Murin Atriyal Miyositlerde Hücre İçi [Na+] Kameralı Ölçümler

Özet

Kardiyak miyositlerdeki hücre içi Na⁺ konsantrasyonu ([Na⁺]_i) kalp hastalıkları sırasında değişir. [Na⁺]_i , hücre içi Ca^{2 +} 'nın önemli bir düzenleyicisidir. Yeni izole edilmiş murin atriyal miyositlerde [Na⁺]_i'yi bir elektron çarpımı yüklü birleştirilmiş cihaz (EMCCD) kamera ve hızlı, kontrol edilebilir bir aydınlatıcı kullanarak ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Özet

Hücre içi sodyum konsantrasyonu ([Na⁺]_i), hücre içi^Ca2+'nın önemli bir düzenleyicisidir. Çalışması, sarkolimal Na⁺/Ca²⁺ değiştiricinin aktivasyonu, voltaj kapılı Na⁺ kanallarının ve Na⁺,K⁺-ATPaz'ın davranışı hakkında fikir vermektedir. Atriyal fibrilasyon gibi atriyal hastalıklarda hücre içi Ca²⁺ sinyali değişir. Değişmiş hücre içi Ca²⁺ homeostazının altında yatan mekanizmaların çoğu karakterize edilirken, atriyal patolojilerde [Na⁺]_i ve düzensizliğinin rolü tam olarak anlaşılamamıştır. [Na⁺]_Atriyal miyositlerde I, artan stimülasyon oranlarına yanıt olarak artar. Bu nedenle, dış alan stimülasyonuna duyarlılık, bu hücrelerdeki [Na⁺]_{i ölçümleri} için çok önemlidir. Ek olarak, uzun hazırlık (boya yüklemesi) ve deney süresi (kalibrasyon), olağanüstü kalitede atriyal miyositler veren bir izolasyon protokolü gerektirir. Fare kulakçıklarının küçük boyutu ve hücreler arası matrisin bileşimi nedeniyle, yüksek kaliteli yetişkin murin atriyal miyositlerinin izolasyonu zordur. Burada, sürekli olarak yüksek kaliteli atriyal murin miyositlerinden yüksek verim sağlayan optimize edilmiş bir Langendorff perfüzyon tabanlı izolasyon protokolünü açıklıyoruz.

Sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI), en yaygın kullanılan floresan Na⁺ göstergesidir. SBFI, kardiyak miyosite tuz formunda bir cam pipet yoluyla veya miyositin sarkolemmal membranına nüfuz edebilen bir asetoksimetil () ester olarak yüklenebilir. Hücre içi olarak, SBFI-sitozolik esterazlar tarafından deesterifiye edilir. Membran penetrasyonu ve sitozolik de-esterifikasyondaki değişkenlikler nedeniyle, her hücrenin yerinde kalibre edilmesi gerekir. Tipik olarak, SBFI tam hücre epifloresan kullanılarak [Na⁺]_i ölçümleri, bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kullanılarak gerçekleştirilir. Bu deney düzeneği, aynı anda yalnızca bir hücrenin ölçülmesine izin verir. Miyosit boya yüklemesinin uzunluğu ve her deney verisini takiben yapılan kalibrasyon nedeniyle verim düşüktür. Bu nedenle, [Na⁺]_i'yi ölçmek için EMCCD kamera tabanlı bir teknik geliştirdik. Bu yaklaşım, çoklu miyositlerde eşzamanlı [Na⁺]_{i ölçümlerine} izin verir, böylece deneysel verimi önemli ölçüde artırır.

Giriş

Atriyal hastalıklarda (ör., atriyal fibrilasyon [AF]) hücre içi Ca²⁺ sinyali derinden değişir¹. AF'de 'yeniden modellenmiş' hücre içi Ca^{2 +} sinyallemesinin altında yatan mekanizmaların çoğu iyi karakterize edilmiş olsa da ^2,3, değişmiş bir hücre içi sodyum konsantrasyonunun ([Na⁺]_i) oynayabileceği rol tam olarak anlaşılamamıştır. [Na⁺]_i, hücre içi Ca^{2 +} 'nın önemli bir düzenleyicisidir. [Na⁺]_i çalışması, sarkolemmal Na⁺/Ca²⁺ değiştiricinin (NCX) aktivasyonu, Na⁺ kanallarının ve Na⁺,K⁺-ATPaz (NKA)^4'ün davranışı hakkında fikir verebilir. Daha önce, AF sırasında meydana gelen yüksek atriyal aktivasyon oranlarının [Na⁺]_i ^1'de önemli bir azalmaya yol açtığını göstermiştik. Önceki çalışmalar, AF^3'te NCX akım yoğunluğunda (I_NCX) ve protein ekspresyon seviyelerinde bir artış olduğunu göstermiştir. AF'li hastalardan izole edilen atriyal miyositlerde voltaja bağımlı Na⁺ akımının (I_{Na, geç}) geç bileşeninde bir artış da bildirilmiştir⁵. Bu nedenle, AF'de hücre içi Na⁺ homeostazında derin değişiklikler olduğuna dair kanıtlar vardır. Bu nedenle, AF patolojisini daha iyi anlamamız için izole atriyal miyositlerde [Na⁺]_i'nin güvenilir ve tekrarlanabilir ölçümlerine ihtiyaç vardır. Burada, [Na^+]i ölçümleri için uygun olan yüksek kaliteli murin atriyal miyositlerin nasıl tekrarlanabilir şekilde izole _{edileceğini gösteriyoruz}. Atriyal fibrilasyonun transgenik (TG) fare modelleri AF araştırmasının hayati bir parçası haline geldiğinden, optimize edilmiş atriyal hücre izolasyon protokolümüzü murin atriyal miyositlere odakladık⁶. Bu fareler genellikle sadece sınırlı sayıda bulunur ve kulakçıklar genellikle fibrotiktir ve hücre izolasyonu için zorluklara yol açar.

Genel olarak, canlı hücrelerdeki [Na⁺]_i, floresan indikatörler ^7,8 veya farklı tipte mikroelektrotlar⁹ ile ölçülebilir. Mikroelektrot bazlı teknikler, sarkolemmal membranın penetrasyonunu gerektirir. Bu nedenle bu teknik daha büyük hücrelerle sınırlıdır ve hücre bütünlüğü kolayca tehlikeye giren küçük ve dar atriyal miyositler için uygun değildir.

Sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI), Na^{+ 7'ye} bağlandıktan sonra büyük bir dalga boyu kaymasına uğrayan bir floresan indikatördür. SBFI, 340 nm ve 380 nm'de dönüşümlü olarak uyarılır ve yayılan floresan, bir emisyon filtresinden (510 nm) geçtikten sonra toplanır. İki uyarma dalga boyundaki (F_340/380) sinyallerin oranları, yerel yol uzunluğunu, boya konsantrasyonunu ve aydınlatma yoğunluğu ve algılama verimliliğindeki dalga boyundan bağımsız değişimleri iptal edebilir. Her hücrede bilinen sodyum konsantrasyonuna ([Na⁺]) sahip çözeltiler kullanılarak yerinde kalibrasyon gerçekleştirildiğinde, deney sırasında elde edilen F_340/380 oranı, [Na⁺]_i'nin kesin ve hassas ölçümlerini verir. Tüm Na⁺ göstergeleri gibi, SBFI de K⁺ için bir miktar afinite gösterir_. Burada gösterilen kalibrasyon yönteminin kullanılması, kalibrasyon işlemi sırasında [Na⁺]_i ve hücre içi potasyum konsantrasyonunun ([K⁺]_i) güvenilir bir şekilde 'kenetlenmesine' izin verir, böylece [Na⁺]_i, [K⁺]_i ^{10'un %<10'u} olduğunda bile güvenilir bir şekilde kalibre edilebilir.

SBFI kullanarak [Na⁺]_i'nin oransal ölçümleri için yeni bir EMCCD kamera tabanlı teknik sunuyoruz. EMCCD kamera, ilk kez birden fazla hücrede eş zamanlı [Na⁺]_{i ölçümlerine} (ve kalibrasyona) izin veriyor. Bu, özellikle hayvan sayılarının sınırlı olduğu deneysel bir ortamda faydalıdır (örneğin, transgenik fare modelleri). Tipik olarak, SBFI kullanılarak [Na⁺]_i ölçümleri, tüm hücre epifloresansını ^1,11 toplamak için bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kullanılarak gerçekleştirilir. PMT'ler floresan sinyalinin çok iyi zamansal çözünürlüğünü sunarken, uzamsal çözünürlük çok düşüktür ve deneyler bir seferde bir hücre ile sınırlıdır.

Yeni protokolümüz, [Na⁺]_i'nin yüksek oranda tekrarlanabilir ve hassas ölçümlerini kolaylaştırır. Çoklu murin atriyal miyositlerinde [Na⁺]_i'deki değişikliklerin aynı anda elde edilmesi için optimize edilmiştir, ancak diğer birçok hücre tipine uyarlanabilir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Maryland Üniversitesi, Baltimore'un Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Atriyal miyositlerin yetişkin murin kalplerinden izolasyonu

1. Her fareyi% 100 oksijende izofluran ile gazlanmış hassas bir buharlaştırıcıya ve indüksiyon odasına yerleştirin.
2. Ötenaziden 15 dakika önce intraperitoneal (IP) heparin enjeksiyonu (1–1.25 U/g) vermeden önce hayvan yanıt vermeyene kadar izofluran akışını% 1'e ayarlayın.
3. İzofluran anestezisini% 5'e çıkararak fareyi derinlemesine uyuşturun ve derin anestezi düzlemini ayak tutamıyla onaylayın.
4. Hızlı bir torakotomi¹² yaparak ötenaziyi gerçekleştirin; Göğüs kafesi açmak için standart desen forseps ve cerrahi makas kullanın. Kalbi ve akciğeri pasif olarak harekete geçirin, aort arkını izole edin, forseps ile tutun ve kalbi çıkarmak için aortu kesin.
5. Kalbi buz gibi soğuk nominal olarak Ca^{2 +} içermeyen hücre izolasyon tamponuna yerleştirin (CIB, Tablo 1).
6. Aort 22 G kanül ile kanül edilin ve ışık mikroskobu altında 3x büyütme ile CIB solüsyonunda ipek sütür kullanılarak bağlanın (Şekil 1A,B).
7. Bir şırıngaya bağlı kanül yoluyla CIB solüsyonu vererek kanülün aort sinüslerinin çok üzerinde olduğunu doğrulayın ve mikroskop altında koroner arter perfüzyonunu onaylayın.
   NOT: Bu adım, atriyal dokunun uygun şekilde perfüzyonunu sağlamak için önemlidir, çünkü koroner arter anatomisinin farelerde oldukça değişken olduğu gösterilmiştir¹³.
8. Kalbi yerçekimine dayalı bir Langendorff kurulumuna monte edin ve elüat berraklaşana kadar kalan kanı yıkamak için 37 ° C'de 5 dakika boyunca Ca²⁺ içermeyen CIB solüsyonu ile perfüze edin (Şekil 1C).
9. Enzimatik çözeltiye geçin (Tablo 2) ve atriyal doku yumuşak ve sarkık olana kadar 37 ° C'de 3-5 dakika perfüze edin.
10. Süper kavramalı forseps ve küçük yaylı makas kullanarak sağ ve sol atriyumu eksize edin ve adım 1.8'de kullanılan, ancak 0.15 mM CaCl₂ içeren CIB enzimatik çözeltisi içeren küçük bir kültür kabına aktarın ve 37 ° C'de 5-8 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin (Şekil 1D).
11. Kulakçıkları 4 mL önceden ısıtılmış (37 °C) saklama çözeltisi (15 mM sığır serum albümini ve 30 mM 2,3-bütandion monoksim içeren modifiye Tyrode çözeltisi (Tablo 3)) içeren bir hücre kültürü kabına aktarın.
12. Küçük yaylı makas ve süper kavramalı forseps kullanarak kulakçıkları küçük doku şeritleri halinde (atriyal boyuta bağlı olarak 10-20) kesin.
13. Mekanik ayrışma için, açıklıkları 2-5 mm arasında olan farklı ateşle parlatılmış cam Pasteur pipetleri kullanarak doku süspansiyonunu nazikçe aspire edin. En büyük pipet ucuyla başlayın ve pipet başına 5-10 kez aspire ederek en küçük pipet ucuna geçin.
14. Hücre süspansiyonunu 200 μm'lik bir filtreden süzün ve 0.3 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her 10 dakikada bir üç kez CaCl₂ ekleyin.

2. Hücre kalitesinin değerlendirilmesi

1. Yeni izole edilmiş atriyal miyositleri içeren 200 μL hücre süspansiyonunu bir cam lamel üzerine yerleştirin.
2. Görüş alanındaki tüm hücreleri saymak için 10x'lik bir hedef kullanın ve bunları yuvarlak veya çubuk şeklinde kategorilere ayırın. Çubuk şeklindeki hücrelerden kaçının net çapraz çizgi gösterdiğini belirleyin (bunu belirlemek zorsa 25x objektife geçin, bkz. Şekil 2C).
3. 2.1–2.2 adımlarını tekrarlayın.
4. Net çapraz çizgi hücreleri ile yuvarlak, çubuk şeklindeki ve çubuk şeklindeki yüzdeleri hesaplayın.
5. Hücrelerin %80'i net çapraz çizgileme ile çubuk şeklinde olana kadar hücre izolasyon prosedürünü değiştirin.
6. 500 μL atriyal hücre süspansiyonunu laminin kaplı bir cam lamel üzerine yerleştirin ve hücre odasını ters çevrilmiş mikroskobun üzerine yerleştirin. Hücrelerin 5 dakika oturmasına izin verin. Tyrode'un 1.8 mM Ca²⁺ içeren çözeltisi ile perfüz.
7. 0,5 Hz'de elektrik alan stimülasyonunu (2 ms bipolar darbe, 30 V) başlatmak için bir hücre stimülatör sistemi kullanın ve 10x'lik bir hedefin görüş alanında büzülen hücre sayısını sayın.
8. 3 Hz'de harici alan stimülasyonu ile tekrarlayın.
9. 0,5 ve 3 Hz stimülasyon oranlarına yanıt veren hücrelerin yüzdesini hesaplayın (bkz. Şekil 2B). Hücrelerin %50'si 3 Hz alan stimülasyonuna yanıt verene kadar hücre izolasyon protokolünü rafine edin.

3. Yeni izole edilmiş murin atriyal miyositlerin Na⁺ gösterge yüklemesi

1. Floresan indikatör sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalatın (SBFI-) hücre kaynaklı asetoksimetil () esterini kullanın.
2. Boya dispersiyonunu kolaylaştırmak ve homojen hücre yüklemesi elde etmek için, hücre süspansiyonunda 10 μM SBFI'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için SBFI'yi dimetil sülfoksit (DMSO) ve uygun yüzey aktif madde poliolleri (örn. pluronik) içinde çözün.
3. Hücreleri SBFI ile 60 dakika boyunca ışıktan koruyarak oda sıcaklığında bir külbütöre yükleyin.
4. Hücrelerin 30 dakika dinlenmesine izin verin, süpernatanı çıkarın ve peleti depolama solüsyonunda (1-2 mL) yeniden süspanse edin.
   NOT: Deneyler, hücre izolasyonundan sonraki 4 saat içinde yapılmalıdır. BDM, deneylerin başlamasından önce Tyrode çözeltisi ile perfüzyon yoluyla yıkanır¹⁴.

4. Enstrümantasyon, [Na⁺]_{i ölçümleri} ve [Na⁺]_{i kalibrasyonu}

NOT: Şekil 3 , deneysel enstrümantasyon için ışık yolu şemasını göstermektedir.

1. Tablo 4-6'da açıklandığı gibi artan Na⁺ konsantrasyonlarına sahip kalibrasyon çözeltileri hazırlayın.
2. Her bir kalibrasyon çözeltisine geçirgenleştirici ajan gramicidin D (10 μM; -20 ° C'de depolanan bir stok çözeltisinden) ve Na ⁺, K ⁺ ATPaz inhibitörü strofantidin (100 μM, -20 ° C'de depolanan bir stok çözeltisinden) ekleyin. İyice vorteksleyin veya gramicidin ve strofanidinin tamamen çözüldüğünden emin olmak için bir sonikatör kullanın.
3. Çok namlulu bir perfüzyon sistemini, adım 4.1 ve 4.2'de hazırlanan artan [Na⁺]_o içeren kalibrasyon solüsyonları ile doldurun. Yavaş perfüzyon hızları kullanarak bir hücre odasına bağlanın (~ 1 mL / dak; perfüzyon hızları hücre odasının hacmine göre değişebilir).
4. Emişi hücre odasına bağlayın ve perfüzatı zemindeki uygun (cam) bir kapta toplayın.
5. Perfüzyonu ve emmeyi durdurun.
6. 30 dakikalık SBFI de-esterifikasyonuna izin verdikten sonra, 100 μL konsantre (adım 3.5), boya yüklü hücre süspansiyonunu, ters çevrilmiş mikroskobun 40x objektifinin görüş alanının üzerine laminin kaplı bir cam kapak kayması üzerine yerleştirin.
7. 300 W xenon ışık kaynağına sahip hızlı geçişli bir aydınlatıcı kullanın. Hızlı anahtarlamalı tarama aynaları ve dar bant genişliğine sahip uyarma filtreleri (340 nm ± 10 nm; 380 nm ± 10 nm) kullanarak iki uyarma dalga boyu (340 nm ve 380 nm) ile geniş alan görüntülemesi elde edin.
8. EMCCD kameranın görüş alanını optimize edin. Daha geniş bir gözlem alanı, daha uzun kare süreleri gerektirir. Daha uzun kare süreleri, göstergenin daha fazla ağartılmasına neden olur. Böylece, görüş alanı boyutunu ve çerçeve süresini dengeleyin, böylece probda gözle görülür bir ağartma meydana gelmez.
9. Hücrelerin içsel floresansının arka plan floresansına benzer olduğundan emin olarak ( Şekil 4'te gösterildiği gibi) SBFI ile yüklü olmayan atriyal hücrelerin bir alt kümesinde yalnızca minimal içsel floresan olduğunu belirleyin.
10. Deneysel tasarıma bağlı olarak uygun örnekleme oranını belirleyin ([Na⁺]_i'deki değişiklikler nispeten yavaş olduğundan örnekleme oranları düşük olabilir (örneğin, her 10-20 saniyede bir elde edilen bir veri noktası).
11. Uygun nötr yoğunluk (ND) filtreleri kullanarak ve ışık kaynağı yoğunluğunu uygun şekilde azaltarak (örneğin, işletim yazılımındaki yoğunluğu değiştirerek) uyarma ışığını azaltın.
12. Ters mikroskoba bağlı bir EMCCD kamera ile uygun filtreler kullanarak 510 ± 40 nm'de emisyon ışığını toplayın.
13. Her hücre için bir ilgi alanı (ROI) ve bir arka plan ROI'si tanımlayın (bkz. Şekil 4). Kaydedilen F₃₄₀ ve F₃₈₀ sinyallerinden arka planı çıkarın (çevrimiçi veya veri analizi sırasında).
14. Veri toplamayı başlatın.
15. Perfüzyonu ve emmeyi yeniden başlatın. Tyrode'un 1.8 mM Ca²⁺ içeren çözeltisi ile 10-15 dakika perfüze edin ve deneye başlamadan önce kararlı bir F_340/380 taban çizgisi kaydedin.
    NOT: 10-15 dakika boyunca sabit bir taban çizgisi kaydettiğinizden emin olun. Ağartma meydana gelirse (örneğin, F_340/380 taban çizgisinin azaltılması), ND filtre yoğunluğunu artırarak, uyarma ışığı sinyali yoğunluğunu azaltarak ve/veya çerçeve süresini elde ederek aydınlatma yoğunluğunu daha da azaltmayı hedefleyin (bkz. adım 4.10–4.11).
16. Araştırma sorusuna göre [Na⁺]_{i ölçümünü} başlatın.

5. [Na⁺]_{i Kalibrasyonu}

1. Deneyin tamamlanmasından sonra (adım 4.16), her hücrede yerinde F_340/380 sinyalinin kalibrasyonunu gerçekleştirin.
2. SBFI yüklü miyositleri kalibrasyon çözeltileriyle perfüze ederek F_340/380 sinyalini kalibre edin (adım 4.1-4.3'te hazırlanmıştır).
3. [Na⁺]_o'yu 0'dan 20 mM'ye yükseltmek için kademeli olarak perfüz. Bir sonraki konsantrasyona geçmeden önce kararlı F_340/380 sinyalini bekleyin (akış hızına bağlı olarak ~5 dakika; bkz. Şekil 3B ve Şekil 5A).
   NOT: F_340/380 sinyalinin geçerli bir kalibrasyonu için F_340/380 sinyali ile kalibrasyon çözeltilerinin [Na⁺] arasındaki ilişkinin doğrusal olması gerekir (Şekil 5 ve Şekil 6).

Sonuçlar

Atriyal Hücre Kalitesinin Değerlendirilmesi
Yeni izole edilmiş atriyal miyositler, ardışık altı atriyal hücre izolasyonunda protokolde belirtildiği gibi hücre morfolojisine ve alan stimülasyonuna yanıt verme yeteneğine dayalı olarak değerlendirildi. Şekil 2'de gösterilen veriler, net çapraz çizgiyi koruyan çubuk şeklindeki atriyal miyositlerin çok yüksek bir yüzdesini göstermektedi...

Tartışmalar

Burada, sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) kullanılarak çoklu canlı atriyal miyositlerde [Na⁺]_i'nin eş zamanlı kantitatif ölçümü için yeni bir EMCCD kamera tabanlı teknik sunuyoruz. Burada açıklanan yaklaşım, birden fazla hücrede [Na⁺]_i'nin aynı anda ölçülmesine izin veren ilk yaklaşımdır. Bu yeni protokolün sunduğu başlıca avantajlar, (i) deneysel verimdeki önemli artış ve (ii) hücre hasarını önem...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm