCCD. Un área de observación más grande requiere tiempos de fotograma más largos. Los tiempos de fotograma más largos conducen a un mayor blanqueo del indicador. Por lo tanto, equilibre el tamaño del campo de visión y el tiempo de fotograma para que no se produzca un blanqueamiento notable de la sonda.
9. Determine que solo hay una fluorescencia intrínseca mínima en un subconjunto de células auriculares que no están cargadas con SBFI asegurándose de que la fluorescencia intrínseca de las células sea similar a la fluorescencia de fondo (como se muestra en la Figura 4).
10. Determine la frecuencia de muestreo apropiada en función del diseño experimental (las tasas de muestreo pueden ser bajas porque los cambios en [Na⁺]_i son relativamente lentos (por ejemplo, un punto de datos adquirido cada 10-20 s).
11. Atenúe la luz de excitación mediante el uso de filtros de densidad neutra (ND) apropiados y reduciendo adecuadamente la intensidad de la fuente de luz (por ejemplo, alterando la intensidad en el software operativo).
12. Recoja la luz de emisión a 510 ± 40 nm utilizando filtros apropiados con una cámara EMCCD conectada al microscopio invertido.
13. Defina una región de interés (ROI) para cada celda y un ROI de fondo (consulte la figura 4). Reste el fondo de las señales F₃₄₀ y F₃₈₀ grabadas (ya sea en línea o durante el análisis de datos).
14. Inicie la adquisición de datos.
15. Reinicie la perfusión y la succión. Perfundir durante 10-15 minutos con la solución de Tyrode que contiene 1,8 mM de Ca²⁺ y registrar una línea de base estable de F_340/380 antes de comenzar el experimento.
    NOTA: Asegúrese de registrar una línea de base estable durante 10 a 15 minutos. Si se produce un blanqueo (por ejemplo, reducción de la línea de base F_340/380 ), el objetivo es atenuar aún más la intensidad de la iluminación, ya sea aumentando la densidad del filtro ND, disminuyendo la intensidad de la señal de luz de excitación y/o el tiempo de fotograma de adquisición (consulte los pasos 4.10-4.11).
16. Inicie la medición de [Na⁺]_i de acuerdo con la pregunta de investigación.

5. Calibración [Na⁺]_i

1. Una vez concluido el experimento (paso 4.16), realice una calibración de la señal F_340/380 in situ en cada celda.
2. Calibrar la señal F_340/380 perfundiendo los miocitos cargados con SBFI con las soluciones de calibración (preparadas en los pasos 4.1-4.3).
3. Perfundir paso a paso para elevar [Na⁺]_o de 0 a 20 mM. Espere la señal estable F_340/380 antes de pasar a la siguiente concentración (~5 min dependiendo del caudal; consulte la Figura 3B y la Figura 5A).
   NOTA: La relación entre la señal F_340/380 y el [Na⁺] de las soluciones de calibración debe ser lineal para una calibración válida de la señal F_340/380 (Figura 5 y Figura 6).

Resultados

Evaluación de la calidad de las células auriculares
Los miocitos auriculares recién aislados se evaluaron en función de la morfología celular y la capacidad de respuesta a la estimulación del campo, como se describe en el protocolo, en seis aislamientos consecutivos de células auriculares. Los datos mostrados en la Figura 2 muestran un porcentaje muy alto de miocitos auriculares en forma de bastonci...

Discusión

Aquí presentamos una nueva técnica basada en cámara EMCCD para la medición cuantitativa simultánea de [Na⁺]_i en múltiples miocitos auriculares viables utilizando isoftalato de benzofurano unido a sodio (SBFI). El enfoque descrito aquí es el primero que permite la medición simultánea de [Na⁺]_i en varias células. Las principales ventajas que presenta este nuevo protocolo son (i) el aumento significativo del rendimiento experimental y (i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm