マウス心房筋細胞における細胞内[Na+]のカメラによる測定

要約

心筋細胞の細胞内Na⁺ 濃度([Na⁺]_i)は、心疾患中に変化します。[^NA+]_i は細胞内Ca²⁺の重要な調節因子です。電子増倍荷電結合デバイス(EMCCD)カメラと迅速で制御可能な照明器を使用して、新たに単離されたマウス心房筋細胞の[Na⁺]_i を測定するための新しいアプローチを紹介します。

要約

細胞内ナトリウム濃度([Na⁺]_i)は、細胞内^Ca2+の重要な調節因子です。その研究は、サルコレンマルNa⁺/Ca²⁺ 交換体の活性化、電位依存性Na⁺ チャネルの挙動、およびNa⁺,K⁺-ATPaseに関する洞察を提供します。細胞内Ca²⁺ シグナル伝達は、心房細動などの心房疾患で変化します。細胞内Ca²⁺ 恒常性の変化の根底にあるメカニズムの多くは特徴付けられていますが、[Na⁺]_i の役割とその調節不全は心房病理において十分に理解されていません。[^NA+]心房筋細胞の_I は、刺激速度の増加に応答して増加します。したがって、外部磁場刺激に対する応答性は、これらの細胞の[Na⁺]_i 測定にとって重要です。さらに、長い調製(色素負荷)と実験期間(キャリブレーション)には、優れた品質の心房筋細胞を生成する単離プロトコルが必要です。マウス心房のサイズが小さく、細胞間マトリックスの組成であるため、高品質の成体マウス心房筋細胞の単離は困難です。ここでは、最適化されたLangendorff灌流ベースの単離プロトコルについて述べます。これにより、高品質の心房性マウス筋細胞を一貫して高収率で実現します。

ナトリウム結合性ベンゾフランイソフタレート(SBFI)は、最も一般的に使用される蛍光Na⁺ インジケーターです。SBFIは、ガラスピペットを介して塩の形で、または筋細胞のサルコレンマル膜を貫通できるアセトキシメチル(AM)エステルとして心筋細胞にロードできます。細胞内では、SBFI-AMは細胞質エステラーゼによって脱エステル化されます。膜の浸透と細胞質の脱エステル化にはばらつきがあるため、各細胞はin situでキャリブレーションする必要があります。通常、SBFI全細胞落射蛍光を用いた[Na⁺]_i の測定は、光電子増倍管(PMT)を用いて行われます。この実験装置では、一度に測定できる細胞は1つだけです。筋細胞色素のロード量の長さと各実験後のキャリブレーションにより、データ収率は低くなります。そこで、EMCCDカメラを用いた[Na⁺]_iの測定技術を開発しました。このアプローチにより、複数の筋細胞での同時[Na⁺]_i 測定が可能になり、実験の収率が大幅に向上します。

概要

心房疾患(心房細動[AF]など)では、細胞内^Ca2+シグナル伝達が大きく変化します¹。心房細動における「リモデリングされた」細胞内Ca²⁺シグナル伝達の根底にあるメカニズムの多くは^{十分に特徴付けられ}ていますが^2,3、細胞内ナトリウム濃度の変化が果たす役割についてはよく理解されていません。[^NA+]_iは細胞内Ca²⁺の重要な調節因子です。[Na⁺]_iの研究は、サルコレンマルNa⁺/Ca²⁺交換体(NCX)の活性化、Na⁺チャネルの挙動、およびNa⁺,K⁺-ATPase(NKA)⁴についての洞察を提供することができます。心房活性化率が高いと、心房の活性化率が高いと [Na⁺]_i ¹ が有意に減少することを示しました。以前の研究では、AF³ における NCX 電流密度 (I_NCX) およびタンパク質発現レベルの増加が示されています。また、心房細動患者から単離された心房筋細胞における電位依存性Na⁺電流(I_Na、後期)の後期成分の増加も報告された⁵。したがって、AFにおける細胞内Na⁺恒常性に重大な変化があるという証拠があります。したがって、AFの病理の理解を深めるためには、単離された心房筋細胞における[Na⁺]_iの信頼性と再現性のある測定が必要です。ここでは、[Na⁺]_iの測定に適した高品質のマウス心房筋細胞を再現性よく単離する方法を示します。心房細動のトランスジェニック(TG)マウスモデルが心房細動研究の重要な部分になっているため、最適化された心房細胞単離プロトコルをマウス心房筋細胞に焦点を当てました⁶。これらのマウスは、多くの場合、限られた数しか入手できず、心房はしばしば線維化しており、細胞単離の課題につながります。

一般に、生細胞中の[Na⁺]_iは、蛍光指示薬^7,8、または異なるタイプの微小電極⁹を用いて測定することができる。微小電極ベースの技術では、サルコレマル膜の浸透が必要です。したがって、この技術はより大きな細胞に限定されており、細胞の完全性が容易に損なわれる小さくて狭い心房筋細胞には適していません。

ナトリウム結合性ベンゾフランイソフタレート(SBFI)は、Na^{+ 7}を結合すると大きな波長シフトを受ける蛍光インジケーターです。SBFIは340 nmと380 nmで交互に励起され、発光フィルター(510 nm)を通過した後に放出された蛍光が収集されます。2つの励起波長(F_340/380)での信号の比率は、局所的な光路長、色素濃度、および波長に依存しない照明強度と検出効率の変動を相殺することができます。既知のナトリウム濃度([Na⁺])の溶液を使用してin situキャリブレーションを各セルで実施すると、実験中に得られたF_340/380比により、[Na⁺]_iの正確で高感度な測定値が得られます。すべてのNa⁺指標と同様に、SBFIもK⁺に対してある程度の親和性を示しています_。 ここに示すキャリブレーション方法を使用すると、キャリブレーションプロセス中に[Na⁺]_iと細胞内カリウム濃度([K⁺]_i)を確実に「クランプ」できるため、[K⁺]_i ¹⁰の<10%であっても[Na⁺]_iを確実にキャリブレーションできます。

SBFIを使用した[Na⁺]_iのレシオメトリック測定のための新しいEMCCDカメラベースの技術を紹介します。EMCCDカメラは、初めて、複数のセルで[Na⁺]_iの同時測定(およびキャリブレーション)を可能にしました。これは、動物の数が限られている実験環境(トランスジェニックマウスモデルなど)で特に有益です。通常、SBFIを用いた[Na⁺]_i測定は、光電子増倍管(PMT)を用いて全細胞落射蛍光を採取します^1,11。PMTは蛍光シグナルの時間分解能が非常に優れていますが、空間分解能は非常に低く、実験は一度に1つの細胞に限定されます。

当社の新しいプロトコルは、[Na⁺]_iの再現性と感度の高い測定を容易にします。これは、複数のマウス心房筋細胞における[Na⁺]_i の変化の同時取得に最適化されていますが、他の多くの細胞タイプにも適応可能です。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、メリーランド大学ボルチモア校の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 成体マウスの心臓からの心房筋細胞の単離

1. 各マウスを精密気化器と100%酸素中のイソフルランでガス化した誘導チャンバーに入れます。
2. 動物が反応しなくなるまでイソフルランの流れを1%に設定してから、安楽死の15分前に腹腔内(IP)ヘパリン注射(1〜1.25 U / g)を行います。.
3. イソフルラン麻酔を5%に増やしてマウスに深く麻酔をかけ、足をつまんで麻酔の深部面を確認します。
4. 迅速な開胸術¹²を行うことにより、安楽死を行います。標準的なパターンの鉗子と手術用ハサミを使用して胸部を開きます。心臓と肺を受動的に動員し、大動脈弓を分離し、鉗子で保持し、大動脈を切って心臓を取り除きます。
5. 心臓を氷冷した名目上のCa²⁺フリー細胞単離バッファー(CIB、 表1)に置きます。
6. 22Gカニューレで大動脈をカニューレし、CIB溶液中で3倍に拡大した光学顕微鏡下でシルク縫合糸を使用して結びます(図1A、B)。
7. シリンジに接続されたカニューレを介してCIB溶液を送達することにより、カニューレが大動脈洞のかなり上にあることを確認し、顕微鏡下で冠状動脈灌流を確認します。
   注:このステップは、マウス¹³で冠状動脈の解剖学的構造が非常に変動することが示されているため、心房組織の適切な灌流を確保するために重要です。
8. 重力ベースのランゲンドルフセットアップに心臓を装着し、Ca²⁺フリーCIB溶液で37°Cで5分間灌流し、溶出液が透明になるまで残りの血液を洗い流します(図1C)。
9. 酵素溶液(表2)に切り替え、心房組織が柔らかく弛緩するまで37°Cで3〜5分間灌流します。
10. スーパーグリップ鉗子と小型スプリングハサミを使用して左右の心房を切除し、ステップ1.8で使用したCIB酵素溶液を含む0.15 mM CaCl₂ を含む小さな培養皿に移し、37°Cのインキュベーターに5〜8分間入れます(図1D)。
11. 心房を4 mLの予熱済み(37°C)保存溶液(15 mMのウシ血清アルブミンと30 mMの2,3-ブタンジオン一酸素を含む改変チロード溶液(表3))を含む細胞培養皿に移します。
12. 小さなスプリングハサミとスーパーグリップ鉗子を使用して、心房を小さな組織ストリップ(心房のサイズに応じて10〜20)に切ります。
13. 機械的な解離のために、2〜5mmの開口部を持つさまざまなファイヤーポリッシュガラスパスツールピペットを使用して、組織懸濁液を穏やかに吸引します。最大のピペットチップから始めて、最小のピペットチップに移動し、ピペットごとに5〜10回吸引します。
14. 細胞懸濁液を200 μmフィルターで濾し、CaCl₂ を10分ごとに3回添加して、最終濃度0.3 mMにします。

2. 細胞品質の評価

1. 新たに分離した心房筋細胞を含む細胞懸濁液200μLをガラスカバースリップの上に置きます。
2. 10倍対物レンズを使用して、視野内のすべてのセルをカウントし、丸みを帯びたセルまたは棒状に分類します。明確な交差縞模様を示す棒状のセルの数を決定します (これが決定するのが難しい場合は、 図 2C を参照の 25x 対物レンズに切り替えます)。
3. 手順 2.1 から 2.2 を繰り返します。
4. 丸みを帯びた、棒状、および明確な交差縞模様セルを持つ棒状のパーセンテージを計算します。
5. 細胞の80%が棒状になり、明確な交差縞模様になるまで、細胞単離手順を変更します。
6. 心房細胞懸濁液500μLをラミニンコーティングされたガラスカバースリップに置き、細胞チャンバーを倒立顕微鏡に置きます。細胞を5分間落ち着かせます。1.8 mM Ca²⁺を含むTyrodeの溶液で灌流します。
7. 細胞刺激システムを使用して、0.5 Hzで電界刺激(2 ms バイポーラパルス、30 V)を開始し、10倍対物レンズの視野内で収縮する細胞の数をカウントします。
8. 3 Hzの外部電界刺激で繰り返します。
9. 0.5Hzおよび3Hzの刺激速度に応答する細胞の割合を計算します( 図2Bを参照)。細胞の50%が3Hzのフィールド刺激に応答するまで、細胞単離プロトコルを改良します。

3. 新たに単離したマウス心房筋細胞のNa⁺ インジケーターローディング

1. 蛍光指示薬ナトリウム結合ベンゾフランイソフタレート(SBFI-AM)の細胞透過性アセトキシメチル(AM)エステルを使用してください。
2. 色素の分散を促進し、均一な細胞負荷を達成するために、SBFIをジメチルスルホキシド(DMSO)および適切な界面活性剤ポリオール(プルロン酸など)に溶解して、細胞懸濁液中の最終濃度10 μM SBFIを達成します。
3. 室温でロッカーの光から保護されたSBFIをセルに60分間ロードします。
4. 細胞を30分間静置し、上清を取り除き、ペレットを保存溶液(1〜2 mL)に再懸濁します。
   注:実験は、細胞単離後4時間以内に実施する必要があります。BDMは、実験開始前にTyrodeの溶液による灌流によって洗い流されます¹⁴。

4. 計装、[Na⁺]_i 測定、および[Na⁺]_i キャリブレーション

注: 図3 は、実験装置の光路の概略図を示しています。

1. 表4〜6に示すように、Na⁺濃度を増加させたキャリブレーション溶液を調製します。
2. 透過処理剤グラミシジンD(10 μM、-20 °Cで保存したストック溶液から)とNa⁺、K⁺ ATPアーゼ阻害剤のストロファンチジン(100 μM、-20°Cで保存したストック溶液から)を各キャリブレーション溶液に加えます。よく渦巻くか、超音波発生器を使用してグラミシジンとストロファンチンが完全に溶解していることを確認します。
3. ステップ4.1および4.2で調製した増加する[Na⁺]_o を含むキャリブレーション溶液をマルチバレル灌流システムに充填します。低速の灌流速度(~1 mL/分、灌流速度は細胞チャンバーの容量により変動します)を使用して細胞チャンバーに接続します。
4. 吸引をセルチャンバーに接続し、床の適切な(ガラス)容器に灌流液を回収します。
5. 灌流と吸引を停止します。
6. SBFIの脱エステル化を30分間行った後、濃縮(ステップ3.5)した色素充填細胞懸濁液100 μLを、倒立顕微鏡の40倍対物レンズの視野の上にあるラミニンコーティングガラスカバースリップの上に置きます。
7. 300 Wのキセノン光源を備えた高速スイッチングイルミネーターを使用してください。高速スイッチング走査ミラーと狭帯域幅励起フィルター(340 nm ± 10 nm、380 nm ± 10 nm)を使用して、2つの励起波長(340 nmと380 nm)で広視野イメージングを実現します。
8. EMCCDカメラの視野を最適化します。観測エリアが広いほど、フレーム時間が長くなります。フレーム時間が長いと、インジケーターの漂白が増加します。したがって、プローブの目立った漂白が発生しないように、視野サイズとフレーム時間のバランスを取ります。
9. SBFIがロードされていない心房細胞のサブセットでは、細胞の固有蛍光がバックグラウンド蛍光と類似していることを確認することにより、内因性蛍光が最小限であるかどうかを判断します( 図4を参照)。
10. 実験デザインに応じて適切なサンプリングレートを決定します([Na⁺]_i の変化が比較的遅いため、サンプリングレートが低くなることがあります(例:10〜20秒ごとに1つのデータポイントを取得)。
11. 励起光を減衰させるには、適切なND(ND)フィルターを使用し、光源の強度を適切に下げます(オペレーティングソフトウェアで強度を変更するなど)。
12. 倒立顕微鏡に接続されたEMCCDカメラで適切なフィルターを使用して、510 nm±40 nmで発光光を収集します。
13. 各セルの関心領域 (ROI) とバックグラウンド ROI を定義します ( 図 4 を参照)。記録されたF₃₄₀ およびF₃₈₀ 信号からバックグラウンドを差し引きます(オンラインまたはデータ解析中)。
14. データ集録を開始します。
15. 灌流と吸引を再開します。1.8 mM Ca²⁺ を含むTyrode溶液で10〜15分間灌流し、実験を開始する前に安定したF_340/380 ベースラインを記録します。
    注意: 安定したベースラインを10〜15分間記録してください。漂白が発生した場合(F_340/380 ベースラインの減少など)、NDフィルター密度を上げるか、励起光信号強度および/または取得フレーム時間を減らすことにより、照明強度をさらに減衰させることを目指します(手順4.10〜4.11を参照)。
16. 研究課題に応じて[Na⁺]_i 測定を開始します。

5. [Na⁺]_i キャリブレーション

1. 実験の終了後(ステップ4.16)、各細胞in situでF_340/380 シグナルのキャリブレーションを行います。
2. SBFIをロードした筋細胞にキャリブレーション溶液(ステップ4.1〜4.3で調製)を灌流することにより、F_340/380 シグナルをキャリブレーションします。
3. 段階的に灌流して、[Na⁺]_o を0mMから20mMに上昇させます。F_340/380 信号が安定するのを待ってから、次の濃度に移動します(流量に応じて ~5 分、 図 3B と 図 5A を参照)。
   注意: F_340/380信号の有効なキャリブレーションのためには、F 340/₃₈₀信号とキャリブレーション溶液の[Na ⁺]との関係は線形である必要があります(図5および図6)。

結果

心房細胞の品質評価
新たに単離された心房筋細胞は、6つの連続した心房細胞単離のプロトコルで概説されているように、細胞形態および野外刺激に対する応答性に基づいて評価された。 図2 に示すデータは、桿状心房筋細胞の割合が非常に高いことを示しており、明確な交差縞模様を保持しています。?...

ディスカッション

ここでは、ナトリウム結合ベンゾフランイソフタレート(SBFI)を使用して、複数の生存可能な心房筋細胞の[Na⁺]_i を同時に定量的に測定するための新しいEMCCDカメラベースの技術を紹介します。ここで説明するアプローチは、複数の細胞で[Na⁺]_i を同時に測定できる最初のアプローチです。この新しいプロトコルがもたらす主な利点は、(i)...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm