Medições baseadas em câmera de [Na+] intracelular em miócitos atriais murinos

Resumo

A concentração intracelular ^{de Na+} ([Na⁺]_i) nos miócitos cardíacos é alterada durante as doenças cardíacas. [Na⁺]_i é um importante regulador do Ca²⁺ intracelular. Introduzimos uma nova abordagem para medir [Na⁺]_i em miócitos atriais murinos recém-isolados usando uma câmera de dispositivo acoplado carregado multiplicador de elétrons (EMCCD) e um iluminador rápido e controlável.

Resumo

A concentração intracelular de sódio ([Na⁺]_i) é um importante regulador do Ca²⁺ intracelular. Seu estudo fornece informações sobre a ativação do trocador sarcolemal Na⁺/Ca²⁺ , o comportamento dos canais de Na⁺ dependentes de voltagem e a Na⁺,K⁺-ATPase. A sinalização intracelular de Ca²⁺ está alterada em doenças atriais, como a fibrilação atrial. Embora muitos dos mecanismos subjacentes à homeostase intracelular alterada do Ca²⁺ sejam caracterizados, o papel do [Na⁺]_i e sua desregulação nas patologias atriais são pouco compreendidos. [Na⁺]_i em miócitos atriais aumenta em resposta ao aumento das taxas de estimulação. A capacidade de resposta à estimulação do campo externo é, portanto, crucial para medições de [Na⁺]_i nessas células. Além disso, a longa preparação (carregamento de corante) e a duração do experimento (calibração) requerem um protocolo de isolamento que produza miócitos atriais de qualidade excepcional. Devido ao pequeno tamanho dos átrios de camundongos e à composição da matriz intercelular, o isolamento de miócitos atriais murinos adultos de alta qualidade é difícil. Aqui, descrevemos um protocolo de isolamento otimizado baseado em perfusão de Langendorff que fornece consistentemente um alto rendimento de miócitos murinos atriais de alta qualidade.

O isoftalato de benzofurano de ligação ao sódio (SBFI) é o indicador fluorescente de Na⁺ mais comumente usado. O SBFI pode ser carregado no miócito cardíaco em sua forma de sal por meio de uma pipeta de vidro ou como um éster de acetoximetil (AM) que pode penetrar na membrana sarcolemal do miócito. Intracelularmente, SBFI-AM é desesterificado por esterases citosólicas. Devido às variabilidades na penetração da membrana e na desesterificação citosólica, cada célula deve ser calibrada in situ. Normalmente, as medições de [Na⁺]_i usando epifluorescência de células inteiras SBFI são realizadas usando um tubo fotomultiplicador (PMT). Essa configuração experimental permite que apenas uma célula seja medida por vez. Devido ao comprimento da carga do corante dos miócitos e à calibração após cada experimento, o rendimento dos dados é baixo. Portanto, desenvolvemos uma técnica baseada em câmera EMCCD para medir [Na⁺]_i. Essa abordagem permite medições simultâneas de [Na⁺]_i em múltiplos miócitos, aumentando significativamente o rendimento experimental.

Introdução

Nas doenças atriais (por exemplo, fibrilação atrial [FA]), a sinalização intracelular de Ca²⁺ é profundamente alterada¹. Embora muitos dos mecanismos subjacentes da sinalização intracelular de Ca²⁺ 'remodelada' na FA tenham sido bem caracterizados ^2,3, o papel que uma concentração alterada de sódio intracelular ([Na⁺]_i) pode desempenhar é pouco compreendido. [Na⁺]_i é um importante regulador do Ca²⁺ intracelular. O estudo de [Na⁺]_i pode fornecer informações sobre a ativação do trocador sarcolemal de Na⁺/Ca²⁺ (NCX), o comportamento dos canais de Na⁺ e da Na⁺,K⁺-ATPase (NKA)⁴. Mostramos anteriormente que altas taxas de ativação atrial, como ocorrem durante a FA, levam a uma redução significativa de [Na⁺]_i ¹. Trabalhos anteriores mostraram um aumento na densidade de corrente NCX (I_NCX) e nos níveis de expressão de proteínas em AF³. Um aumento no componente tardio da corrente de Na⁺ dependente de voltagem (I_{Na, tardia}) em miócitos atriais isolados de pacientes com FA também foi relatado⁵. Assim, há evidências de profundas alterações na homeostase intracelular de Na⁺ na FA. Medições confiáveis e reprodutíveis de [Na⁺]_i em miócitos atriais isolados são, portanto, necessárias para aprofundar nossa compreensão da patologia da FA. Aqui, demonstramos como isolar de forma reprodutível miócitos atriais murinos de alta qualidade que são adequados para medições de [Na⁺]_i. Concentramos nosso protocolo otimizado de isolamento de células atriais em miócitos atriais murinos porque os modelos de camundongos transgênicos (TG) de fibrilação atrial se tornaram uma parte vital da pesquisa de FA⁶. Esses camundongos geralmente estão disponíveis apenas em números limitados e os átrios costumam ser fibróticos, levando a desafios para o isolamento celular.

Em geral, [Na⁺]_i em células viáveis pode ser medido com indicadores fluorescentes ^7,8 ou com diferentes tipos de microeletrodos⁹. As técnicas baseadas em microeletrodos requerem penetração da membrana sarcolemal. Esta técnica é, portanto, limitada a células maiores e não é adequada para miócitos atriais pequenos e estreitos cuja integridade celular é facilmente comprometida.

O isoftalato de benzofurano de ligação ao sódio (SBFI) é um indicador fluorescente, que sofre uma grande mudança de comprimento de onda ao se ligar ao Na^{+ 7}. O SBFI é excitado alternadamente a 340 nm e 380 nm e a fluorescência emitida é coletada após passar por um filtro de emissão (510 nm). As proporções de sinais nos dois comprimentos de onda de excitação (F_340/380) podem cancelar o comprimento do caminho local, a concentração do corante e as variações independentes do comprimento de onda na intensidade da iluminação e na eficiência da detecção. Quando uma calibração in situ usando soluções com concentração de sódio conhecida ([Na⁺]) é realizada em cada célula, a razão F_340/380 obtida durante o experimento produz medições precisas e sensíveis de [Na⁺]_i. Como todos os indicadores Na⁺ , o SBFI também exibe alguma afinidade com K⁺_. O uso do método de calibração mostrado aqui permite 'fixar' de forma confiável a concentração de [Na⁺]_i e potássio intracelular ([K⁺]_i) durante o processo de calibração, de modo que [Na⁺]_i possa ser calibrado de forma confiável mesmo quando estiver <10% de [K⁺]_i ¹⁰.

Apresentamos uma nova técnica baseada em câmera EMCCD para medições raciométricas de [Na⁺]_i usando SBFI. A câmera EMCCD permite, pela primeira vez, medições simultâneas de [Na⁺]_i (e calibração) em várias células. Isso é especialmente benéfico em um ambiente experimental onde o número de animais é limitado (por exemplo, modelos de camundongos transgênicos). Tipicamente, as medidas de [Na⁺]_i usando SBFI são realizadas usando um tubo fotomultiplicador (PMT) para coletar epifluorescência de células inteiras ^1,11. Embora os PMTs ofereçam uma resolução temporal muito boa do sinal de fluorescência, a resolução espacial é muito baixa e os experimentos são limitados a uma célula por vez.

Nosso novo protocolo facilita medições altamente reprodutíveis e sensíveis de [Na⁺]_i. É otimizado para a aquisição simultânea de alterações em [Na⁺]_i em múltiplos miócitos atriais murinos, mas é adaptável a muitos outros tipos de células.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Maryland, Baltimore.

1. Isolamento de miócitos atriais de corações murinos adultos

1. Coloque cada camundongo em um vaporizador de precisão e câmara de indução gaseada com isoflurano em 100% de oxigênio.
2. Defina o fluxo de isoflurano para 1% até que o animal não responda antes de administrar uma injeção intraperitoneal (IP) de heparina (1–1,25 U/g) 15 minutos antes da eutanásia.
3. Anestesie profundamente o camundongo aumentando a anestesia com isoflurano para 5% e confirme o plano profundo da anestesia beliscando o pé.
4. Realizar a eutanásia realizando uma toracotomia rápida¹²; Use uma pinça de padrão padrão e uma tesoura cirúrgica para abrir o tórax. Mobilize passivamente o coração e o pulmão, isole o arco aórtico, segure com uma pinça e corte a aorta para remover o coração.
5. Coloque o coração em tampão de isolamento de células livres de Ca²⁺ nominalmente gelado (CIB, Tabela 1).
6. Canular a aorta com cânula de 22 G e amarrar com fio de seda ao microscópio óptico com aumento de 3x em solução CIB (Figura 1A,B).
7. Confirme se a cânula está bem acima dos seios aórticos, administrando a solução CIB através da cânula conectada a uma seringa e confirme a perfusão da artéria coronária ao microscópio.
   NOTA: Esta etapa é importante para garantir a perfusão adequada do tecido atrial, pois foi demonstrado que a anatomia da artéria coronária é altamente variável em camundongos¹³.
8. Monte o coração em uma configuração de Langendorff baseada em gravidade e perfunda com a solução CIB livre de Ca²⁺ por 5 min a 37 ° C para lavar o sangue restante até que o eluído esteja claro ( Figura 1C ).
9. Mude para solução enzimática (Tabela 2) e perfunda por 3–5 min a 37 °C até que o tecido atrial esteja macio e flácido.
10. Extirpar o átrio direito e esquerdo com pinças super-grip e tesouras de mola pequenas e transferir para uma pequena placa de cultura contendo a solução enzimática CIB utilizada no passo 1.8, mas com 0,15 mM de CaCl₂ e colocar numa incubadora a 37 °C durante 5–8 min (Figura 1D).
11. Transferir os átrios para uma placa de cultura de células contendo 4 ml de solução de armazenamento pré-aquecida (37 °C) (solução de Tyrode modificada (quadro 3) contendo 15 mM de albumina de soro bovino e 30 mM de 2,3-butanodiona monóxima).
12. Corte os átrios em pequenas tiras de tecido (10–20, dependendo do tamanho do átrio) usando uma pequena tesoura de mola e uma pinça super-grip.
13. Para dissociação mecânica, aspirar suavemente a suspensão de tecido usando diferentes pipetas Pasteur de vidro polido a fogo com aberturas entre 2 e 5 mm. Comece com a ponta de pipeta maior e passe para a ponta de pipeta menor, aspirando de 5 a 10 vezes por pipeta.
14. Coe a suspensão celular através de um filtro de 200 μm e adicione CaCl₂ três vezes a cada 10 minutos para atingir uma concentração final de 0,3 mM.

2. Avaliação da qualidade celular

1. Colocar 200 μL da suspensão celular que contém os miócitos atriais recém-isolados em uma lamínula de vidro.
2. Use uma objetiva de 10x para contar todas as células no campo de visão e categorizá-las como arredondadas ou em forma de bastonete. Determine quantas das células em forma de bastonete mostram estrias cruzadas claras (mude para a objetiva de 25x se isso for difícil de determinar, consulte a Figura 2C).
3. Repita as etapas 2.1–2.2.
4. Calcule as porcentagens de células arredondadas, em forma de bastonete e em forma de bastonete com estrias cruzadas claras.
5. Modifique o procedimento de isolamento celular até que 80% das células tenham a forma de bastonete com estrias cruzadas claras.
6. Colocar 500 μL da suspensão de células atriais numa lamínula de vidro revestida com laminina e colocar a câmara celular no microscópio invertido. Deixe as células repousarem por 5 min. Perfundir com a solução de Tyrode contendo 1,8 mM de Ca²⁺.
7. Use um sistema estimulador de células para iniciar a estimulação do campo elétrico (pulso bipolar de 2 ms, 30 V) a 0,5 Hz e conte o número de células que se contraem no campo de visão de uma objetiva de 10x.
8. Repita com estimulação de campo externo a 3 Hz.
9. Calcule a porcentagem de células que respondem a taxas de estimulação de 0,5 e 3 Hz (ver Figura 2B). Refine o protocolo de isolamento celular até que 50% das células respondam à estimulação de campo de 3 Hz.

3. Carga do indicador Na⁺ de miócitos atriais murinos recém-isolados

1. Utilizar o éster de acetoximetil (AM) permeável para células do isoftalato de benzofurano de ligação ao sódio indicador fluorescente (SBFI-AM).
2. Para facilitar a dispersão do corante e obter uma carga celular homogênea, dissolver o SBFI em dimetilsulfóxido (DMSO) e polióis surfactantes adequados (por exemplo, plurônicos) para atingir uma concentração final de 10 μM de SBFI na suspensão celular.
3. Carregue as células com SBFI por 60 min protegidas da luz em um balancim à temperatura ambiente.
4. Deixe as células assentarem por 30 min, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet na solução de armazenamento (1–2 mL).
   NOTA: Os experimentos devem ser realizados dentro de 4 h após o isolamento celular. O BDM é lavado por perfusão com a solução de Tyrode antes do início dos experimentos¹⁴.

4. Instrumentação, medições de [Na⁺]_i e calibração de [Na⁺]_i

NOTA: A Figura 3 mostra o esquema do caminho da luz para a instrumentação experimental.

1. Prepare soluções de calibração com concentrações crescentes de Na⁺ , conforme descrito nas Tabelas 4–6.
2. Adicionar o agente permeabilizante gramicidina D (10 μM; a partir de uma solução-mãe conservada a -20 °C) e o inibidor da ATPase Na⁺, K⁺ estropantidina (100 μM, a partir de uma solução-mãe conservada a -20 °C) a cada solução de calibração. Vortex bem ou use um sonicador para garantir que a gramicidina e a estrofantidina sejam completamente dissolvidas.
3. Encher um sistema de perfusão multicil com as soluções de calibração contendo o [Na⁺]_o crescente preparado nos passos 4.1 e 4.2. Conecte-se a uma câmara celular usando taxas de perfusão lentas (~ 1 mL / min; as taxas de perfusão podem variar com o volume da câmara celular).
4. Conecte a sucção à câmara da célula e colete o perfusato em um recipiente apropriado (vidro) no chão.
5. Pare a perfusão e a sucção.
6. Depois de permitir 30 min de desesterificação SBFI, coloque 100 μL da suspensão de células concentrada (etapa 3.5) carregada com corante em uma lamínula de vidro revestida com laminina acima do campo de visão da objetiva de 40x do microscópio invertido.
7. Use um iluminador de comutação rápida com uma fonte de luz de xenônio de 300 W. Obtenha imagens de campo amplo com dois comprimentos de onda de excitação (340 nm e 380 nm) usando espelhos de varredura de comutação rápida e filtros de excitação de largura de banda estreita (340 nm ± 10 nm; 380 nm ± 10 nm).
8. Otimize o campo de visão da câmera EMCCD. Uma área de observação maior requer tempos de quadro mais longos. Tempos de quadro mais longos levam a mais branqueamento do indicador. Assim, equilibre o tamanho do campo de visão e o tempo de quadro para que não ocorra nenhum branqueamento perceptível da sonda.
9. Determine que há apenas fluorescência intrínseca mínima em um subconjunto de células atriais que não são carregadas com SBFI, garantindo que a fluorescência intrínseca das células seja semelhante à fluorescência de fundo (como mostrado na Figura 4).
10. Determinar a taxa de amostragem adequada em função da concepção experimental (as taxas de amostragem podem ser baixas porque as alterações em [Na⁺]_i são relativamente lentas (por exemplo, um ponto de dados adquirido a cada 10-20 s).
11. Atenue a luz de excitação usando filtros de densidade neutra (ND) apropriados e reduzindo adequadamente a intensidade da fonte de luz (por exemplo, alterando a intensidade no software operacional).
12. Recolher a luz de emissão a 510 ± 40 nm, utilizando filtros adequados, com uma câmara EMCCD ligada ao microscópio invertido.
13. Defina uma região de interesse (ROI) para cada célula e um ROI de fundo (consulte a Figura 4). Subtraia o fundo dos sinais F₃₄₀ e F₃₈₀ gravados (online ou durante a análise de dados).
14. Inicie a aquisição de dados.
15. Reinicie a perfusão e a sucção. Perfunda por 10–15 min com a solução de Tyrode contendo 1,8 mM de Ca²⁺ e registre uma linha de base F_340/380 estável antes de iniciar o experimento.
    NOTA: Certifique-se de registrar uma linha de base estável por 10 a 15 minutos. Se ocorrer branqueamento (por exemplo, redução da linha de base F_340/380 ), procure atenuar ainda mais a intensidade da iluminação aumentando a densidade do filtro ND, diminuindo a intensidade do sinal de luz de excitação e/ou o tempo de quadro de aquisição (consulte as etapas 4.10–4.11).
16. Inicie a medição de [Na⁺]_i de acordo com a questão de pesquisa.

5. Calibração [Na⁺]_i

1. Após a conclusão do experimento (etapa 4.16), execute uma calibração do sinal F_340/380 em cada célula in situ.
2. Calibre o sinal F_340/380 perfundindo os miócitos carregados com SBFI com as soluções de calibração (preparadas nas etapas 4.1 a 4.3).
3. Perfunda passo a passo para elevar [Na⁺]_o de 0 a 20 mM. Aguarde o sinal estável F_340/380 antes de passar para a próxima concentração (~ 5 min dependendo da vazão; consulte a Figura 3B e a Figura 5A).
   NOTA: A relação entre o sinal F_340/380 e o [Na⁺] das soluções de calibração precisa ser linear para uma calibração válida do sinal F_340/380 (Figura 5 e Figura 6).

Resultados

Avaliação da qualidade das células atriais
Os miócitos atriais recém-isolados foram avaliados com base na morfologia celular e na capacidade de resposta à estimulação de campo, conforme descrito no protocolo, em seis isolamentos consecutivos de células atriais. Os dados mostrados na Figura 2 mostram uma porcentagem muito alta de miócitos atriais em forma de bastonete que retêm estrias cruzadas c...

Discussão

Aqui, apresentamos uma nova técnica baseada em câmera EMCCD para a medição quantitativa simultânea de [Na⁺]_i em múltiplos miócitos atriais viáveis usando isoftalato de benzofurano de ligação ao sódio (SBFI). A abordagem descrita aqui é a primeira a permitir a medição simultânea de [Na⁺]_i em várias células. As principais vantagens que este novo protocolo apresenta são (i) o aumento significativo no rendimento experimental e (ii...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm