Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Résumé

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Résumé

Les plantes à fleurs ont un système unique de reproduction sexuelle appelé « double fécondation », dans lequel chacun des spermatozoïdes fusionne précisément avec un ovule ou une cellule centrale. Ainsi, deux événements de fécondation indépendants ont lieu presque simultanément. L'ovule fécondé et la cellule centrale se développent en zygote et endosperme, respectivement. Par conséquent, un contrôle précis de la double fécondation est essentiel pour le développement des semences qui s'ensuit. La double fécondation se produit dans le gamétophyte femelle (sac d'embryon), qui est profondément caché et couvert de tissus épais d'ovule et d'ovaire. Cette construction de tissu de pistil rend l'observation et l'analyse de la double fertilisation tout à fait difficile et a créé la situation actuelle dans laquelle beaucoup de questions concernant le mécanisme de double fertilisation restent sans réponse. Pour l'évaluation fonctionnelle d'un candidat potentiel pour l'organisme de réglementation de la fécondation, l'analyse phénotypique de la fécondation est importante. Pour juger de l'achèvement de la fécondation dans Arabidopsis thaliana, les formes des signaux de fluorescence étiquetant les noyaux de sperme sont utilisés comme indicateurs. Un spermatozoïde qui ne parvient pas à féconder est indiqué par un signal de fluorescence condensé à l'extérieur des gamètes femelles, tandis qu'un spermatozoïde qui féconde avec succès est indiqué par un signal décondensé dû à la karyogamy avec le noyau des gamètes femelles. La méthode décrite ici fournit un outil pour déterminer la fécondation réussie ou échouée dans des conditions in vivo.

Introduction

Les plantes à fleurs produisent des graines par double fécondation, un processus qui est directement contrôlé par les interactions entre les protéines localisées sur la membrane plasmatique gamète^1,2. Les gamètes mâles de plante de floraison, une paire de spermatozoïdes, se développent dans le pollen. Un tube de pollen qui se développe après la pollinisation fournit une paire de spermatozoïdes aux gamètes femelles, un ovule et une cellule centrale, qui se développent dans un sac d'embryon. Après la rencontre des gamètes mâles et femelles, les protéines sur la surface du gamète favorisent la reconnaissance, l'attachement et la fusion pour compléter la double fécondation. Dans des études antérieures, les protéines mâles de membrane de gamètegenerative CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)^3,4 et GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)⁵ ont été identifiées comme régulateurs de fertilisation impliqués dans la fusion de gamètes et attachement, respectivement. Nous avons récemment identifié une protéine membranaire spécifique au gamète mâle, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), en tant que régulateur de fertilisation impliqué dans l'interaction gamète. Nous avons constaté qu'une diminution de l'expression de DMP9 a comme conséquence l'inhibition significative de la fertilisation de cellules d'oeuf pendant la double fertilisation dans A. thaliana^6.

Comme la double fécondation se produit dans un sac d'embryon, qui est incorporé dans un ovule qui est encore enveloppé avec le tissu d'ovaire, il est difficile d'observer et d'analyser les états des processus de double fécondation. Pour cette raison, il y a encore beaucoup de points peu clairs qui entravent une compréhension complète du mécanisme entier de contrôle de double fertilisation. La mise en place de techniques d'observation pour retracer le comportement des gamètes lors de la double fécondation dans des conditions in vivo est indispensable à l'analyse fonctionnelle des candidats potentiels pour les régulateurs de fécondation. Des études récentes ont donné des lignes de marqueur où les structures sous-cellulaires gamètes sont étiquetées avec des protéines fluorescentes. Dans cet article, nous démontrons un protocole simple et rapide pour observer la double fertilisation qui s'est produite dans un sac d'embryon dérivé des pistils artificiellement pollinisés. L'utilisation de la ligne de marqueurde noyau de cellules de sperme HTR10-mRFP 7, l'état de fertilisation de chaque gamète femelle peut être discriminé sur la base de la morphologie nucléaire de signal de sperme. Notre protocole se concentrant sur un tel changement morphologique des noyaux de sperme à la fertilisation peut obtenir efficacement une quantité suffisante de données pour la preuve statistique. Une ligne DMP9-knockdownavec hTR10-mRFP fond (DMP9^KD/^HTR10-mRFP) a été utilisé comme plantes mâles pour montrer un modèle de fertilisation unique. Le protocole convient également à l'analyse fonctionnelle d'autres organismes de réglementation de la fertilisation.

Protocole

1. Pollinisation artificielle

REMARQUE: Avant de commencer le processus, une paire de forceps no 5 est nécessaire.

1. Cultivez A. thaliana (Col-0) à 22 oC sous un cycle sombre de 16 h/8 h dans une chambre de croissance.
   REMARQUE: Couper et enlever la première tige de fleur développée avec des ciseaux pour favoriser le développement des bourgeons axillaires. Les plantes en croissance vigoureuse (2-3 semaines après la coupe de la première tige; hauteur de la plante d'environ 25 cm) sont propices à l'analyse.
2. Pour émasculer, enlever le sépale (figure 1B), le pétale (figure 1C) et l'étamine (figure 1D) des bourgeons floraux au stade 11⁸ (figure 1A) à l'aide de 5 forceps. Bud avec des morceaux de pétales vus au sommet est le meilleur.
   REMARQUE: Utilisez une ligne de marqueur de gamètes femelle sémino-femelle appropriée. Dans ce protocole, nous avons utilisé une plante de type sauvage comme parent femelle.
3. Quinze à dix-huit heures après l'émasculation, prenez l'étamine d'une fleur DMP9^{KD/HTR10-mRFP} au stade 13⁸ en pinçant le filament avec des forceps.
4. Pour polliniser, tapoter doucement la stigmatisation d'un pistil émasculé plusieurs fois avec une anthère décente.

2. Préparation de l'Ovule pour l'observation

REMARQUE: Les éléments suivants sont nécessaires : un verre coulissant avec du ruban adhésif recto-verso, des forceps no 5, une aiguille d'injection de 27 G et un microscope à disséquer.

1. 7 à 8 h après la pollinisation (HAP), recueillir le pistil et le placer sur la bande à double face, puis appuyez doucement avec des forceps pour fixer le pistil sur la bande (Figure 2A, A').
   REMARQUE: La plupart des ovules dans un pistil reçoivent au moins un tube de pollen 10 HAP⁹. Si les deux ou l'un des spermatozoïdes du premier tube de pollen ne parviennent pas à féconder, un deuxième tube de pollen serait attiré par l'ovule en raison du système de récupération de fécondation¹⁰. Pour analyser la morphologie des noyaux de sperme à partir du premier tube de pollen, il est recommandé de terminer la préparation des ovules par 10 HAP au plus tard.
2. Couper les extrémités supérieure et inférieure de l'ovaire à l'aide d'une aiguille d'injection sous un microscope à disséquer (figure2B, B').
3. Éteindre la paroi de l'ovaire le long des deux côtés du replum (Figure 2C, C') en déplaçant la pointe de l'aiguille d'injection.
   REMARQUE: Insérez l'aiguille d'injection à peu de profond soudeur pour empêcher la séparation des ovules du septum.
4. Evert la paroi de l'ovaire en utilisant l'aiguille d'injection (Figure 2D, D').
5. Pincez la base du septum à laquelle les ovules sont connectés, et soulevez-le soigneusement avec des forceps (Figure 2E).
6. Transférer les ovules dans une goutte d'eau sur un verre coulissant, et couvrir délicatement d'un verre de couverture pour observation sous un microscope à fluorescence (Figure 2E, E').

3. Microscopie

REMARQUE: Dans ce protocole, nous avons utilisé un microscope épifluorescence équipé d'un cube de filtre à fluorescence (voir Tableau des matériaux),d'un appareil photo numérique et du logiciel d'accompagnement.

1. Acquérir des images d'ovules contenant des noyaux de sperme étiquetés avec mRFP à l'aide d'une lentille objective 20x ou 40x et l'appareil photo numérique équipé.
2. Confirmer le nombre de noyaux de sperme étiquetés mRFP dans un sac d'embryons.
   REMARQUE: Les ovules contenant deux noyaux de sperme étiquetés mRFP peuvent être inclus dans la taille de la population pour l'analyse statistique.
3. Confirmer la forme et la position de chaque noyau de sperme étiqueté mRFP dans un sac d'embryon.
   REMARQUE: Immédiatement après avoir été libéré d'un tube de pollen, une paire de noyaux de sperme condensés mRFP-étiquetés sont localisés entre l'oeuf et la cellule centrale. Un noyau de sperme décondensé mRFP-étiqueté détecté au côté de l'extrémité de chalazal indique la fertilisation centrale de cellules, par exemple. En utilisant une ligne de marqueur de membrane de gamète femelle appropriée, comme indiqué dans la figure supplémentaire 1, si oui ou non le spermatozoïde subit la plasmogamy (après fusion de membrane mais avant karyogamy) peut être surveillé clairement.

Résultats

Des ovules d'un pistil pollinisé avec DMP9^{KD/HTR10-mRFP} ont été rassemblés à 7-8 HAP et observés.

La plupart des ovules contenaient deux noyaux de sperme décondensés étiquetés mRFP à l'ovule (côté micropylar) et à la cellule centrale (côté de l'extrémité charazal) positions du noyau, respectivement (Figure 3A), indiquant une double fécondation réussie. En out...

Discussion

HTR10-mRFP étiquette la chromatine paternelle (c.-à-d., visualise les noyaux de spermatozoïdes), et la dynamique dans la double fécondation ont été rapportés⁷. Immédiatement après la libération d'un tube de pollen, les noyaux de sperme HTR10-mFP-étiquetés sont toujours condensés. Cependant, chacun des noyaux de sperme est décondensé en fusionnant avec un noyau de gamète femelle fertilisé à la karyogamy trois à quatre heures après fusion de membrane de gamète^7...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Olympus		Epifluorescence microscope
Cover glass	Matsunami glass	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape	Nichiban	NW-15S	15 mm width
DP72	Olympus		Degital camera
Forceps	Vigor		Any No. 5 forceps are available
Growth chamber	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7
Injection needle	Terumo	NN-2719S	27 G
Slide glass	Matsunami glass	S9443
SZX9	Olympus		Dissecting microscope
U-MRFPHQ	Olympus		Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x	Olympus		Objective lens (NA 0.75), dry