Измерения внутриклеточного [Na+] в миоцитах предсердий мышей с помощью камер

Резюме

Внутриклеточная концентрация Na⁺ ([Na⁺]_i) в сердечных миоцитах изменяется при сердечных заболеваниях. [На⁺]_i является важным регулятором внутриклеточного Ca2⁺. Мы представляем новый подход к измерению [Na⁺]_i в недавно выделенных миоцитах предсердий мышей с использованием камеры устройства с заряженной связью, умножающего электроны (EMCCD), и быстрого, управляемого осветителя.

Аннотация

Внутриклеточная концентрация натрия ([Na⁺]_i) является важным регулятором внутриклеточного Ca2⁺. Его исследование дает представление об активации сарколеммального обменника Na⁺/Ca²⁺ , поведении потенциал-зависимых каналов Na⁺ и Na⁺,K⁺-АТФазы. Внутриклеточная передача сигналов Ca²⁺ изменяется при заболеваниях предсердий, таких как фибрилляция предсердий. В то время как многие механизмы, лежащие в основе измененного внутриклеточного гомеостаза Ca2⁺ , охарактеризованы, роль [Na⁺]_i и его дисрегуляция при патологиях предсердий плохо изучены. [На⁺]_I в миоцитах предсердий увеличивается в ответ на увеличение скорости стимуляции. Таким образом, реакция на стимуляцию внешним полем имеет решающее значение для измерений [Na⁺]_i в этих клетках. Кроме того, длительная подготовка (загрузка красителя) и продолжительность эксперимента (калибровка) требуют протокола выделения, который позволяет получить миоциты предсердий исключительного качества. Из-за небольшого размера предсердий мышей и состава межклеточного матрикса выделение высококачественных миоцитов предсердий взрослых мышей затруднено. В данной статье мы описываем оптимизированный протокол выделения на основе перфузии Лангендорфа, который неизменно обеспечивает высокий выход высококачественных предсердных мышиных миоцитов.

Натрий-связывающий бензофуранизофталат (SBFI) является наиболее часто используемым флуоресцентным индикатором Na⁺ . SBFI может быть загружен в сердечный миоцит либо в солевой форме через стеклянную пипетку, либо в виде ацетоксиметилового (AM) эфира, который может проникать через сарколеммальную мембрану миоцита. Внутриклеточно, SBFI-AM деэтерифицируется цитозольными эстеразами. Из-за различий в проникновении через мембрану и цитозольной деэтерификации каждая клетка должна быть откалибрована in situ. Как правило, измерения [Na⁺]_i с использованием целоклеточной эпифлуоресценции SBFI выполняются с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Эта экспериментальная установка позволяет одновременно измерять только одну клетку. Из-за длительности загрузки миоцитарного красителя и калибровки после каждого эксперимента выход данных невелик. Поэтому мы разработали метод измерения [Na⁺]_i на основе камеры EMCCD. Этот подход позволяет проводить одновременные измерения [Na⁺]_i в нескольких миоцитах, что значительно увеличивает экспериментальный выход.

Введение

При заболеваниях предсердий (например, фибрилляции предсердий [ФП]) внутриклеточная передача сигналов^Ca2+ глубоко изменена¹. В то время как многие из основных механизмов «ремоделируемой» внутриклеточной передачи сигналов^Ca2+ при ФП хорошо охарактеризованы ^2,3, роль, которую может играть измененная внутриклеточная концентрация натрия ([Na⁺]_i), плохо изучена. [На⁺]_i является важным регулятором внутриклеточного Ca2⁺. Изучение [Na⁺]_i может дать представление об активации сарколеммального обменника Na⁺/^Ca2+ (NCX), поведении каналов Na⁺ и Na⁺,K⁺-АТФазы (NKA)⁴. Ранее мы показали, что высокая частота активации предсердий, как это происходит во время ФП, приводит к значительному снижению [Na⁺]_i ¹. Предыдущая работа показала увеличение плотности тока NCX (I_NCX) и уровня экспрессии белка при ФП³. Также^{сообщалось об} увеличении поздней составляющей потенциал-зависимого тока Na⁺ (I_{Na, поздняя)} в изолированных миоцитах предсердий у пациентов с ФП 5. Таким образом, имеются данные о глубоких изменениях внутриклеточного Na⁺ гомеостаза при ФП. Таким образом, для углубления нашего понимания патологии ФП необходимы надежные и воспроизводимые измерения [Na⁺]_i в изолированных миоцитах предсердий. В этой статье мы продемонстрируем, как воспроизводимо изолировать высококачественные миоциты предсердий мышей, пригодные для измерения [Na⁺]_i. Мы сосредоточили наш оптимизированный протокол выделения клеток предсердий на мышиных миоцитах предсердий, поскольку трансгенные (ТГ) мышиные модели фибрилляции предсердий стали жизненно важной частью исследований ФП⁶. Эти мыши часто доступны только в ограниченном количестве, а предсердия часто фиброзны, что затрудняет выделение клеток.

В общем случае, [Na⁺]_i в жизнеспособных клетках можно измерять с помощью флуоресцентных индикаторов ^7,8 или с помощью различных типов микроэлектродов⁹. Методики на основе микроэлектродов требуют проникновения через сарколеммальную мембрану. Таким образом, этот метод ограничен более крупными клетками и не подходит для малых и узких миоцитов предсердий, целостность клеток которых легко нарушается.

Натрий-связывающий бензофуранизофталат (SBFI) является флуоресцентным индикатором, который претерпевает большой сдвиг длины волны при связывании Na^{+ 7}. SBFI попеременно возбуждается на длинах волн 340 нм и 380 нм, а излучаемая флуоресценция собирается после прохождения через эмиссионный фильтр (510 нм). Отношения сигналов на двух длинах волн возбуждения (F_340/380) могут компенсировать локальную длину трассы, концентрацию красителя и независимые от длины волны изменения интенсивности освещения и эффективности детектирования. При проведении калибровки in situ с использованием растворов с известной концентрацией натрия ([Na⁺]) в каждой ячейке соотношение F_340/380, полученное в ходе эксперимента, позволяет получить точные и чувствительные измерения [Na⁺]_i. Как и все индикаторы Na⁺, SBFI также проявляет некоторое сродство к K⁺_. Использование показанного здесь метода калибровки позволяет надежно «зажать» [Na⁺]_i и внутриклеточную концентрацию калия ([K⁺]_i) в процессе калибровки, чтобы [Na⁺]_i можно было надежно откалибровать, даже когда она составляет <10% от [K⁺_]i ¹⁰.

Мы представляем новую технику на основе камеры EMCCD для ратиометрических измерений [Na⁺]_i с использованием SBFI. Камера EMCCD впервые позволяет проводить одновременные измерения (и калибровку) [Na⁺]_i в нескольких ячейках. Это особенно полезно в экспериментальных условиях, где количество животных ограничено (например, на трансгенных моделях мышей). Как правило, измерения [Na⁺]_i с использованием SBFI выполняются с помощью фотоумножителя (ФЭУ) для сбора эпифлуоресценции всей клетки ^1,11. В то время как ФЭУ обеспечивают очень хорошее временное разрешение сигнала флуоресценции, пространственное разрешение очень низкое, и эксперименты ограничены одной клеткой за раз.

Наш новый протокол обеспечивает высоковоспроизводимые и чувствительные измерения [Na⁺]_i. Он оптимизирован для одновременной регистрации изменений [Na⁺]_i в нескольких миоцитах предсердий мышей, но может адаптироваться ко многим другим типам клеток.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Мэриленд в Балтиморе.

1. Выделение миоцитов предсердий из сердца взрослых мышей

1. Поместите каждую мышь в прецизионный испаритель и индукционную камеру, насыщенную изофлураном со 100% кислородом.
2. Установите подачу изофлурана на 1% до тех пор, пока животное не перестанет реагировать, перед внутрибрюшинной инъекцией гепарина (1–1,25 ЕД/г) за 15 минут до эвтаназии.
3. Глубоко обезболить мышь, увеличив дозу изофлурана до 5% и подтвердить глубокую плоскость анестезии путем щипкования стопы.
4. Провести эвтаназию путем выполнения быстрой торакотомии¹²; Используйте щипцы стандартного образца и хирургические ножницы, чтобы открыть грудную клетку. Пассивно мобилизуйте сердце и легкое, изолируйте дугу аорты, задержите щипцами и разрежьте аорту, чтобы удалить сердце.
5. Поместите сердце в ледяной буфер для выделения свободных клеток Ca²⁺ ( CIB, табл. 1).
6. Канюляцию аорты с помощью канюли 22 G и завязку с помощью шелкового шва под световым микроскопом с 3-кратным увеличением в растворе CIB (рис. 1A, B).
7. Убедитесь, что канюля находится значительно выше аортальных синусов, подав раствор CIB через канюлю, подключенную к шприцу, и подтвердите перфузию коронарных артерий под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для обеспечения надлежащей перфузии предсердной ткани, поскольку было показано, что анатомия коронарных артерий сильно вариабельна у мышей¹³.
8. Установите сердце на гравитационную установку Лангендорфа и перфузируйте раствором CIB без Ca²⁺ в течение 5 минут при 37 °C, чтобы смыть оставшуюся кровь до тех пор, пока элюат не станет прозрачным (Рисунок 1C).
9. Переключитесь на ферментативный раствор (табл. 2) и перфузируйте в течение 3–5 мин при 37 °С, пока ткань предсердий не станет мягкой и вялой.
10. Иссеките правое и левое предсердия с помощью щипцов с суперзахватом и маленьких пружинных ножниц и переложите в небольшую чашку для культуры, содержащую ферментативный раствор CIB, используемый на шаге 1.8, но с 0,15 мМ CaCl₂ , и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 5–8 минут (рис. 1D).
11. Перенесите предсердия в чашку для клеточной культуры, содержащую 4 мл предварительно подогретого (37 °С) раствора для хранения (модифицированный раствор Тироде (табл. 3), содержащий 15 мМ бычьего сывороточного альбумина и 30 мМ 2,3-бутандиона моноксима).
12. Разрежьте предсердия на небольшие полоски ткани (10–20, в зависимости от размера предсердий) с помощью маленьких пружинных ножниц и щипцов с суперзахватом.
13. Для механической диссоциации аккуратно отсасывают тканевую суспензию с помощью различных пипеток Пастера с полированным пламя стеклом с отверстиями от 2 до 5 мм. Начните с самого большого наконечника пипетки и переходите к самому маленькому наконечнику пипетки, отсасывая 5–10 раз на пипетку.
14. Процедите клеточную суспензию через фильтр 200 мкм и добавьте CaCl₂ три раза каждые 10 мин до достижения конечной концентрации 0,3 мМ.

2. Оценка качества клеток

1. Поместите 200 мкл клеточной суспензии, содержащей только что выделенные миоциты предсердий, на стеклянную покровную крышку.
2. Используйте 10-кратный объектив, чтобы подсчитать все ячейки в поле зрения и классифицировать их как округлые или стержневые. Определите, сколько стержневых ячеек демонстрируют четкую поперечную бороздку (переключитесь на объектив 25x, если это трудно определить, см. рисунок 2C).
3. Повторите шаги 2.1–2.2.
4. Рассчитайте процентное соотношение округлых, стержневых и стержневых ячеек с четкими поперечными бороздками.
5. Модифицируйте процедуру выделения клеток до тех пор, пока 80% клеток не приобретут палочковидную форму с четкой поперечной бороздкой.
6. Поместите 500 мкл суспензии клеток предсердий на стеклянную защитную крышку с ламининовым покрытием и поместите камеру клетки на инвертированный микроскоп. Дайте ячейкам отстояться в течение 5 минут. Перфузируйте раствором Тирода, содержащим 1,8 мМ Ca²⁺.
7. Используйте систему клеточного стимулятора для стимуляции электрического поля (биполярный импульс 2 мс, 30 В) с частотой 0,5 Гц и подсчитайте количество клеток, которые сокращаются в поле зрения объектива с 10-кратным увеличением.
8. Повторите с стимуляцией внешнего поля с частотой 3 Гц.
9. Рассчитайте процент клеток, реагирующих на частоту стимуляции 0,5 и 3 Гц (см. рисунок 2B). Совершенствуйте протокол изоляции клеток до тех пор, пока 50% клеток не отреагируют на стимуляцию полем 3 Гц.

3. Индикаторная нагрузка Na⁺ свежевыделенных миоцитов предсердий мышей

1. Используйте в качестве клеточного перцензента ацетоксиметиловый (АМ) эфир флуоресцентного индикатора натрия-связывающего бензофуранизофталата (SBFI-AM).
2. Для облегчения диспергирования красителей и достижения однородной нагрузки в клетках растворяют SBFI в диметилсульфоксиде (ДМСО) и подходящих полиолах поверхностно-активных веществ (например, плуроновых) для достижения конечной концентрации 10 мкМ SBFI в клеточной суспензии.
3. Загрузите элементы с SBFI на 60 мин в защищенном от света месте на коромысле при комнатной температуре.
4. Дайте клеткам отстояться в течение 30 минут, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в накопительном растворе (1–2 мл).
   Примечание: Эксперименты должны быть проведены в течение 4 часов после выделения клеток. BDM вымывается перфузией раствором Tyrode до начала экспериментов¹⁴.

4. Контрольно-измерительные приборы, измерения [Na⁺]_i и калибровка [Na⁺]_i

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показана схема пути света для экспериментального прибора.

1. Приготовьте калибровочные растворы с возрастающими концентрациями Na⁺ , как описано в таблицах 4–6.
2. В каждый калибровочный раствор добавляют проникающий агент грамицидин D (10 мкМ; из исходного раствора, хранящегося при -20 °С) и ингибитор Na⁺, K⁺ АТФазы строфантидин (100 мкМ, из исходного раствора, хранящегося при -20 °С). Хорошо проведите вихрь, или используйте ультразвуковую терапию, чтобы убедиться, что грамицидин и строфантидин полностью растворились.
3. Заполните многоцилиндровую перфузионную систему калибровочными растворами, содержащими увеличивающийся [Na⁺]_o, приготовленный на этапах 4.1 и 4.2. Подключайтесь к камере ячейки с использованием медленной скорости перфузии (~1 мл/мин; скорость перфузии может варьироваться в зависимости от объема камеры ячейки).
4. Подключите отсос к камере камеры и соберите перфузат в соответствующую (стеклянную) емкость на полу.
5. Остановите перфузию и отсасывание.
6. После 30-минутной деэтерификации SBFI поместите 100 мкл концентрированной (шаг 3,5) суспензии клеток, загруженной красителем, на стеклянную защитную крышку с ламининным покрытием над полем зрения объектива инвертированного микроскопа с 40-кратным увеличением.
7. Используйте быстро переключающийся осветитель с ксеноновым источником света мощностью 300 Вт. Получение широкоугольной визуализации с двумя длинами волн возбуждения (340 нм и 380 нм) с помощью быстро переключающихся сканирующих зеркал и узкополосных фильтров возбуждения (340 нм ± 10 нм; 380 нм ± 10 нм).
8. Оптимизируйте поле зрения камеры EMCCD. Чем больше область наблюдения, тем больше времени кадра. Более длительное время кадрирования приводит к большему обесцвечиванию индикатора. Таким образом, сбалансируйте размер поля зрения и время кадра, чтобы не произошло заметного обесцвечивания пробника.
9. Определите, что в подмножестве клеток предсердий, которые не загружены SBFI, существует только минимальная внутренняя флуоресценция, убедившись, что внутренняя флуоресценция клеток аналогична фоновой флуоресценции (как показано на рисунке 4).
10. Определите подходящую частоту дискретизации в зависимости от плана эксперимента (частота дискретизации может быть низкой, поскольку изменения [Na⁺]_i происходят относительно медленно (например, одна точка данных собирается каждые 10–20 с).
11. Ослабляйте возбуждающий свет с помощью соответствующих фильтров нейтральной плотности (ND) и соответствующего снижения интенсивности источника света (например, путем изменения интенсивности в операционном программном обеспечении).
12. Соберите излучение света на длине волны 510 ± 40 нм с помощью соответствующих фильтров с камерой EMCCD, подключенной к инвертированному микроскопу.
13. Определите область интереса (ROI) для каждой ячейки и фоновую ROI (см. рис. 4). Вычтите фон из записанных сигналов F₃₄₀ и F₃₈₀ (в режиме онлайн или во время анализа данных).
14. Запустите сбор данных.
15. Возобновите перфузию и отсасывание. Перед началом эксперимента проводят в течение 10–15 мин раствором Тайрода, содержащим 1,8 мМ Ca²⁺ и регистрируют стабильный исходный уровень F_340/380 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно запишите стабильную базовую линию в течение 10–15 минут. Если происходит обесцвечивание (например, снижение базовой линии F_340/380 ), попытайтесь еще больше ослабить интенсивность освещения либо путем увеличения плотности нейтрального фильтра, либо уменьшения интенсивности светового сигнала возбуждения и/или времени захвата кадра (см. шаги 4.10–4.11).
16. Начните измерение [Na⁺]_i в соответствии с вопросом исследования.

5. _{Калибровка} [Na⁺]i

1. После завершения эксперимента (шаг 4.16) выполните калибровку сигнала F_340/380 в каждой ячейке in situ.
2. Откалибруйте сигнал F_340/380 путем перфузии миоцитов, загруженных SBFI, с калибровочными растворами (приготовленными на шагах 4.1–4.3).
3. Перфузируйте ступенчато для повышения [Na⁺]_o от 0 до 20 мМ. Дождитесь стабильного сигнала F_340/380 перед переходом к следующей концентрации (~5 минут в зависимости от расхода; см. Рисунок 3B и Рисунок 5A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение между сигналом F_340/380 и [Na⁺] калибровочных растворов должно быть линейным для корректной калибровки сигнала F_340/380 (Рисунок 5 и Рисунок 6).

Результаты

Оценка качества клеток предсердий
Свежевыделенные миоциты предсердий оценивали на основе морфологии клеток и их реакции на полевую стимуляцию, как указано в протоколе, в шести последовательных выделениях клеток предсердий. Данные, предс...

Обсуждение

В данной работе мы представляем новую методику на основе камеры EMCCD для одновременного количественного измерения [Na⁺]_i в множественных жизнеспособных миоцитах предсердий с использованием изофталата бензофурана, связывающего натрий (SBFI). Описанный здесь п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
340 Excitation Filter	Chroma	ET40X	25 mm
380 Excitation Filter	Chroma	ET80X	25 mm
510 Emission Filter	Chroma	ET510/80m	25 mm
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Bubble trap	BD Medical Technologies	904477	Custom made from a 5 ml Luer Lok Syringe, which is located in the tubing path from the perfusing solution to the cannula
CaCl2 solution	Sigma-Aldrich	21115
Cannula	BD Medical Technologies	305167	Custom made from a 22 G x 1 1/2 inch needle. Cut to 1 inch and sand 1mm distal tip.
Cell Chamber			Custom machined with an opening that can securely hold a 25 mm glass cover slip and with a cover that has an inlet and an outlet port for perfusion.
Circulating Water Bath	VWR
Collagenase II	Worthington	LS004176	Specific activity 290 U/g
Creatinine	Sigma-Aldrich	C0780
DG5-plus illuminator	Sutter Instrument	Lambda DG-4/DG-5 Plus
DMSO	Thermo Fischer	BP231
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
EMCCD camera	Princeton Instruments	ProEM-HS
Fine Hemostats	Fine Science Tools	130-20
Fine Scissors	Fine Science Tools	14060-10
Forceps Supergrip	Fine Science Tools	00632-11
Glass Cover slips	VWR	4838089	25 mm circle
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Gramicidin D	Sigma-Aldrich	G5002
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Inner silicon Tubing	VWR		VWRselect brand silicon tubing
Inverted microscope	Nikon Instruments	NikonTE 2000 U
Isolation Tools
K Gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
KCI	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Calbiochem	529568
Langendorff perfusion apparatus
MgCl2.6H2O *	Sigma-Aldrich	M0250
MyoPacer Cell Stimulator	IonOptix
Na Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9390
Natural Mouse Laminin	Thermo Fischer	23017015	0.5-2.0 mg/ml
Outer tubing	VWR
Petri dish 35X10 mm	Falcon	351008
PowerLoad	Thermo Fischer	P10020
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
SBFI-AM	Thermo Fischer	S1264
Silk suture	Fine Science Tools	18020-50	0.12 mm diameter
Small Spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Strophanthidin	Sigma-Aldrich	G5884
Surgical Scissors Tough Cut	Fine Science Tools	14054-13
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	00272-13
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trisbase	Sigma-Aldrich	TRIS-RO
Trypsin	Sigma-Aldrich	T0303
UVFS Reflective 0.1 ND Filter	Thorlabs	NDUV01B	25 mm
UVFS Reflective 0.2 ND Filter	Thorlabs	NDUV02B	25 mm
UVFS Reflective 0.3 ND Filter	Thorlabs	NDUV03B	25 mm
UVFS Reflective 0.5 ND Filter	Thorlabs	NDUV05B	25 mm
UVFS Reflective 1 ND Filter	Thorlabs	NDUV010B	25 mm