מדידות מבוססות מצלמה של תוך-תאיים [Na+] במיוציטים פרוזדוריים של עכברים

Summary

ריכוז Na⁺ התוך תאי ([Na⁺]_i) במיוציטים לבביים משתנה במהלך מחלות לב. [Na⁺]_i הוא מווסת חשוב של Ca²⁺ תוך-תאי. אנו מציגים גישה חדשה למדידת [Na⁺]_i במיוציטים פרוזדורים של עכברים מבודדים טריים באמצעות מצלמת מכשיר מצמד טעון מכפיל אלקטרונים (EMCCD) ומאיר מהיר וניתן לשליטה.

Abstract

ריכוז נתרן תוך-תאי ([Na⁺]_i) הוא מווסת חשוב של Ca²⁺ תוך-תאי. המחקר שלו מספק תובנה לגבי הפעלת מחליף Na⁺/Ca²⁺ הסרקולמלי, ההתנהגות של ערוצי Na⁺ מגודרים במתח ו-Na⁺,K⁺-ATPase. איתות Ca²⁺ תוך תאי משתנה במחלות פרוזדורים כגון פרפור פרוזדורים. בעוד שרבים מהמנגנונים העומדים בבסיס הומאוסטזיס תוך-תאי Ca²⁺ מאופיינים היטב, תפקידו של [Na⁺]_i וחוסר הוויסות שלו בפתולוגיות פרוזדורים אינו מובן היטב. [Na⁺]_i במיוציטים פרוזדוריים עולה בתגובה לשיעורי גירוי הולכים וגדלים. לכן היענות לגירוי שדה חיצוני היא קריטית למדידות [Na⁺]_i בתאים אלה. בנוסף, ההכנה הארוכה (העמסת צבע) ומשך הניסוי (כיול) דורשים פרוטוקול בידוד המניב מיוציטים פרוזדורים באיכות יוצאת דופן. בשל גודלה הקטן של עליית העכבר והרכב המטריצה הבין-תאית, קשה לבודד מיוציטים פרוזדורים בוגרים באיכות גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול בידוד אופטימלי מבוסס לנגנדורף-זלוף המספק באופן עקבי תפוקה גבוהה של מיוציטים פרוזדורים של עכברים באיכות גבוהה.

איזופתלט בנזופורן קושר נתרן (SBFI) הוא אינדיקטור Na⁺ הפלואורסצנטי הנפוץ ביותר. ניתן לטעון SBFI לתוך מיוציט הלב בצורת המלח שלו דרך פיפטת זכוכית או כאסטר אצטוקסימתיל (AM) שיכול לחדור לקרום הסרקולמלי של המיוציטים. תוך תאית, SBFI-AM עובר דה-אסטריזציה על ידי אסטרזות ציטוזוליות. בשל שונות בחדירת הממברנה ודה-אסטריפיקציה ציטוזולית, יש לכייל כל תא באתרו. בדרך כלל, מדידות של [Na⁺]_i באמצעות אפיפלואורסצנציה של תא שלם SBFI מבוצעות באמצעות שפופרת פוטו-מכפיל (PMT). מערך ניסיוני זה מאפשר למדוד רק תא אחד בבת אחת. בשל אורך טעינת הצבע של מיוציטים והכיול לאחר כל ניסוי, תפוקת הנתונים נמוכה. לכן פיתחנו טכניקה מבוססת מצלמה EMCCD למדידת [Na⁺]_i. גישה זו מאפשרת מדידות [Na⁺_]i בו זמנית במספר מיוציטים ובכך מגדילה משמעותית את תפוקת הניסוי.

Introduction

במחלות פרוזדורים (למשל, פרפור פרוזדורים [AF]) איתות Ca²⁺ תוך תאי משתנה באופן עמוק¹. בעוד שרבים מהמנגנונים הבסיסיים של איתות Ca²⁺ תוך-תאי 'מעוצב מחדש' ב-AF אופיינו היטב ^2,3, התפקיד שריכוז נתרן תוך תאי שונה ([Na⁺]_i) עשוי למלא אינו מובן היטב. [Na⁺]_i הוא מווסת חשוב של Ca²⁺ תוך-תאי. המחקר של [Na⁺]_i יכול לספק תובנה לגבי ההפעלה של מחליף Na⁺/Ca²⁺ (NCX), ההתנהגות של ערוצי Na⁺ ו-Na⁺,K⁺-ATPase (NKA)⁴. הראינו בעבר כי שיעורי הפעלה גבוהים של פרוזדורים, כפי שקורה במהלך AF, מובילים להפחתה משמעותית ב-[Na⁺]_i ¹. עבודות קודמות הראו עלייה בצפיפות זרם NCX (I_NCX) וברמות ביטוי החלבון ב-AF³. ^דווח גם על עלייה במרכיב המאוחר של זרם Na⁺ תלוי מתח (I_{Na, מאוחר}) במיוציטים פרוזדוריים מבודדים מחולים עם AF 5. לפיכך, ישנן עדויות לשינויים עמוקים בהומאוסטזיס Na⁺ תוך תאי ב-AF. לכן יש צורך במדידות אמינות וניתנות לשחזור של [Na⁺]_i במיוציטים פרוזדורים מבודדים כדי לקדם את הבנתנו את הפתולוגיה של AF. כאן, אנו מדגימים כיצד לבודד באופן שחזורי מיוציטים פרוזדורים של עכברים באיכות גבוהה המתאימים למדידות של [Na⁺]_i. מיקדנו את פרוטוקול בידוד תאי הפרוזדורים האופטימלי שלנו במיוציטים פרוזדורים של עכברים מכיוון שמודלים של עכברים טרנסגניים (TG) של פרפור פרוזדורים הפכו לחלק חיוני במחקר AF⁶. עכברים אלה זמינים לרוב רק במספרים מוגבלים והפרוזדורים הם לעתים קרובות פיברוטיים, מה שמוביל לאתגרים לבידוד התאים.

באופן כללי, ניתן למדוד [Na⁺]_i בתאים ברי קיימא באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים ^7,8, או עם סוגים שונים של מיקרו-אלקטרודות⁹. טכניקות מבוססות מיקרואלקטרודות דורשות חדירה של הממברנה הסרקולמלית. לכן טכניקה זו מוגבלת לתאים גדולים יותר ואינה מתאימה למיוציטים פרוזדורים קטנים וצרים ששלמות התאים שלהם נפגעת בקלות.

איזופתלט בנזופורן קושר נתרן (SBFI) הוא אינדיקטור פלואורסצנטי, העובר שינוי אורך גל גדול בעת קשירת Na^{+ 7}. SBFI נרגש לסירוגין ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר והפלואורסצנציה הנפלטת נאספת לאחר מעבר דרך מסנן פליטה (510 ננומטר). יחסי אותות בשני אורכי גל העירור (F_340/380) יכולים לבטל את אורך הנתיב המקומי, ריכוז הצבע ושינויים בלתי תלויים באורך הגל בעוצמת התאורה וביעילות הזיהוי. כאשר מבוצע כיול באתרו באמצעות תמיסות עם ריכוז נתרן ידוע ([Na⁺]) בכל תא, יחס F_340/380 המתקבל במהלך הניסוי מניב מדידות מדויקות ורגישות של [Na⁺]_i. כמו כל מחווני Na⁺ , SBFI מציג גם זיקה מסוימת ל-K⁺_. השימוש בשיטת הכיול המוצגת כאן מאפשר 'להדק' באופן אמין את [Na⁺]_i ואת ריכוז האשלגן התוך-תאי ([K⁺]_i) במהלך תהליך הכיול, כך שניתן יהיה לכייל באופן אמין את [Na⁺]_i גם כאשר הוא <10% מ-[K⁺]_i ¹⁰.

אנו מציגים טכניקה חדשה מבוססת מצלמת EMCCD למדידות רציומטריות של [Na⁺]_i באמצעות SBFI. מצלמת EMCCD מאפשרת, לראשונה, מדידות [Na⁺]_i בו זמנית (וכיול) במספר תאים. זה מועיל במיוחד בסביבה ניסויית שבה מספר בעלי החיים מוגבל (למשל, מודלים של עכברים טרנסגניים). בדרך כלל, מדידות [Na⁺]_i באמצעות SBFI מבוצעות באמצעות שפופרת פוטו-מכפיל (PMT) כדי לאסוף אפיפלואורסצנציה של תא שלם ^1,11. בעוד ש-PMTs מציעים רזולוציה זמנית טובה מאוד של אות הקרינה, הרזולוציה המרחבית נמוכה מאוד והניסויים מוגבלים לתא אחד בכל פעם.

הפרוטוקול החדשני שלנו מאפשר מדידות רגישות וניתנות לשחזור של [Na⁺]_i. הוא מותאם לרכישה בו-זמנית של שינויים ב-[Na⁺]_i במספר מיוציטים פרוזדוריים של עכברים, אך ניתן להתאמה לסוגי תאים רבים אחרים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת מרילנד, בולטימור.

1. בידוד מיוציטים פרוזדורים מלבבות עכברים בוגרים

1. הנח כל עכבר בתא אידוי מדויק ובתא אינדוקציה עם איזופלורן ב-100% חמצן.
2. הגדר את זרימת האיזופלורן ל-1% עד שהחיה אינה מגיבה לפני מתן זריקת הפרין תוך-צפקית (IP) (1-1.25 U/g) 15 דקות לפני המתת חסד.
3. הרדמה עמוקה של העכבר על ידי הגדלת הרדמת האיזופלורן ל-5% ואשר את מישור ההרדמה העמוק על ידי צביטת כף הרגל.
4. לבצע את המתת החסד על ידי ביצוע כריתת בית חזה^{מהירה 12}; השתמש במלקחיים סטנדרטיים ובמספריים כירורגיים כדי לפתוח את בית החזה. גייסו באופן פסיבי את הלב והריאות, בודדו את קשת אבי העורקים, החזיקו בעזרת מלקחיים וחתכו את אבי העורקים כדי להסיר את הלב.
5. הנח את הלב במאגר בידוד תאים קר כקרח באופן נומינלי Ca²⁺ (CIB, טבלה 1).
6. קנול אבי העורקים עם צינורית 22 גרם וקשר באמצעות תפר משי תחת מיקרוסקופ אור עם הגדלה פי 3 בתמיסת CIB (איור 1A,B).
7. ודא שהצינורית נמצאת הרבה מעל הסינוסים של אבי העורקים על ידי העברת תמיסת CIB דרך הצינורית המחוברת למזרק ואשר זלוף עורקים כליליים תחת המיקרוסקופ.
   הערה: שלב זה חשוב כדי להבטיח זלוף תקין של רקמת הפרוזדורים מכיוון שהוכח כי האנטומיה של העורקים הכליליים משתנה מאוד בעכברים¹³.
8. הרכיבו את הלב על Langendorff מבוסס כבידה שהוקם וחדרו עם תמיסת CIB נטולת Ca²⁺ למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את הדם שנותר עד שהפליטה צלולה (איור 1C).
9. עבור לתמיסה אנזימטית (טבלה 2) והחדיר למשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שרקמת הפרוזדורים רכה ורפויה.
10. כרתו את הפרוזדור הימני והשמאלי באמצעות מלקחיים סופר-אחיזה ומספריים קפיציים קטנים והעבירו לצלחת תרבית קטנה המכילה תמיסה אנזימטית CIB ששימשה בשלב 1.8 אך עם 0.15 מ"מ CaCl₂ והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 דקות (איור 1D).
11. העבירו את הפרוזדורים לתוך צלחת תרבית תאים המכילה תמיסת אחסון של 4 מ"ל מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) (תמיסת טירוד מותאמת (טבלה 3) המכילה 15 מ"מ אלבומין בסרום בקר ו-30 מ"מ 2,3-בוטנדיון מונוקסיים).
12. חותכים את הפרוזדורים לרצועות רקמה קטנות (10-20, תלוי בגודל הפרוזדורים) בעזרת מספריים קפיציים קטנים ומלקחיים בעלי אחיזת על.
13. לצורך דיסוציאציה מכנית, שאפו בעדינות את תרחיף הרקמה באמצעות פיפטות פסטר מזכוכית מלוטשת באש עם פתחים בין 2-5 מ"מ. התחל עם קצה הפיפטה הגדול ביותר ועבור לקצה הפיפטה הקטן ביותר, שאף 5-10 פעמים לכל פיפטה.
14. מסננים את תרחיף התא דרך מסנן של 200 מיקרומטר ומוסיפים CaCl₂ שלוש פעמים כל 10 דקות כדי להשיג ריכוז סופי של 0.3 מ"מ.

2. הערכת איכות התא

1. הנח 200 מיקרוליטר מתרחיף התאים המכיל את מיוציטים הפרוזדורים שבודדו לאחרונה על כיסוי זכוכית.
2. השתמש במטרה פי 10 כדי לספור את כל התאים בשדה הראייה ולסווג אותם כמעוגלים או בצורת מוט. קבע כמה מהתאים בצורת מוט מראים פסים צולבים ברורים (עבור למטרה של פי 25 אם קשה לקבוע זאת, ראה איור 2C).
3. חזור על שלבים 2.1-2.2.
4. חשב את האחוזים של תאי פסים מעוגלים, בצורת מוט ובצורת מוט עם תאי פסים צולבים שקופים.
5. שנה את הליך בידוד התאים עד ש-80% מהתאים יהיו בצורת מוט עם פסים צולבים ברורים.
6. הנח 500 מיקרוליטר של תרחיף תאי הפרוזדורים על כיסוי זכוכית מצופה למינין והנח את תא התא על המיקרוסקופ ההפוך. תן לתאים להתיישב במשך 5 דקות. החדרה עם תמיסה של Tyrode המכילה 1.8 מ"מ Ca²⁺.
7. השתמש במערכת ממריץ תאים כדי להתחיל גירוי שדה חשמלי (דופק דו קוטבי של 2 אלפיות השנייה, 30 וולט) ב-0.5 הרץ ולספור את מספר התאים המתכווצים בשדה הראייה של מטרה פי 10.
8. חזור על הפעולה עם גירוי שדה חיצוני ב-3 הרץ.
9. חשב את אחוז התאים המגיבים לקצבי גירוי של 0.5 ו-3 הרץ (ראה איור 2B). צמצם את פרוטוקול בידוד התאים עד ש-50% מהתאים מגיבים לגירוי שדה של 3 הרץ.

3. טעינת אינדיקטור Na⁺ של מיוציטים פרוזדורים של עכברים מבודדים טריים

1. השתמש באסטר אצטוקסימתיל (AM) של האינדיקטור הפלואורסצנטי קושר הנתרן בנזופוראן איזופתלט (SBFI-AM).
2. כדי להקל על פיזור הצבע ולהשיג העמסת תאים הומוגנית, ממיסים SBFI בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) ובפוליאולים פעילי שטח מתאימים (למשל, פלורוני) כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר SBFI בתרחיף התא.
3. טען את התאים ב- SBFI למשך 60 דקות מוגן מפני אור על נדנדה בטמפרטורת החדר.
4. הניחו לתאים להתיישב במשך 30 דקות, הסירו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בתמיסת אחסון (1-2 מ"ל).
   הערה: יש לבצע ניסויים תוך 4 שעות מבידוד התאים. BDM נשטף על ידי זלוף עם התמיסה של טירוד לפני תחילת ניסויים¹⁴.

4. מכשור, מדידות [Na⁺]_i וכיול [Na⁺]_i

הערה: איור 3 מתאר את סכימת נתיב האור עבור המכשור הניסיוני.

1. הכן תמיסות כיול עם הגדלת ריכוזי Na⁺ כמתואר בטבלאות 4-6.
2. הוסף את החומר החדיר gramicidin D (10 μM; מתמיסת מלאי המאוחסנת ב-20°C-) ואת מעכב Na⁺, K⁺ ATPase Strophanthidin (100 μM, מתמיסת מלאי המאוחסנת ב-20°C-) לכל תמיסת כיול. מערבולת היטב, או השתמש בסוניקטור כדי להבטיח שגרמיצ'דין וסטרופנטדין מומסים לחלוטין.
3. מלאו מערכת זלוף מרובת חביות בתמיסות הכיול המכילות את ה-[Na⁺]_o ההולך וגדל שהוכנו בשלבים 4.1 ו-4.2. התחבר לתא תא באמצעות קצבי זלוף איטיים (~1 מ"ל/דקה; קצבי הזלוף יכולים להשתנות בהתאם לנפח תא התא).
4. חבר את היניקה לתא התא ואסוף פרפוזה במיכל מתאים (זכוכית) על הרצפה.
5. הפסק זלוף ויניקה.
6. לאחר מתן אפשרות ל-30 דקות של דה-אסטריפיקציה של SBFI, הנח 100 מיקרוליטר של מתלה התאים המרוכז (שלב 3.5), טעון צבע על החלקת כיסוי זכוכית מצופה למינין מעל שדה הראייה של מטרת פי 40 של המיקרוסקופ ההפוך.
7. השתמש בתאורה מתחלפת מהירה עם מקור אור קסנון של 300 וואט. השג הדמיית שדה רחב עם שני אורכי גל עירור (340 ננומטר ו-380 ננומטר) באמצעות מראות סריקה במיתוג מהיר ומסנני עירור ברוחב פס צר (340 ננומטר ±-10 ננומטר; 380 ננומטר ±-10 ננומטר).
8. בצע אופטימיזציה של שדה הראייה של מצלמת EMCCD. אזור תצפית גדול יותר דורש זמני פריימים ארוכים יותר. זמני פריימים ארוכים יותר מובילים להלבנה רבה יותר של המחוון. לפיכך, אזנו את שדה הראייה, גודל וזמן המסגרת כך שלא תתרחש הלבנה ניכרת של הגשושית.
9. קבע שיש רק פלואורסצנציה פנימית מינימלית בתת-קבוצה של תאי פרוזדורים שאינם טעונים ב-SBFI על ידי הבטחה שהפלואורסצנציה הפנימית של התאים דומה לפלואורסצנטיות רקע (כפי שמוצג באיור 4).
10. קבע את קצב הדגימה המתאים בהתאם לתכנון הניסוי (שיעורי הדגימה יכולים להיות נמוכים מכיוון שהשינויים ב-[Na⁺]_i איטיים יחסית (למשל נקודת נתונים אחת שנרכשת כל 10-20 שניות).
11. להחליש את אור העירור על ידי שימוש במסנני צפיפות ניטרלית (ND) מתאימים ועל ידי הפחתה נאותה של עוצמת מקור האור (למשל, על ידי שינוי העוצמה בתוכנת ההפעלה).
12. אסוף את אור הפליטה ב-510 ±-40 ננומטר באמצעות מסננים מתאימים עם מצלמת EMCCD המחוברת למיקרוסקופ ההפוך.
13. הגדירו אזור עניין (ROI) עבור כל תא והחזר ROI ברקע (ראו איור 4). הפחיתו את הרקע מהאותות המוקלטים F₃₄₀ ו-F₃₈₀ (באופן מקוון או במהלך ניתוח נתונים).
14. התחל את רכישת הנתונים.
15. הפעל מחדש את הזלוף והיניקה. השתמש במשך 10-15 דקות עם התמיסה של טירוד המכילה 1.8 מ"מ Ca²⁺ ורשום קו בסיס יציב של F_340/380 לפני תחילת הניסוי.
    הערה: הקפד להקליט קו בסיס יציב למשך 10-15 דקות. אם מתרחשת הלבנה (למשל, הפחתה של קו הבסיס F_340/380 ) שאפו להחליש עוד יותר את עוצמת התאורה על ידי הגדלת צפיפות מסנן ND, הפחתת עוצמת אות אור העירור ו/או זמן מסגרת הרכישה (ראה שלבים 4.10-4.11).
16. התחל מדידת [Na⁺]_i בהתאם לשאלת המחקר.

5. כיול [Na⁺]_i

1. לאחר סיום הניסוי (שלב 4.16) בצע כיול של אות F_340/380 בכל תא באתרו.
2. כייל את אות F_340/380 על ידי החדרת המיוציטים הטעונים ב-SBFI עם תמיסות הכיול (שהוכנו בשלבים 4.1-4.3).
3. בצע צעד כדי להעלות את [Na⁺]_o מ-0 ל-20 מ"מ. המתן לאות F_340/380 יציב לפני המעבר לריכוז הבא (~5 דקות תלוי בקצב הזרימה; ראה איור 3B ואיור 5A).
   הערה: היחס בין אות F_340/380 לבין [Na⁺] של פתרונות הכיול צריך להיות ליניארי עבור כיול תקף של אות F_340/380 (איור 5 ואיור 6).

תוצאות

הערכת איכות תאי הפרוזדורים
מיוציטים פרוזדורים שבודדו לאחרונה הוערכו על סמך מורפולוגיה של התא והיענות לגירוי שדה כמתואר בפרוטוקול בשישה בידודי תאי פרוזדורים רצופים. הנתונים המוצגים באיור 2 מראים אחוז גבוה מאוד של מיוציטים פ?...

Discussion

כאן אנו מציגים טכניקה חדשה מבוססת מצלמת EMCCD למדידה כמותית בו-זמנית של [Na⁺]_i במספר מיוציטים פרוזדורים ברי קיימא באמצעות איזופתלט בנזופורן קושר נתרן (SBFI). הגישה המתוארת כאן היא הראשונה המאפשרת מדידה בו זמנית של [Na⁺]_i במספר תאים. היתרונות העיקריים שמציג ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm