Kamerabasierte Messungen von intrazellulärem [Na+] in murinen atrialen Myozyten

Zusammenfassung

Die intrazelluläre Na^+- Konzentration ([Na⁺]_i) in Herzmyozyten ist bei Herzerkrankungen verändert. [Na⁺]_i ist ein wichtiger Regulator von intrazellulärem Ca²⁺. Wir stellen einen neuartigen Ansatz zur Messung von [Na⁺]_i in frisch isolierten murinen atrialen Myozyten mit einer EMCCD-Kamera (Electron Multipling Charged Coupled Device) und einem schnellen, steuerbaren Illuminator vor.

Zusammenfassung

Die intrazelluläre Natriumkonzentration ([Na⁺]_i) ist ein wichtiger Regulator von intrazellulärem Ca²⁺. Die Studie gibt Aufschluss über die Aktivierung des sarkolemmalen Na⁺/^Ca2+ -Austauschers, das Verhalten spannungsgesteuerter Na⁺ -Kanäle und der Na⁺,K⁺-ATPase. Die intrazelluläre^Ca2+ -Signalgebung ist bei Vorhoferkrankungen wie Vorhofflimmern verändert. Während viele der Mechanismen, die der veränderten intrazellulären Ca2⁺ -Homöostase zugrunde liegen, charakterisiert sind, ist die Rolle von [Na⁺]_i und seiner Dysregulation bei atrialen Pathologien nur unzureichend verstanden. [Na⁺]_i in atrialen Myozyten nimmt als Reaktion auf steigende Stimulationsraten zu. Die Reaktionsfähigkeit auf externe Feldstimulation ist daher entscheidend für [Na⁺]_i-Messungen in diesen Zellen. Darüber hinaus erfordern die lange Vorbereitung (Farbstoffbeladung) und die lange Versuchsdauer (Kalibrierung) ein Isolationsprotokoll, das atriale Myozyten von außergewöhnlicher Qualität liefert. Aufgrund der geringen Größe der Vorhöfe der Maus und der Zusammensetzung der interzellulären Matrix ist die Isolierung hochwertiger adulter muriner Vorhofmyozyten schwierig. Hier beschreiben wir ein optimiertes Langendorff-Perfusions-basiertes Isolationsprotokoll, das konstant eine hohe Ausbeute an qualitativ hochwertigen atrialen murinen Myozyten liefert.

Natriumbindendes Benzofuranisophthalat (SBFI) ist der am häufigsten verwendete fluoreszierende Na⁺ -Indikator. SBFI kann entweder in seiner Salzform durch eine Glaspipette oder als Acetoxymethyl (AM)-Ester, der die sarkolemmale Membran des Myozyten durchdringen kann, in den kardialen Myozyten geladen werden. Intrazellulär wird SBFI-AM durch zytosolische Esterasen entesterifiziert. Aufgrund von Variabilitäten in der Membranpenetration und der zytosolischen Entesterung muss jede Zelle in situ kalibriert werden. Typischerweise werden Messungen von [Na⁺]_i mittels SBFI-Ganzzell-Epifluoreszenz mit einer Photomultiplier-Röhre (PMT) durchgeführt. Dieser Versuchsaufbau ermöglicht es, jeweils nur eine Zelle zu messen. Aufgrund der Länge der Myozyten-Farbstoffbeladung und der Kalibrierung nach jedem Experiment ist die Datenausbeute gering. Wir haben daher eine auf EMCCD-Kameras basierende Technik zur Messung von [Na⁺]_i entwickelt. Dieser Ansatz ermöglicht simultane [Na⁺]_i-Messungen in mehreren Myozyten, wodurch die experimentelle Ausbeute deutlich erhöht wird.

Einleitung

Bei Vorhoferkrankungen (z. B. Vorhofflimmern [AF]) ist die intrazelluläre Ca2⁺-Signalgebung tiefgreifend verändert¹. Während viele der zugrundeliegenden Mechanismen der "umgebauten" intrazellulären Ca2⁺-Signalgebung bei Vorhofflimmern gut charakterisiert wurden ^2,3, ist die Rolle, die eine veränderte intrazelluläre Natriumkonzentration ([Na⁺]_i) spielen könnte, nur unzureichend verstanden. [Na⁺]_i ist ein wichtiger Regulator von intrazellulärem Ca²⁺. Die Untersuchung von [Na⁺]_i kann Aufschluss über die Aktivierung des sarkolemmalen Na⁺/^Ca2+-Austauschers (NCX), das Verhalten der Na⁺-Kanäle und der Na⁺,K⁺-ATPase (NKA)⁴ geben. Wir haben bereits gezeigt, dass hohe atriale Aktivierungsraten, wie sie bei Vorhofflimmern auftreten, zu einer signifikanten Reduktion von [Na⁺]_i ¹ führen. Frühere Arbeiten haben einen Anstieg der NCX-Stromdichte (I_NCX) und der Proteinexpression in AF³ gezeigt. Ein Anstieg der späten Komponente des spannungsabhängigen Na⁺-Stroms (I_{Na, spät}) in isolierten atrialen Myozyten von Patienten mit Vorhofflimmern wurde ebenfalls berichtet⁵. Somit gibt es Hinweise auf tiefgreifende Veränderungen der intrazellulären Na⁺-Homöostase bei Vorhofflimmern. Zuverlässige und reproduzierbare Messungen von [Na⁺]_i in isolierten atrialen Myozyten sind daher erforderlich, um unser Verständnis der Pathologie des Vorhofflimmerns zu verbessern. Hier zeigen wir, wie man qualitativ hochwertige murine atriale Myozyten reproduzierbar isoliert, die für Messungen von [Na⁺]_i geeignet sind. Wir haben unser optimiertes Protokoll zur Isolierung von Vorhofflimmern auf murine Vorhofmyozyten konzentriert, da transgene (TG) Mausmodelle für Vorhofflimmern zu einem wichtigen Bestandteil der Vorhofflimmerforschung geworden sind⁶. Diese Mäuse sind oft nur in begrenzter Anzahl verfügbar und die Vorhöfe sind oft fibrotisch, was zu Herausforderungen bei der Zellisolierung führt.

Im Allgemeinen kann [Na⁺]_i in lebensfähigen Zellen mit Fluoreszenzindikatoren ^7,8 oder mit verschiedenen Arten von Mikroelektroden⁹ gemessen werden. Mikroelektrodenbasierte Techniken erfordern eine Durchdringung der sarkolemmalen Membran. Diese Technik ist daher auf größere Zellen beschränkt und ungeeignet für kleine und schmale Vorhofmyozyten, deren Zellintegrität leicht beeinträchtigt wird.

Natriumbindendes Benzofuranisophthalat (SBFI) ist ein Fluoreszenzindikator, der bei der Bindung von Na^{+ 7} eine große Wellenlängenverschiebung erfährt. SBFI wird bei 340 nm und 380 nm abwechselnd angeregt und die emittierte Fluoreszenz wird nach dem Passieren eines Emissionsfilters (510 nm) gesammelt. Die Verhältnisse der Signale bei den beiden Anregungswellenlängen (F_340/380) können die lokale Weglänge, die Farbstoffkonzentration und wellenlängenunabhängige Schwankungen der Beleuchtungsintensität und der Detektionseffizienz aufheben. Wenn in jeder Zelle eine In-situ-Kalibrierung mit Lösungen mit bekannter Natriumkonzentration ([Na⁺]) durchgeführt wird, ergibt das während des Experiments ermittelte Verhältnis F_340/380 präzise und empfindliche Messungen von [Na⁺]_i. Wie alle Na⁺-Indikatoren weist auch SBFI eine gewisse Affinität zu K⁺ auf_. Die Verwendung der hier gezeigten Kalibriermethode ermöglicht es, die [Na⁺]_i- und die intrazelluläre Kaliumkonzentration ([K⁺]_i) während des Kalibrierprozesses zuverlässig zu "klemmen", so dass [Na⁺]_i auch dann zuverlässig kalibriert werden kann, wenn sie <10 % von [K⁺]_i ¹⁰ beträgt.

Wir stellen eine neuartige EMCCD-Kamera-basierte Technik für ratiometrische Messungen von [Na⁺]_i mittels SBFI vor. Die EMCCD-Kamera ermöglicht zum ersten Mal gleichzeitige [Na⁺]_i-Messungen (und Kalibrierungen) in mehreren Zellen. Dies ist besonders vorteilhaft in einer experimentellen Umgebung, in der die Anzahl der Tiere begrenzt ist (z. B. transgene Mausmodelle). In der Regel werden [Na⁺]_i-Messungen mit SBFI unter Verwendung einer Photomultiplier-Röhre (PMT) durchgeführt, um die Epifluoreszenz der gesamten Zelle ^1,11 zu erfassen. Während PMTs eine sehr gute zeitliche Auflösung des Fluoreszenzsignals bieten, ist die räumliche Auflösung sehr gering und die Experimente sind auf jeweils eine Zelle beschränkt.

Unser neuartiges Protokoll ermöglicht hochgradig reproduzierbare und empfindliche Messungen von [Na⁺]_i. Es ist optimiert für die gleichzeitige Erfassung von Veränderungen von [Na⁺]_i in mehreren murinen atrialen Myozyten, ist aber auch an viele andere Zelltypen anpassbar.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland, Baltimore, zugelassen.

1. Isolierung von Vorhofmyozyten aus adulten Mausherzen

1. Legen Sie jede Maus in einen Präzisionsverdampfer und eine Induktionskammer, die mit Isofluran in 100 % Sauerstoff begast sind.
2. Stellen Sie den Isofluranfluss auf 1 % ein, bis das Tier nicht mehr ansprechbar ist, bevor Sie 15 Minuten vor der Euthanasie eine intraperitoneale (IP) Heparininjektion (1–1,25 U/g) erhalten.
3. Betäuben Sie die Maus tief, indem Sie die Isofluran-Anästhesie auf 5% erhöhen und bestätigen Sie die tiefe Anästhesieebene durch Kneifen des Fußes.
4. Führen Sie die Euthanasie durch, indem Sie eine schnelle Thorakotomie^{durchführen 12}; Verwenden Sie eine Standard-Pinzette und eine chirurgische Schere, um den Thorax zu öffnen. Passives Mobilisieren von Herz und Lunge, Isolierung des Aortenbogens, Festhalten mit einer Pinzette und Durchtrennen der Aorta, um das Herz zu entfernen.
5. Legen Sie das Herz in einen eiskalten nominell Ca2⁺-freien Zellisolationspuffer (CIB, Tabelle 1).
6. Die Aorta mit einer 22-G-Kanüle kanülieren und mit einer Seidennaht unter einem Lichtmikroskop mit 3-facher Vergrößerung in CIB-Lösung binden (Abbildung 1A,B).
7. Bestätigen Sie, dass sich die Kanüle weit über den Aortenhöhlen befindet, indem Sie CIB-Lösung durch die Kanüle verabreichen, die mit einer Spritze verbunden ist, und bestätigen Sie die Perfusion der Koronararterien unter dem Mikroskop.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um eine ordnungsgemäße Durchblutung des Vorhofgewebes zu gewährleisten, da gezeigt wurde, dass die Anatomie der Koronararterien bei Mäusen sehr variabel ist¹³.
8. Montieren Sie das Herz auf ein auf Schwerkraft basierendes Langendorff-Setup und perfundieren Sie es 5 Minuten lang bei 37 °C mit der Ca²⁺-freien CIB-Lösung, um das restliche Blut auszuwaschen, bis das Eluat klar ist (Abbildung 1C).
9. Wechseln Sie zu einer enzymatischen Lösung (Tabelle 2) und perfundieren Sie 3–5 Minuten bei 37 °C, bis das Vorhofgewebe weich und schlaff ist.
10. Der rechte und der linke Vorhof werden mit einer Super-Grip-Pinzette und einer kleinen Federschere herausgeschnitten und in eine kleine Kulturschale mit der in Schritt 1.8 verwendeten enzymatischen CIB-Lösung, jedoch mit 0,15 mM CaCl₂ , gegeben und für 5–8 min in einen Inkubator bei 37 °C gestellt (Abbildung 1D).
11. Die Vorhöfe werden in eine Zellkulturschale mit 4 ml vorgewärmter (37 °C) Lagerlösung überführt (modifizierte Tyrode-Lösung (Tabelle 3) mit 15 mM Rinderserumalbumin und 30 mM 2,3-Butandionmonoxim).
12. Schneiden Sie die Vorhöfe mit einer kleinen Federschere und einer Supergriffzange in kleine Gewebestreifen (10–20, je nach Vorhofgröße).
13. Für die mechanische Dissoziation wird die Gewebesuspension mit verschiedenen Pasteurpipetten aus feuerpoliertem Glas mit Öffnungen zwischen 2 und 5 mm vorsichtig abgesaugt. Beginnen Sie mit der größten Pipettenspitze und gehen Sie zur kleinsten Pipettenspitze über, wobei Sie 5–10 Mal pro Pipette aspirieren.
14. Die Zellsuspension durch einen 200 μm Filter abseihen und dreimal alle 10 min CaCl₂ zugeben, um eine Endkonzentration von 0,3 mM zu erreichen.

2. Bewertung der Zellqualität

1. 200 μl der Zellsuspension mit den frisch isolierten Vorhofmyozyten werden auf ein Deckglas aus Glas gegeben.
2. Verwenden Sie ein 10-fach-Objektiv, um alle Zellen im Sichtfeld zu zählen und sie als abgerundet oder stabförmig zu kategorisieren. Bestimmen Sie, wie viele der stäbchenförmigen Zellen eine deutliche Kreuzstreifenbildung aufweisen (wechseln Sie zu einem 25-fachen Objektiv, wenn dies schwer zu bestimmen ist, siehe Abbildung 2C).
3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.2.
4. Berechnen Sie die Prozentsätze der gerundeten, stabförmigen und stabförmigen Zellen mit deutlichen Querstreifen.
5. Ändern Sie das Verfahren zur Zellisolierung, bis 80 % der Zellen stäbchenförmig mit deutlicher Querstreifenbildung sind.
6. Geben Sie 500 μl der Vorhofzellsuspension auf ein lamininbeschichtetes Glasdeckglas und legen Sie die Zellkammer auf das inverse Mikroskop. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten ruhen. Perfusion mit Tyrode-Lösung, die 1,8 mM Ca²⁺ enthält.
7. Verwenden Sie ein Zellstimulatorsystem, um die Stimulation des elektrischen Feldes (2 ms bipolarer Impuls, 30 V) bei 0,5 Hz zu starten, und zählen Sie die Anzahl der Zellen, die sich im Sichtfeld eines 10-fachen Objektivs zusammenziehen.
8. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer externen Feldstimulation bei 3 Hz.
9. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die auf Stimulationsraten von 0,5 und 3 Hz ansprechen (siehe Abbildung 2B). Verfeinern Sie das Zellisolationsprotokoll, bis 50 % der Zellen auf eine 3-Hz-Feldstimulation ansprechen.

3. Na^+- Indikatorbeladung frisch isolierter muriner atrialer Myozyten

1. Verwenden Sie den zellpermeierten Acetoxymethyl (AM)-Ester des Fluoreszenzindikators Natrium-bindendes Benzofuranisophthalat (SBFI-AM).
2. Um die Farbstoffdispersion zu erleichtern und eine homogene Zellbeladung zu erreichen, lösen Sie SBFI in Dimethylsulfoxid (DMSO) und geeigneten Tensidpolyolen (z. B. Pluronic), um eine Endkonzentration von 10 μM SBFI in der Zellsuspension zu erreichen.
3. Laden Sie die Zellen 60 min lang lichtgeschützt auf einer Wippe bei Raumtemperatur mit SBFI.
4. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten ruhen, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in einer Aufbewahrungslösung (1–2 mL).
   HINWEIS: Die Experimente sollten innerhalb von 4 Stunden nach der Zellisolierung durchgeführt werden. BDM wird vor Beginn der Experimente durch Perfusion mit der Tyrode-Lösung ausgewaschen¹⁴.

4. Instrumentierung, [Na⁺]_i-Messungen und [Na⁺]_{i-Kalibrierung}

HINWEIS: Abbildung 3 zeigt den Schemaplan des Strahlengangs für die experimentellen Instrumente.

1. Kalibrierlösungen mit steigenden Na⁺ -Konzentrationen herstellen, wie in den Tabellen 4–6 beschrieben.
2. Zu jeder Kalibrierlösung wird das Permeabilisierungsmittel Gramicidin D (10 μM; aus einer bei -20 °C gelagerten Stammlösung) und der Na⁺, K⁺ ATPase-Inhibitor Strophanthidin (100 μM, aus einer bei -20 °C gelagerten Stammlösung) gegeben. Vortexen Sie gut oder verwenden Sie einen Ultraschallgerät, um sicherzustellen, dass Gramicidin und Strophantidin vollständig aufgelöst werden.
3. Ein Perfusionssystem mit mehreren Fässern wird mit den in den Schritten 4.1 und 4.2 hergestellten Kalibrierlösungen mit dem zunehmenden [Na⁺]_o befüllt. Verbinden Sie sich mit einer Zellkammer mit langsamen Perfusionsraten (~1 ml/min; die Perfusionsraten können mit dem Volumen der Zellkammer variieren).
4. Schließen Sie die Absaugung an die Zellkammer an und sammeln Sie das Perfusat in einem geeigneten (Glas-)Behälter auf dem Boden.
5. Stoppen Sie die Durchblutung und das Saugen.
6. Nach 30 Minuten SBFI-Entesterung werden 100 μl der konzentrierten (Schritt 3.5), farbstoffbeladenen Zellsuspension auf ein lamininbeschichtetes Glasdeckglas über dem Sichtfeld des 40-fachen Objektivs des inversen Mikroskops gelegt.
7. Verwenden Sie eine schnell schaltende Beleuchtung mit einer 300 W Xenon-Lichtquelle. Erzielen Sie eine Weitfeld-Bildgebung mit zwei Anregungswellenlängen (340 nm und 380 nm) unter Verwendung von schnell schaltenden Scanning-Spiegeln und Anregungsfiltern mit schmaler Bandbreite (340 nm ± 10 nm; 380 nm ± 10 nm).
8. Optimieren Sie das Sichtfeld der EMCCD-Kamera. Ein größerer Beobachtungsbereich erfordert längere Bildzeiten. Längere Frame-Zeiten führen zu einem stärkeren Ausbleichen des Indikators. Gleichen Sie so die Größe des Sichtfeldes und die Bildzeit so aus, dass kein merkliches Ausbleichen der Sonde auftritt.
9. Stellen Sie fest, dass in einer Untergruppe von Vorhofzellen, die nicht mit SBFI beladen sind, nur eine minimale intrinsische Fluoreszenz vorhanden ist, indem Sie sicherstellen, dass die intrinsische Fluoreszenz der Zellen der Hintergrundfluoreszenz ähnelt (wie in Abbildung 4 gezeigt).
10. Bestimmen Sie die geeignete Abtastrate je nach Versuchsplanung (die Abtastraten können niedrig sein, da die Änderungen von [Na⁺]_i relativ langsam sind (z. B. ein Datenpunkt alle 10–20 s).
11. Dämpfen Sie das Anregungslicht durch die Verwendung geeigneter Neutraldichtefilter (ND) und durch eine entsprechende Reduzierung der Lichtquellenintensität (z. B. durch Ändern der Intensität in der Betriebssoftware).
12. Sammeln Sie das Emissionslicht bei 510 ± 40 nm mit geeigneten Filtern mit einer EMCCD-Kamera, die an das inverse Mikroskop angeschlossen ist.
13. Definieren Sie für jede Zelle einen Interessenbereich (Area of Interest, ROI) und einen ROI im Hintergrund (siehe Abbildung 4). Subtrahieren Sie den Hintergrund von den aufgezeichneten F₃₄₀ - und F_380-Signalen (entweder online oder während der Datenanalyse).
14. Starten Sie die Datenerfassung.
15. Perfusion und Absaugung neu starten. Perfundieren Sie 10–15 Minuten lang mit Tyrode-Lösung, die 1,8 mM Ca²⁺ enthält, und zeichnen Sie eine stabile F_{340/380-Basislinie} auf, bevor Sie das Experiment beginnen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie eine stabile Grundlinie für 10–15 Minuten aufnehmen. Wenn Bleaching auftritt (z. B. Verringerung der Ausgangswerte F_340/380 ), versuchen Sie, die Beleuchtungsintensität weiter zu verringern, indem Sie entweder die ND-Filterdichte erhöhen, die Intensität des Anregungslichtsignals und/oder die Erfassungszeit verringern (siehe Schritte 4.10–4.11).
16. Starten Sie die [Na⁺]_i-Messung entsprechend der Forschungsfrage.

5. [Na⁺]_{i-Kalibrierung}

1. Nach Abschluss des Versuchs (Schritt 4.16) wird eine Kalibrierung des F_{340/380-Signals} in jeder Zelle in situ durchgeführt.
2. Das F_{340/380-Signal} wird kalibriert, indem die SBFI-beladenen Myozyten mit den Kalibrierlösungen (hergestellt in den Schritten 4.1–4.3) perfundiert werden.
3. Perfusion stufenweise, um [Na⁺]_o von 0 auf 20 mM anzuheben. Warten Sie auf ein stabiles F_{340/380-Signal} , bevor Sie zur nächsten Konzentration übergehen (~5 min abhängig von der Flussrate; siehe Abbildung 3B und Abbildung 5A).
   HINWEIS: Die Beziehung zwischen dem Signal F_340/380 und dem [Na⁺] der Kalibrierlösungen muss für eine gültige Kalibrierung des Signals F_340/380 linear sein (Abbildung 5 und Abbildung 6).

Ergebnisse

Bewertung der Qualität von Vorhofzellen
Frisch isolierte atriale Myozyten wurden auf der Grundlage der Zellmorphologie und der Reaktionsfähigkeit auf Feldstimulation, wie im Protokoll beschrieben, in sechs aufeinanderfolgenden Vorhofzellisolierungen untersucht. Die in Abbildung 2 gezeigten Daten zeigen einen sehr hohen Prozentsatz an stäbchenförmigen Vorhofmyozyten, die eine deutliche Kreuzstreifenbild...

Diskussion

In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige EMCCD-kamerabasierte Technik zur gleichzeitigen quantitativen Messung von [Na⁺]_i in mehreren lebensfähigen atrialen Myozyten unter Verwendung von Natrium-bindendem Benzofuranisophthalat (SBFI) vor. Der hier beschriebene Ansatz ist der erste, der die gleichzeitige Messung von [Na⁺]_i in mehreren Zellen ermöglicht. Die Hauptvorteile dieses neuen Protokolls sind (i) die signifikante Steigerung der exper...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm