Mesures par caméra de [Na+] intracellulaire dans des myocytes auriculaires murins

Résumé

La concentration intracellulaire de Na⁺ ([Na⁺]_i) dans les myocytes cardiaques est altérée au cours des maladies cardiaques. [Na⁺]_i est un régulateur important du Ca²⁺ intracellulaire. Nous introduisons une nouvelle approche pour mesurer [Na⁺]_i dans des myocytes auriculaires murins fraîchement isolés à l’aide d’une caméra EMCCD (Electroplying Pliplying Charge Coupled Device) et d’un illuminateur rapide et contrôlable.

Résumé

La concentration intracellulaire de sodium ([Na⁺]_i) est un régulateur important du Ca²⁺ intracellulaire. Son étude donne un aperçu de l’activation de l’échangeur sarcolemmal Na⁺/Ca²⁺ , du comportement des canaux Na⁺ voltage-dépendants et de la Na⁺,K⁺-ATPase. La signalisation intracellulaire Ca²⁺ est altérée dans les maladies auriculaires telles que la fibrillation auriculaire. Alors que de nombreux mécanismes sous-jacents à l’homéostasie intracellulaire altérée du Ca²⁺ sont caractérisés, le rôle du [Na⁺]_i et de sa dérégulation dans les pathologies auriculaires est mal compris. [Na⁺]_I dans les myocytes auriculaires augmente en réponse à l’augmentation des taux de stimulation. La réactivité à la stimulation du champ externe est donc cruciale pour les mesures de [Na⁺]_i dans ces cellules. De plus, la longue préparation (chargement du colorant) et la durée de l’expérience (étalonnage) nécessitent un protocole d’isolement qui permet d’obtenir des myocytes auriculaires d’une qualité exceptionnelle. En raison de la petite taille des oreillettes de souris et de la composition de la matrice intercellulaire, l’isolement de myocytes auriculaires murins adultes de haute qualité est difficile. Ici, nous décrivons un protocole d’isolement optimisé basé sur la perfusion de Langendorff qui fournit constamment un rendement élevé de myocytes murins auriculaires de haute qualité.

L’isophtalate de benzofurane se liant au sodium (SBFI) est l’indicateur fluorescent Na⁺ le plus couramment utilisé. Le SBFI peut être chargé dans le myocyte cardiaque, soit sous sa forme saline, à l’aide d’une pipette en verre, soit sous forme d’ester acétoxyméthylique (AM) qui peut pénétrer dans la membrane sarcolemmale du myocyte. Intracellulairement, le SBFI-AM est désestérifié par des estérases cytosoliques. En raison des variabilités de pénétration membranaire et de désestérification cytosolique, chaque cellule doit être calibrée in situ. En règle générale, les mesures de [Na⁺]_i à l’aide de l’épifluorescence de cellules entières SBFI sont effectuées à l’aide d’un tube photomultiplicateur (PMT). Ce dispositif expérimental permet de ne mesurer qu’une seule cellule à la fois. En raison de la longueur de chargement du colorant des myocytes et de l’étalonnage après chaque expérience, le rendement des données est faible. Nous avons donc développé une technique basée sur une caméra EMCCD pour mesurer le [Na⁺]_i. Cette approche permet des mesures simultanées de [Na⁺]_i dans plusieurs myocytes, augmentant ainsi considérablement le rendement expérimental.

Introduction

Dans les maladies auriculaires (par exemple, la fibrillation auriculaire [FA]), la signalisation intracellulaire Ca²⁺ est profondément altérée¹. Bien que de nombreux mécanismes sous-jacents de la signalisation intracellulaire Ca²⁺ « remodelée » dans la FA aient été bien caractérisés ^2,3, le rôle qu’une concentration intracellulaire modifiée de sodium ([Na⁺]_i peut jouer est mal compris. [Na⁺]_i est un régulateur important du Ca²⁺ intracellulaire. L’étude de [Na⁺]_i peut fournir des informations sur l’activation de l’échangeur sarcolemmal Na⁺/Ca²⁺ (NCX), le comportement des canaux Na⁺ et de la Na⁺,K⁺-ATPase (NKA)⁴. Nous avons précédemment montré que des taux d’activation auriculaire élevés, comme c’est le cas lors de la FA, entraînent une réduction significative de [Na⁺]_i ¹. Des travaux antérieurs ont montré une augmentation de la densité de courant NCX (I_NCX) et des niveaux d’expression des protéines dans AF³. Une augmentation de la composante tardive du courant Na⁺ voltage-dépendant (I_{Na, tardif}) dans les myocytes auriculaires isolés de patients atteints de FA a également été^{signalée 5}. Ainsi, il existe des preuves de changements profonds dans l’homéostasie intracellulaire Na⁺ dans la FA. Des mesures fiables et reproductibles de [Na⁺]_i dans des myocytes auriculaires isolés sont donc nécessaires pour approfondir notre compréhension de la pathologie de la FA. Ici, nous montrons comment isoler de manière reproductible des myocytes auriculaires murins de haute qualité qui conviennent aux mesures de [Na⁺]_i. Nous avons concentré notre protocole optimisé d’isolement de cellules auriculaires sur des myocytes auriculaires murins, car les modèles murins transgéniques (TG) de fibrillation auriculaire sont devenus un élément essentiel de la recherche sur la FA⁶. Ces souris ne sont souvent disponibles qu’en nombre limité et les oreillettes sont souvent fibreuses, ce qui pose des problèmes d’isolement cellulaire.

En général, le [Na⁺]_i dans les cellules viables peut être mesuré à l’aide d’indicateurs fluorescents ^7,8, ou à l’aide de différents types de microélectrodes⁹. Les techniques à base de microélectrodes nécessitent la pénétration de la membrane sarcolemmale. Cette technique est donc limitée aux cellules plus grandes et ne convient pas aux myocytes auriculaires petits et étroits dont l’intégrité cellulaire est facilement compromise.

L’isophtalate de benzofurane se liant au sodium (SBFI) est un indicateur fluorescent qui subit un grand décalage de longueur d’onde lors de la liaison au Na^{+ 7}. Le SBFI est excité alternativement à 340 nm et 380 nm et la fluorescence émise est collectée après avoir traversé un filtre d’émission (510 nm). Les rapports des signaux aux deux longueurs d’onde d’excitation (F_340/380) peuvent annuler la longueur du trajet local, la concentration du colorant et les variations indépendantes de la longueur d’onde de l’intensité de l’éclairage et de l’efficacité de détection. Lorsqu’un étalonnage in situ à l’aide de solutions dont la concentration en sodium ([Na⁺]) est connue dans chaque cellule, le rapport F_340/380 obtenu au cours de l’expérience permet d’obtenir des mesures précises et sensibles de [Na⁺]_i. Comme tous les indicateurs Na⁺ , SBFI affiche également une certaine affinité pour K⁺_. L’utilisation de la méthode d’étalonnage présentée ici permet de « fixer » de manière fiable la concentration de [Na⁺]_i et de potassium intracellulaire ([K⁺]_i) pendant le processus d’étalonnage, de sorte que [Na⁺]_i peut être étalonné de manière fiable même lorsqu’il est <10 % de [K⁺]_i ¹⁰.

Nous introduisons une nouvelle technique basée sur une caméra EMCCD pour les mesures ratiométriques de [Na⁺]_i à l’aide de SBFI. La caméra EMCCD permet, pour la première fois, des mesures (et un étalonnage) simultanés de [Na⁺]_i dans plusieurs cellules. Ceci est particulièrement bénéfique dans un cadre expérimental où le nombre d’animaux est limité (par exemple, des modèles de souris transgéniques). En règle générale, les mesures de [Na⁺]_i à l’aide de SBFI sont effectuées à l’aide d’un tube photomultiplicateur (PMT) pour recueillir l’épifluorescence de cellules entières ^1,11. Alors que les PMT offrent une très bonne résolution temporelle du signal de fluorescence, la résolution spatiale est très faible et les expériences sont limitées à une cellule à la fois.

Notre nouveau protocole facilite des mesures hautement reproductibles et sensibles de [Na⁺]_i. Il est optimisé pour l’acquisition simultanée de modifications de [Na⁺]_i dans plusieurs myocytes auriculaires murins, mais est adaptable à de nombreux autres types de cellules.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Maryland, à Baltimore.

1. Isolement des myocytes auriculaires à partir de cœurs murins adultes

1. Placez chaque souris dans un vaporisateur de précision et une chambre d’induction gazée à l’isoflurane dans 100 % d’oxygène.
2. Réglez le débit d’isoflurane à 1 % jusqu’à ce que l’animal ne réponde plus avant d’administrer une injection intrapéritonéale d’héparine (1-1,25 U/g) 15 minutes avant l’euthanasie.
3. Anesthésie en profondeur la souris en augmentant l’anesthésie à l’isoflurane à 5 % et confirme le plan profond de l’anesthésie par pincement du pied.
4. Effectuer l’euthanasie en pratiquant une thoracotomie rapide¹² ; Utilisez des pinces à motif standard et des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le thorax. Mobilisez passivement le cœur et les poumons, isolez l’arc aortique, maintenez avec des pinces et coupez l’aorte pour retirer le cœur.
5. Placez le cœur dans un tampon d’isolement de cellules libres Ca²⁺ froid (CIB, tableau 1).
6. Canuler l’aorte à l’aide d’une canule de 22 G et l’attacher à l’aide d’une suture en soie au microscope optique avec un grossissement de 3x dans une solution de CIB (Figure 1A,B).
7. Confirmez que la canule se trouve bien au-dessus des sinus aortiques en délivrant la solution CIB à travers la canule reliée à une seringue et confirmez la perfusion de l’artère coronaire au microscope.
   REMARQUE : Cette étape est importante pour assurer une bonne perfusion du tissu auriculaire car il a été démontré que l’anatomie de l’artère coronaire est très variable chez la souris¹³.
8. Montez le cœur sur un dispositif de Langendorff par gravité et perfuser avec la solution de CIB sans Ca²⁺ pendant 5 min à 37 °C pour éliminer le sang restant jusqu’à ce que l’éluat soit clair (Figure 1C).
9. Passer à la solution enzymatique (tableau 2) et perfuser pendant 3 à 5 minutes à 37 °C jusqu’à ce que le tissu auriculaire soit mou et flasque.
10. Exciser les oreillettes droite et gauche à l’aide d’une pince à super-préhension et de petits ciseaux à ressort et transférer dans une petite boîte de culture contenant la solution enzymatique CIB utilisée à l’étape 1.8 mais avec 0,15 mM de CaCl₂ et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 à 8 min (figure 1D).
11. Transvaser les oreillettes dans une boîte de culture cellulaire contenant 4 mL de solution de conservation préchauffée (37 °C) (solution de Tyrode modifiée (tableau 3) contenant 15 mM d’albumine sérique bovine et 30 mM de monoxyde de 2,3-butanedione).
12. Coupez les oreillettes en petites bandes de tissu (10 à 20, selon la taille de l’oreillette) à l’aide de petits ciseaux à ressort et d’une pince à super prise.
13. Pour la dissociation mécanique, aspirez doucement la suspension tissulaire à l’aide de différentes pipettes Pasteur en verre poli au feu avec des ouvertures comprises entre 2 et 5 mm. Commencez par la plus grande pointe de pipette et passez à la plus petite pointe de pipette, en aspirant 5 à 10 fois par pipette.
14. Filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de 200 μm et ajoutez du CaCl₂ trois fois toutes les 10 min pour obtenir une concentration finale de 0,3 mM.

2. Évaluation de la qualité des cellules

1. Placez 200 μL de la suspension cellulaire contenant les myocytes auriculaires fraîchement isolés sur une lamelle en verre.
2. Utilisez un objectif 10x pour compter toutes les cellules dans le champ de vision et classez-les comme arrondies ou en forme de bâtonnet. Déterminez combien de cellules en forme de bâtonnet présentent une striation transversale claire (passez à l’objectif 25x si cela est difficile à déterminer, voir Figure 2C).
3. Répétez les étapes 2.1 et 2.2.
4. Calculez les pourcentages de cellules arrondies, en forme de bâtonnet et en forme de bâtonnet avec des cellules de striation transversale claires.
5. Modifiez la procédure d’isolement cellulaire jusqu’à ce que 80 % des cellules soient en forme de bâtonnet avec une striation transversale claire.
6. Placez 500 μL de suspension cellulaire auriculaire sur une lamelle en verre recouverte de laminine et placez la chambre cellulaire sur le microscope inversé. Laissez les cellules se déstabiliser pendant 5 min. Perfuser avec la solution de Tyrode contenant 1,8 mM de Ca²⁺.
7. À l’aide d’un système de stimulation cellulaire, démarrez la stimulation du champ électrique (impulsion bipolaire de 2 ms, 30 V) à 0,5 Hz et comptez le nombre de cellules qui se contractent dans le champ de vision d’un objectif 10x.
8. Répétez l’opération avec une stimulation du champ externe à 3 Hz.
9. Calculez le pourcentage de cellules répondant à des taux de stimulation de 0,5 et 3 Hz (voir Figure 2B). Affinez le protocole d’isolement cellulaire jusqu’à ce que 50 % des cellules répondent à une stimulation de champ de 3 Hz.

3. Charge indicatrice Na⁺ de myocytes auriculaires murins fraîchement isolés

1. Utilisez l’ester acétoxyméthylique (AM) perméable à la cellule de l’indicateur fluorescent de l’isophtalate de benzofurane liant le sodium (SBFI-AM).
2. Pour faciliter la dispersion du colorant et obtenir une charge cellulaire homogène, dissoudre le SBFI dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) et les polyols tensioactifs appropriés (par exemple, pluronique) pour atteindre une concentration finale de 10 μM SBFI dans la suspension cellulaire.
3. Chargez les cellules avec SBFI pendant 60 min à l’abri de la lumière sur une bascule à température ambiante.
4. Laissez les cellules se déstabiliser pendant 30 min, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans une solution de stockage (1 à 2 ml).
   REMARQUE : Les expériences doivent être effectuées dans les 4 heures suivant l’isolement de la cellule. Le BDM est éliminé par perfusion avec la solution de Tyrode avant le début des expériences¹⁴.

4. Instrumentation, mesures de [Na⁺]_i et étalonnage de [Na⁺]_i

REMARQUE : La figure 3 illustre le schéma du trajet de la lumière pour l’instrumentation expérimentale.

1. Préparez des solutions d’étalonnage avec des concentrations croissantes de Na⁺ comme décrit dans les Tableaux 4 à 6.
2. Ajouter l’agent perméabilisant gramicidine D (10 μM ; à partir d’une solution mère conservée à -20 °C) et l’inhibiteur de l’ATPase Na⁺, K⁺ , strophanthidine (100 μM, à partir d’une solution mère conservée à -20 °C) dans chaque solution d’étalonnage. Vortex bien, ou utilisez un sonicateur pour vous assurer que la gramicidine et la strophantidine sont complètement dissoutes.
3. Remplir un système de perfusion à barils multiples avec les solutions d’étalonnage contenant l’augmentation du [Na⁺]_o préparées aux étapes 4.1 et 4.2. Connectez-vous à une chambre cellulaire en utilisant des vitesses de perfusion lentes (~1 mL/min ; les vitesses de perfusion peuvent varier en fonction du volume de la chambre cellulaire).
4. Raccordez l’aspiration à la chambre cellulaire et recueillez le perfusat dans un récipient (en verre) approprié sur le sol.
5. Arrêtez la perfusion et l’aspiration.
6. Après avoir pris en compte 30 min de désestérification SBFI, placez 100 μL de la suspension cellulaire concentrée (étape 3.5) chargée de colorant sur une lamine de recouvrement en verre recouverte de laminine au-dessus du champ de vision de l’objectif 40x du microscope inversé.
7. Utilisez un illuminateur à commutation rapide avec une source lumineuse au xénon de 300 W. Obtenez une imagerie à grand champ avec deux longueurs d’onde d’excitation (340 nm et 380 nm) à l’aide de miroirs de balayage à commutation rapide et de filtres d’excitation à bande passante étroite (340 nm ± 10 nm ; 380 nm ± 10 nm).
8. Optimiser le champ de vision de la caméra EMCCD. Une zone d’observation plus grande nécessite des temps d’image plus longs. Des temps de trame plus longs entraînent plus de blanchiment de l’indicateur. Ainsi, équilibrez la taille du champ de vision et le temps de trame afin qu’aucun blanchiment notable de la sonde ne se produise.
9. Déterminez qu’il n’y a qu’une fluorescence intrinsèque minimale dans un sous-ensemble de cellules auriculaires qui ne sont pas chargées en SBFI en vous assurant que la fluorescence intrinsèque des cellules est similaire à la fluorescence de fond (comme le montre la figure 4).
10. Déterminer la fréquence d’échantillonnage appropriée en fonction du plan d’expérience (les fréquences d’échantillonnage peuvent être faibles car les variations de [Na⁺]_i sont relativement lentes (par exemple, un point de données acquis toutes les 10 à 20 s).
11. Atténuez la lumière d’excitation à l’aide de filtres à densité neutre (ND) appropriés et en réduisant de manière appropriée l’intensité de la source lumineuse (par exemple, en modifiant l’intensité dans le logiciel d’exploitation).
12. Collecter la lumière d’émission à 510 ± 40 nm à l’aide de filtres appropriés avec une caméra EMCCD connectée au microscope inversé.
13. Définissez une zone d’intérêt (ROI) pour chaque cellule et un ROI d’arrière-plan (voir Figure 4). Soustrayez l’arrière-plan des signaux F₃₄₀ et F₃₈₀ enregistrés (en ligne ou pendant l’analyse des données).
14. Lancez l’acquisition des données.
15. Redémarrer la perfusion et l’aspiration. Perfuser pendant 10 à 15 minutes avec la solution de Tyrode contenant 1,8 mM de Ca²⁺ et enregistrer une ligne de base stable de F_340/380 avant de commencer l’expérience.
    REMARQUE : Assurez-vous d’enregistrer une base stable pendant 10 à 15 min. En cas de blanchiment (par exemple, réduction de la valeur de référence F_340/380 ), visez à atténuer davantage l’intensité de l’éclairage en augmentant la densité du filtre ND, en diminuant l’intensité du signal lumineux d’excitation et/ou le temps d’acquisition de l’image (voir étapes 4.10 à 4.11).
16. Démarrez la mesure de [Na⁺]_i en fonction de la question de recherche.

5. Étalonnage [Na⁺]_i

1. Après la conclusion de l’expérience (étape 4.16), effectuez un étalonnage du signal F_340/380 dans chaque cellule in situ.
2. Étalonnez le signal F_340/380 en perfusant les myocytes chargés de SBFI avec les solutions d’étalonnage (préparées aux étapes 4.1 à 4.3).
3. Perfuser par étapes pour élever [Na⁺]_o de 0 à 20 mM. Attendez un signal F_340/380 stable avant de passer à la concentration suivante (~5 min selon le débit ; voir Figure 3B et Figure 5A).
   REMARQUE : La relation entre le signal F_340/380 et le [Na⁺] des solutions d’étalonnage doit être linéaire pour un étalonnage valide du signal F_340/380 (Figure 5 et Figure 6).

Résultats

Évaluation de la qualité des cellules auriculaires
Des myocytes auriculaires fraîchement isolés ont été évalués en fonction de la morphologie cellulaire et de la réponse à la stimulation de terrain, comme indiqué dans le protocole, dans six isolements consécutifs de cellules auriculaires. Les données présentées dans la figure 2 montrent un pourcentage très élevé de myocytes auriculaires e...

Discussion

Ici, nous présentons une nouvelle technique basée sur une caméra EMCCD pour la mesure quantitative simultanée de [Na⁺]_i dans plusieurs myocytes auriculaires viables à l’aide de l’isophtalate de benzofurane se liant au sodium (SBFI). L’approche décrite ici est la première à permettre la mesure simultanée de [Na⁺]_i dans plusieurs cellules. Les principaux avantages de ce nouveau protocole sont (i) l’augmentation significative du r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm