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Method Article
Die intrazelluläre Na+- Konzentration ([Na+]i) in Herzmyozyten ist bei Herzerkrankungen verändert. [Na+]i ist ein wichtiger Regulator von intrazellulärem Ca2+. Wir stellen einen neuartigen Ansatz zur Messung von [Na+]i in frisch isolierten murinen atrialen Myozyten mit einer EMCCD-Kamera (Electron Multipling Charged Coupled Device) und einem schnellen, steuerbaren Illuminator vor.
Die intrazelluläre Natriumkonzentration ([Na+]i) ist ein wichtiger Regulator von intrazellulärem Ca2+. Die Studie gibt Aufschluss über die Aktivierung des sarkolemmalen Na+/Ca2+ -Austauschers, das Verhalten spannungsgesteuerter Na+ -Kanäle und der Na+,K+-ATPase. Die intrazelluläreCa2+ -Signalgebung ist bei Vorhoferkrankungen wie Vorhofflimmern verändert. Während viele der Mechanismen, die der veränderten intrazellulären Ca2+ -Homöostase zugrunde liegen, charakterisiert sind, ist die Rolle von [Na+]i und seiner Dysregulation bei atrialen Pathologien nur unzureichend verstanden. [Na+]i in atrialen Myozyten nimmt als Reaktion auf steigende Stimulationsraten zu. Die Reaktionsfähigkeit auf externe Feldstimulation ist daher entscheidend für [Na+]i-Messungen in diesen Zellen. Darüber hinaus erfordern die lange Vorbereitung (Farbstoffbeladung) und die lange Versuchsdauer (Kalibrierung) ein Isolationsprotokoll, das atriale Myozyten von außergewöhnlicher Qualität liefert. Aufgrund der geringen Größe der Vorhöfe der Maus und der Zusammensetzung der interzellulären Matrix ist die Isolierung hochwertiger adulter muriner Vorhofmyozyten schwierig. Hier beschreiben wir ein optimiertes Langendorff-Perfusions-basiertes Isolationsprotokoll, das konstant eine hohe Ausbeute an qualitativ hochwertigen atrialen murinen Myozyten liefert.
Natriumbindendes Benzofuranisophthalat (SBFI) ist der am häufigsten verwendete fluoreszierende Na+ -Indikator. SBFI kann entweder in seiner Salzform durch eine Glaspipette oder als Acetoxymethyl (AM)-Ester, der die sarkolemmale Membran des Myozyten durchdringen kann, in den kardialen Myozyten geladen werden. Intrazellulär wird SBFI-AM durch zytosolische Esterasen entesterifiziert. Aufgrund von Variabilitäten in der Membranpenetration und der zytosolischen Entesterung muss jede Zelle in situ kalibriert werden. Typischerweise werden Messungen von [Na+]i mittels SBFI-Ganzzell-Epifluoreszenz mit einer Photomultiplier-Röhre (PMT) durchgeführt. Dieser Versuchsaufbau ermöglicht es, jeweils nur eine Zelle zu messen. Aufgrund der Länge der Myozyten-Farbstoffbeladung und der Kalibrierung nach jedem Experiment ist die Datenausbeute gering. Wir haben daher eine auf EMCCD-Kameras basierende Technik zur Messung von [Na+]i entwickelt. Dieser Ansatz ermöglicht simultane [Na+]i-Messungen in mehreren Myozyten, wodurch die experimentelle Ausbeute deutlich erhöht wird.
Bei Vorhoferkrankungen (z. B. Vorhofflimmern [AF]) ist die intrazelluläre Ca2+-Signalgebung tiefgreifend verändert1. Während viele der zugrundeliegenden Mechanismen der "umgebauten" intrazellulären Ca2+-Signalgebung bei Vorhofflimmern gut charakterisiert wurden 2,3, ist die Rolle, die eine veränderte intrazelluläre Natriumkonzentration ([Na+]i) spielen könnte, nur unzureichend verstanden. [Na+]i ist ein wichtiger Regulator von intrazellulärem Ca2+. Die Untersuchung von [Na+]i kann Aufschluss über die Aktivierung des sarkolemmalen Na+/Ca2+-Austauschers (NCX), das Verhalten der Na+-Kanäle und der Na+,K+-ATPase (NKA)4 geben. Wir haben bereits gezeigt, dass hohe atriale Aktivierungsraten, wie sie bei Vorhofflimmern auftreten, zu einer signifikanten Reduktion von [Na+]i 1 führen. Frühere Arbeiten haben einen Anstieg der NCX-Stromdichte (INCX) und der Proteinexpression in AF3 gezeigt. Ein Anstieg der späten Komponente des spannungsabhängigen Na+-Stroms (INa, spät) in isolierten atrialen Myozyten von Patienten mit Vorhofflimmern wurde ebenfalls berichtet5. Somit gibt es Hinweise auf tiefgreifende Veränderungen der intrazellulären Na+-Homöostase bei Vorhofflimmern. Zuverlässige und reproduzierbare Messungen von [Na+]i in isolierten atrialen Myozyten sind daher erforderlich, um unser Verständnis der Pathologie des Vorhofflimmerns zu verbessern. Hier zeigen wir, wie man qualitativ hochwertige murine atriale Myozyten reproduzierbar isoliert, die für Messungen von [Na+]i geeignet sind. Wir haben unser optimiertes Protokoll zur Isolierung von Vorhofflimmern auf murine Vorhofmyozyten konzentriert, da transgene (TG) Mausmodelle für Vorhofflimmern zu einem wichtigen Bestandteil der Vorhofflimmerforschung geworden sind6. Diese Mäuse sind oft nur in begrenzter Anzahl verfügbar und die Vorhöfe sind oft fibrotisch, was zu Herausforderungen bei der Zellisolierung führt.
Im Allgemeinen kann [Na+]i in lebensfähigen Zellen mit Fluoreszenzindikatoren 7,8 oder mit verschiedenen Arten von Mikroelektroden9 gemessen werden. Mikroelektrodenbasierte Techniken erfordern eine Durchdringung der sarkolemmalen Membran. Diese Technik ist daher auf größere Zellen beschränkt und ungeeignet für kleine und schmale Vorhofmyozyten, deren Zellintegrität leicht beeinträchtigt wird.
Natriumbindendes Benzofuranisophthalat (SBFI) ist ein Fluoreszenzindikator, der bei der Bindung von Na+ 7 eine große Wellenlängenverschiebung erfährt. SBFI wird bei 340 nm und 380 nm abwechselnd angeregt und die emittierte Fluoreszenz wird nach dem Passieren eines Emissionsfilters (510 nm) gesammelt. Die Verhältnisse der Signale bei den beiden Anregungswellenlängen (F340/380) können die lokale Weglänge, die Farbstoffkonzentration und wellenlängenunabhängige Schwankungen der Beleuchtungsintensität und der Detektionseffizienz aufheben. Wenn in jeder Zelle eine In-situ-Kalibrierung mit Lösungen mit bekannter Natriumkonzentration ([Na+]) durchgeführt wird, ergibt das während des Experiments ermittelte Verhältnis F340/380 präzise und empfindliche Messungen von [Na+]i. Wie alle Na+-Indikatoren weist auch SBFI eine gewisse Affinität zu K+ auf. Die Verwendung der hier gezeigten Kalibriermethode ermöglicht es, die [Na+]i- und die intrazelluläre Kaliumkonzentration ([K+]i) während des Kalibrierprozesses zuverlässig zu "klemmen", so dass [Na+]i auch dann zuverlässig kalibriert werden kann, wenn sie <10 % von [K+]i 10 beträgt.
Wir stellen eine neuartige EMCCD-Kamera-basierte Technik für ratiometrische Messungen von [Na+]i mittels SBFI vor. Die EMCCD-Kamera ermöglicht zum ersten Mal gleichzeitige [Na+]i-Messungen (und Kalibrierungen) in mehreren Zellen. Dies ist besonders vorteilhaft in einer experimentellen Umgebung, in der die Anzahl der Tiere begrenzt ist (z. B. transgene Mausmodelle). In der Regel werden [Na+]i-Messungen mit SBFI unter Verwendung einer Photomultiplier-Röhre (PMT) durchgeführt, um die Epifluoreszenz der gesamten Zelle 1,11 zu erfassen. Während PMTs eine sehr gute zeitliche Auflösung des Fluoreszenzsignals bieten, ist die räumliche Auflösung sehr gering und die Experimente sind auf jeweils eine Zelle beschränkt.
Unser neuartiges Protokoll ermöglicht hochgradig reproduzierbare und empfindliche Messungen von [Na+]i. Es ist optimiert für die gleichzeitige Erfassung von Veränderungen von [Na+]i in mehreren murinen atrialen Myozyten, ist aber auch an viele andere Zelltypen anpassbar.
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland, Baltimore, zugelassen.
1. Isolierung von Vorhofmyozyten aus adulten Mausherzen
2. Bewertung der Zellqualität
3. Na+- Indikatorbeladung frisch isolierter muriner atrialer Myozyten
4. Instrumentierung, [Na+]i-Messungen und [Na+]i-Kalibrierung
HINWEIS: Abbildung 3 zeigt den Schemaplan des Strahlengangs für die experimentellen Instrumente.
5. [Na+]i-Kalibrierung
Bewertung der Qualität von Vorhofzellen
Frisch isolierte atriale Myozyten wurden auf der Grundlage der Zellmorphologie und der Reaktionsfähigkeit auf Feldstimulation, wie im Protokoll beschrieben, in sechs aufeinanderfolgenden Vorhofzellisolierungen untersucht. Die in Abbildung 2 gezeigten Daten zeigen einen sehr hohen Prozentsatz an stäbchenförmigen Vorhofmyozyten, die eine deutliche Kreuzstreifenbild...
In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige EMCCD-kamerabasierte Technik zur gleichzeitigen quantitativen Messung von [Na+]i in mehreren lebensfähigen atrialen Myozyten unter Verwendung von Natrium-bindendem Benzofuranisophthalat (SBFI) vor. Der hier beschriebene Ansatz ist der erste, der die gleichzeitige Messung von [Na+]i in mehreren Zellen ermöglicht. Die Hauptvorteile dieses neuen Protokolls sind (i) die signifikante Steigerung der exper...
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch einen Scientist Development Grant der American Heart Association (14SDG20110054) an MG unterstützt; das NIH Interdisciplinary Training Grant in Muscle Biology (T32 AR007592) und das NIH Cardiovascular Disease Training Grant (2T32HL007698-22A1) an LG; ein Scientist Development Grant der American Heart Association (15SDG22100002) an LB und von NIH Grants R01 HL106056, R01 HL105239 und U01 HL116321 an WJL.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
340 Excitation Filter | Chroma | ET40X | 25 mm |
380 Excitation Filter | Chroma | ET80X | 25 mm |
510 Emission Filter | Chroma | ET510/80m | 25 mm |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Bubble trap | BD Medical Technologies | 904477 | Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula |
CaCl2 solution | Sigma-Aldrich | 21115 | |
Cannula | BD Medical Technologies | 305167 | Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip. |
Cell Chamber | Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion. | ||
Circulating Water Bath | VWR | ||
Collagenase II | Worthington | LS004176 | Specific activity 290 U/g |
Creatinine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
DG5-plus illuminator | Sutter Instrument | Lambda DG-4/DG-5 Plus | |
DMSO | Thermo Fischer | BP231 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
EMCCD camera | Princeton Instruments | ProEM-HS | |
Fine Hemostats | Fine Science Tools | 130-20 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
Forceps Supergrip | Fine Science Tools | 00632-11 | |
Glass Cover slips | VWR | 4838089 | 25 mm circle |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Gramicidin D | Sigma-Aldrich | G5002 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Inner silicon Tubing | VWR | VWRselect brand silicon tubing | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | NikonTE 2000 U | |
Isolation Tools | |||
K Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
KCI | Sigma-Aldrich | P5405 | |
KH2PO4 | Calbiochem | 529568 | |
Langendorff perfusion apparatus | |||
MgCl2.6H2O * | Sigma-Aldrich | M0250 | |
MyoPacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
Na Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
Natural Mouse Laminin | Thermo Fischer | 23017015 | 0.5-2.0 mg/ml |
Outer tubing | VWR | ||
Petri dish 35X10 mm | Falcon | 351008 | |
PowerLoad | Thermo Fischer | P10020 | |
Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
SBFI-AM | Thermo Fischer | S1264 | |
Silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | 0.12 mm diameter |
Small Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Strophanthidin | Sigma-Aldrich | G5884 | |
Surgical Scissors Tough Cut | Fine Science Tools | 14054-13 | |
Suture Tying Forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trisbase | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T0303 | |
UVFS Reflective 0.1 ND Filter | Thorlabs | NDUV01B | 25 mm |
UVFS Reflective 0.2 ND Filter | Thorlabs | NDUV02B | 25 mm |
UVFS Reflective 0.3 ND Filter | Thorlabs | NDUV03B | 25 mm |
UVFS Reflective 0.5 ND Filter | Thorlabs | NDUV05B | 25 mm |
UVFS Reflective 1 ND Filter | Thorlabs | NDUV010B | 25 mm |
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