تقييم حالة الإخصاب من خلال تتبع المورفولوجيا النووية للنطفو النووي للنطفو في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبوسيس

Summary

نحن نبرهن على طريقة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل على أساس مورفولوجيا الحيوانات المنوية النووية في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس باستخدام مجهر الظهارة.

Abstract

النباتات المزهرة لديها نظام استنساخ جنسي فريد يسمى "الإخصاب المزدوج"، حيث كل من خلايا الحيوانات المنوية الصمامات على وجه التحديد مع خلية البيض أو خلية مركزية. وهكذا، يحدث حدثان مستقلان للإخصاب في وقت واحد تقريبا. تتطور خلية البويضة المخصبة والخلية المركزية إلى الزيجوت والحيوانات المنوية، على التوالي. ولذلك، فإن السيطرة الدقيقة على الإخصاب المزدوج أمر ضروري لتطوير البذور الناجمة عن ذلك. يحدث الإخصاب المزدوج في اللجامفيت الإناث (كيس الجنين)، والتي هي مخبأة بعمق ومغطاة بأنسجة البويضة والمبيض سميكة. هذا البناء الأنسجة pistil يجعل مراقبة وتحليل الإخصاب المزدوج من الصعب جدا، وخلق الوضع الحالي الذي العديد من الأسئلة المتعلقة بآلية الإخصاب المزدوج لا تزال دون إجابة. وللتقييم الوظيفي لمرشح محتمل لتنظيم الإخصاب، من المهم إجراء تحليل للإخصاب. للحكم على الانتهاء من الإخصاب في التلاحيّة العربية، تُستخدم أشكال إشارات الفلورة التي تصف نوى الحيوانات المنوية كمؤشرات. يشار إلى خلية الحيوانات المنوية التي تفشل في الإخصاب بإشارة الفلورة المكثفة خارج اللجام الإناث، في حين أن خلية الحيوانات المنوية التي يتم إخصابها بنجاح يشار إليها بإشارة منزوعة المكثف بسبب karyogamy مع نواة اللجام الإناث. توفر الطريقة الموضحة هنا أداة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل في ظروف الجسم الحي.

Introduction

النباتات المزهرة تنتج البذور من خلال الإخصاب المزدوج، وهي عملية يتم التحكم فيها مباشرة من خلال التفاعلات بين البروتينات المترجمة على غشاء البلازما gamete^1،2. المزهرة نبات الذكور gametes، زوج من خلايا الحيوانات المنوية، وتطوير في حبوب اللقاح. أنبوب حبوب اللقاح الذي ينمو بعد التلقيح يسلم زوج من خلايا الحيوانات المنوية إلى اللجام الإناث، وخلية البيض والخلية المركزية، والتي تتطور في كيس الجنين. بعد أن يجتمع المدرس الذكور والإناث، والبروتينات على سطح gamete تعزيز الاعتراف، والتعلق، والانصهار لاستكمال الإخصاب المزدوج. في الدراسات السابقة، تم تحديد البروتينات غشاء الجاميت الذكور الخلية المولدةمحددة 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3،⁴ وGAMETE أعرب 2 (GEX2)⁵ كمنظمي الإخصاب المشاركة في اندماج gamete و المرفق، على التوالي. لقد حددنا مؤخرًا بروتين غشاء خاص بـ gamete للذكور، DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9)، كمنظم للإخصاب يشارك في تفاعل gamete. وجدنا أن انخفاض التعبير DMP9 يؤدي إلى تثبيط كبير من تخصيب خلايا البيض خلال الإخصاب المزدوج في A. thaliana⁶.

كما يحدث الإخصاب المزدوج في كيس الجنين، الذي هو جزء لا يتجزأ من البويضة التي هي ملفوفة أكثر مع أنسجة المبيض، فمن الصعب مراقبة وتحليل حالات عمليات الإخصاب المزدوج. ولهذا السبب، لا تزال هناك العديد من النقاط غير الواضحة التي تعوق الفهم الكامل للآلية الكاملة لمراقبة الإخصاب المزدوج. إن إنشاء تقنيات مراقبة لتتبع سلوك الغمت أثناء الإخصاب المزدوج في ظل ظروف الجسم الحي أمر لا غنى عنه للتحليل الوظيفي للمرشحين المحتملين لمنظمي الإخصاب. وقد أسفرت الدراسات الحديثة خطوط علامة حيث يتم تسمية الهياكل دون الخلوية gamete مع البروتينات الفلورية. في هذه المقالة، نقوم بإظهار بروتوكول بسيط وسريع لمراقبة الإخصاب المزدوج الذي حدث في كيس جنين مشتق من البتيلات الملقحة بشكل مصطنع. باستخدام خط علامة نواة خلية الحيوانات المنوية HTR10-mRFP⁷، يمكن التمييز بين حالة الإخصاب لكل غمت أنثى على أساس مورفولوجيا الإشارات النووية للنطفو. بروتوكولنا الذي يركز على مثل هذا التغيير المورفولوجي لنوى الحيوانات المنوية عند الإخصاب يمكن أن يحصل بكفاءة على كمية كافية من البيانات لإثبات الإحصائية. تم استخدام خط DMP9-الضربة القاضية مع خلفية HTR10-mRFP(DMP9^{KD/HTR10-mRFP)}كنباتات ذكرية لإظهار نمط تخصيب واحد. كما أن البروتوكول مناسب للتحليل الوظيفي لمنظمي الإخصاب الآخرين.

Protocol

1. التلقيح الاصطناعي

ملاحظة: قبل بدء العملية، مطلوب زوج من الملقط رقم 5.

1. تنمو A. thaliana (كول-0) في 22 درجة مئوية تحت 16 ساعة ضوء / 8-ساعة دورة مظلمة في غرفة النمو.
   ملاحظة: قطع وإزالة أول ساق زهرة المتقدمة مع مقص لتعزيز تطوير براعم الإبط. النباتات المتنامية بقوة (2-3 أسابيع بعد قطع ساق الأولى؛ ارتفاع النبات حوالي 25 سم) هي مناسبة للتحليل.
2. لإزالة السبالة (الشكل 1B) ، البتلة (الشكل 1C) ، والستايمن (الشكل 1D) من براعم الزهور في المرحلة 11⁸ (الشكل 1A) باستخدام الملقط رقم 5. برعم مع بت من بتلات ينظر في الجزء العلوي هو أفضل.
   ملاحظة: استخدام مناسبة خط علامة gamete الإناث. في هذا البروتوكول، استخدمنا نبات نوع البرية كوالد الإناث.
3. بعد 15 إلى 18 ساعة من الإنعدام، خذ الكنات من زهرة DMP9^{KD/HTR10-mRFP} في المرحلة 13⁸ عن طريق الضغط على خيوط مع ملقط.
4. للتلقيح، وبات بلطف وصمة العار من pistil المبتورة عدة مرات مع anther dehiscent.

2. إعداد الأوفيول للمراقبة

ملاحظة: البنود التالية مطلوبة: زجاج الشريحة مع الشريط على الوجهين المرفقة، No. 5 ملقط، إبرة حقن 27 G، والمجهر تشريح.

1. 7 إلى 8 ح بعد التلقيح (HAP)، وجمع pistil ووضعها على الشريط على الوجهين، ثم اضغط بلطف مع ملقط لإصلاح pistil على الشريط (الشكل2A،A').
   ملاحظة: معظم البويضات في pistil تلقي أنبوب حبوب اللقاح واحد على الأقل 10 HAP⁹. إذا فشل كل من أو أي من خلايا الحيوانات المنوية من أنبوب حبوب اللقاح الأول في الإخصاب، سيتم جذب أنبوب حبوب اللقاح الثاني من قبل البويضة بسبب نظام استعادة الإخصاب¹⁰. لتحليل مورفولوجيا نواة الحيوانات المنوية من أنبوب اللقاح الأول ، فمن المستحسن إكمال إعداد البويضة من قبل 10 HAP على أبعد تقدير.
2. قطع الطرفين العلوي والسفلي من المبيض باستخدام إبرة حقن تحت المجهر تشريح (الشكل2B،B').
3. شق جدار المبيض على طول جانبي replum (الشكل2C،C')عن طريق تحريك غيض من إبرة الحقن.
   ملاحظة: أدخل إبرة الحقن بشكل ضحل لمنع فصل البويضة من الحاجز.
4. Evert جدار المبيض باستخدام إبرة الحقن (الشكل2D،D').
5. قرصة قاعدة الحاجز الذي ترتبط البويضات، ورفعه بعناية مع ملقط (الشكل2E).
6. نقل البويضات في قطرة من الماء على زجاج الشريحة، وتغطي بلطف مع غطاء الزجاج للمراقبة تحت المجهر الفلوري (الشكل2E،E').

3. الفحص المجهري

ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمنا مجهر الظهارة مجهزة مكعب فلتر الفلورة (انظر جدولالمواد)، وكاميرا رقمية، والبرمجيات المصاحبة.

1. الحصول على صور من البويضات التي تحتوي على نوى الحيوانات المنوية المسمى مع mRFP باستخدام عدسة موضوعية 20X أو 40X والكاميرا الرقمية المجهزة.
2. تأكد من عدد نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس جنين.
   ملاحظة: يمكن تضمين البويضات التي تحتوي على اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في حجم السكان للتحليل الإحصائي.
3. تأكد من شكل وموقع كل نواة من ونواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس جنين.
   ملاحظة: مباشرة بعد إطلاق سراحمن أنبوب حبوب اللقاح، يتم ترجمة زوج من نوى الحيوانات المنوية المكثفة التي تحمل علامة mRFP بين البويضة والخلية المركزية. تشير نواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP التي تم اكتشافها على جانب نهاية التشالازال إلى تخصيب الخلايا المركزية، على سبيل المثال. باستخدام مناسبة الإناث gamete غشاء علامة خط، كما هو مبين في الشكل التكميلي 1، ما إذا كانت خلية الحيوانات المنوية تمر plasmogamy (بعد الانصهار الغشاء ولكن قبل karyogamy) يمكن رصدها بوضوح.

النتائج

تم جمع البويضات من pistil الملقحة مع DMP9^{KD/HTR10-mRFP} في 7-8 HAP ولاحظ.

تحتوي معظم البويضات على اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في خلية البويضة (الجانب المجهري) والخلية المركزية (الجانب الطرف الأخير من الشارازال) على التوا?...

Discussion

HTR10-mRFP تسميات الكروماتين الأبوي (أي، تصور نوى خلايا الحيوانات المنوية)، وقد تم الإبلاغ عن ديناميات في الإخصاب المزدوج⁷. مباشرة بعد الإفراج عن أنبوب حبوب اللقاح، لا تزال تتكثف نواة الحيوانات المنوية HTR10-mRFP المسمى. ومع ذلك، يتم إزالة المكثفات كل من نوى الحيوانات المنوية عند الان?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Olympus		Epifluorescence microscope
Cover glass	Matsunami glass	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape	Nichiban	NW-15S	15 mm width
DP72	Olympus		Degital camera
Forceps	Vigor		Any No. 5 forceps are available
Growth chamber	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7
Injection needle	Terumo	NN-2719S	27 gauge
Slide glass	Matsunami glass	S9443
SZX9	Olympus		Dissecting microscope
U-MRFPHQ	Olympus		Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x	Olympus		Objective lens (NA0.75), dry