Valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma Morfologia nucleare in Arabidopsis Doppia Fecondazione

Riepilogo

Dimostriamo un metodo per determinare la fecondazione riuscita o fallita sulla base della morfologia nucleare dello sperma nell'Arabidopsis doppia fecondazione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.

Abstract

Le piante da fiore hanno un sistema di riproduzione sessuale unico chiamato "doppia fecondazione", in cui ciascuno spermatozoi si fonde con precisione con una cellula uovo o una cellula centrale. Così, due eventi di fecondazione indipendenti si svolgono quasi simultaneamente. La cellula uovo fecondata e la cellula centrale si sviluppano rispettivamente in zigote ed endosperma. Pertanto, un controllo preciso della doppia fecondazione è essenziale per lo sviluppo del seme che ne consegue. La doppia fecondazione si verifica nel gametophyte femminile (sacco embrionale), che è profondamente nascosto e coperto da spessi tessuti ovuli e ovarici. Questa costruzione del tessuto piisilo rende abbastanza difficile l'osservazione e l'analisi della doppia fecondazione e ha creato la situazione attuale in cui molte domande riguardanti il meccanismo della doppia fecondazione rimangono senza risposta. Per la valutazione funzionale di un potenziale candidato per l'regolatore di fecondazione, l'analisi fenotipica della fecondazione è importante. Per giudicare il completamento della fecondazione in Arabidopsis thaliana, le forme dei segnali di fluorescenza che etichettano i nuclei dello sperma vengono utilizzate come indicatori. Una cellula sperma che non riesce a fertilizzare è indicata da un segnale di fluorescenza condensata al di fuori dei gameti femminili, mentre una cellula sperma che concime con successo è indicata da un segnale dedensato a causa della karyogamia con il nucleo dei gameti femminili. Il metodo qui descritto fornisce uno strumento per determinare la fecondazione riuscita o non riuscita in condizioni di invivo.

Introduzione

Le piante da fiore producono semi attraverso la doppia fecondazione, un processo che è direttamente controllato da interazioni tra proteine localizzate sulla membrana plasmatica gameta^1,2. Pianta da Fiore gameti maschili, un paio di spermatozoi, si sviluppano in polline. Un tubo di polline che cresce dopo l'impollinazione fornisce una coppia di spermatozoi ai gameti femminili, una cellula uovo e una cellula centrale, che si sviluppano in un sacco embrionale. Dopo che i gameti maschili e femminili si incontrano, le proteine sulla superficie dei gameti promuovono il riconoscimento, l'attaccamento e la fusione per completare la doppia fecondazione. In studi precedenti, le proteine della membrana dei gameti maschili GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)^3,4 e GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)⁵ sono state identificate come regolatori di fertilizzazione coinvolti nella fusione dei gameti e rispettivamente l'allegato. Recentemente abbiamo identificato una proteina di membrana specifica del gamete maschile, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), come regolatore di fertilizzazione coinvolto nell'interazione dei gameti. Abbiamo scoperto che una diminuzione dell'espressione DMP9 si traduce in un'inibizione significativa della fecondazione delle cellule ovuli durante la doppia fecondazione in A. thaliana⁶.

Poiché la doppia fecondazione si verifica in un sacco embrionale, che è incorporato in un ovulo che viene ulteriormente avvolto con tessuto ovarico, è difficile osservare e analizzare gli stati dei processi di doppia fecondazione. Per questo motivo, ci sono ancora molti punti poco chiari che ostacolano una comprensione completa dell'intero meccanismo del controllo della doppia fecondazione. L'istituzione di tecniche di osservazione per tracciare il comportamento dei gameti durante la doppia fecondazione in condizioni in vivo è indispensabile per l'analisi funzionale dei potenziali candidati per i regolatori di fecondazione. Recenti studi hanno prodotto linee marker in cui le strutture subcellulari dei gameti sono etichettate con proteine fluorescenti. In questo articolo, dimostriamo un protocollo semplice e veloce per osservare la doppia fecondazione che si è verificato in un sacco embrionale derivato da pistili artificialmente impollinati. Utilizzando la linea di marcatore del nucleo delle cellule spermatrici HTR10-mRFP⁷, lo stato di fecondazione di ogni gamete femmina può essere discriminato sulla base della morfologia del segnale nucleare dello sperma. Il nostro protocollo incentrato su un tale cambiamento morfologico dei nuclei spermatozoi alla fecondazione può ottenere in modo efficiente una quantità sufficiente di dati per la prova statistica. Una linea DMP9-knockdown con sfondo HTR10-mRFP (DMP9^{KD/HTR10-mRFP}) è stata utilizzata come piante maschili per mostrare un unico modello di fecondazione. Il protocollo è adatto anche per l'analisi funzionale di altri regolatori di fecondazione.

Protocollo

1. Impollinazione artificiale

NOT: Prima di iniziare il processo, è necessaria una coppia di pinze n. 5.

1. Coltivare A. thaliana (Col-0) a 22 gradi sotto un ciclo scuro di luce/8 chili di 16 ore in una camera di crescita.
   NOT: Tagliare e rimuovere il primo gambo di fiori sviluppato con forbici per promuovere lo sviluppo di gemme ascellari. Le piante in crescita vigorosa (2-3 settimane dopo il taglio del primo gambo; altezza della pianta circa 25 cm) sono adatte per l'analisi.
2. Per evitare, rimuovere sepal (Figura 1B), petalo (Figura 1C) e stami (Figura 1D) di boccioli di fiori nella fase 11⁸ (Figura 1A) utilizzando il numero 5 forza. Muoversi con pezzi di petali visto in cima è meglio.
   NOT: Utilizzare una linea di marcatore gamete femminile adatto. In questo protocollo, abbiamo usato una pianta di tipo selvatico come genitore femmina.
3. Quindici-diciotto ore dopo l'emasculazione, prendere lo stame di un fiore DMP9^{KD/HTR10-mRFP} allo stadio 13⁸ pizzicando il filamento con pinze.
4. Per impollinare, accarezzare delicatamente lo stigma di un pistilo evirato più volte con un'antere dehiscente.

2. Preparazione dell'ovulo per l'osservazione

NOT: Sono necessari i seguenti elementi: un vetrino a slitta con nastro adesivo a due lati collegato, pinze n. 5, un ago di iniezione da 27 G e un microscopio sezionato.

1. da 7 a 8 h dopo l'impollinazione (HAP), raccogliere il pistilo e posizionarlo sul nastro fronte/retro, quindi premere delicatamente con pinze per fissare il pistilo sul nastro (Figura 2A,A').
   NOT: La maggior parte degli ovuli in un pistillo ricevono almeno un tubo di polline 10 HAP⁹. Se entrambi o uno qualsiasi dei spermatozoi dal primo tubo di polline non riescono a fertilizzare, un secondo tubo di polline sarebbe attratto dall'ovulo a causa del sistema di recupero della fecondazione¹⁰. Per analizzare la morfologia dei nuclei di sperma dal primo tubo di polline, si consiglia di completare la preparazione dell'ovulo da 10 HAP al più tardi.
2. Tagliare le estremità superiore e inferiore dell'ovaio utilizzando un ago di iniezione al microscopio dissetante (Figura 2B, B ').
3. Sfoliare la parete dell'ovaio lungo entrambi i lati del replum (Figura 2C,C') spostando la punta dell'ago di iniezione.
   NOT: Inserire l'ago di iniezione superficialmente per evitare la separazione dell'ovulo dal setto.
4. Evert la parete dell'ovaio utilizzando l'ago di iniezione (Figura 2D,D').
5. Avvicinare la base del setto a cui sono collegate le ovuli e sollevarla con attenzione con le pinze (Figura 2E).
6. Trasferire gli ovuli in una goccia d'acqua su un vetrino di scorrimento e coprire delicatamente con un vetro di copertura per l'osservazione al microscopio a fluorescenza (Figura 2E,E').

3. Microscopia

NOT: In questo protocollo, abbiamo utilizzato un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo filtro a fluorescenza (vedi Tabella deimateriali), una fotocamera digitale e il software di accompagnamento.

1. Acquisire immagini di ovuli contenenti nuclei di sperma tom etichettati con mRFP utilizzando un obiettivo 20x o 40x e la fotocamera digitale attrezzata.
2. Confermare il numero di nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP in un sacco embrionale.
   NOT: Gli ovuli contenenti due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP possono essere inclusi nella dimensione della popolazione per l'analisi statistica.
3. Confermare la forma e la posizione di ogni nucleo sperma con etichetta mRFP in un sacco embrionale.
   NOT: Immediatamente dopo essere stato rilasciato da un tubo di polline, un paio di nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP con densaviene vengono localizzati tra l'uovo e la cellula centrale. Un nucleo di spermam con etichetta mRFP dedensato rilevato a lato dell'estremità chalazal indica, ad esempio, la fecondazione cellulare centrale. Utilizzando una linea di marcatore di membrana gamet femminile adatta, come mostrato nella Figura supplementare 1, se la cellula sperma è sottoposta o meno alla plasmogamia (dopo la fusione della membrana ma prima della karyogamia) può essere monitorata chiaramente.

Risultati

Gli ovuli di un pistilio impollinato con DMP9^{KD/HTR10-mRFP} sono stati raccolti a 7-8 HAP e osservati.

La maggior parte degli ovuli conteneva due nuclei di spermatozoi con etichetta mRFP con etichetta mRFP con etichetta e mOFST con etichetta durante la prima pagina (lato micropila) e le posizioni del nucleo delle cellule centrali (lato finale di Charazal), rispettivamente (Figura 3A

Discussione

Etichette HTR10-mRFP cromatina paterna (cioè, visualizza i nuclei delle cellule spermatiche), e la dinamica nella doppia fecondazione sono state segnalate⁷. Immediatamente dopo il rilascio da un tubo di polline, i nuclei di spermatozoi etichettati con etichetta HTR10-mRFP sono ancora condensati. Tuttavia, ciascuno dei nuclei di sperma viene decondenato dopo la fusione con un nucleo gameti femminile fecondato a karyogamy tre o quattro ore dopo la fusione della membrana gamete⁷

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Olympus		Epifluorescence microscope
Cover glass	Matsunami glass	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape	Nichiban	NW-15S	15 mm width
DP72	Olympus		Degital camera
Forceps	Vigor		Any No. 5 forceps are available
Growth chamber	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7
Injection needle	Terumo	NN-2719S	27 gauge
Slide glass	Matsunami glass	S9443
SZX9	Olympus		Dissecting microscope
U-MRFPHQ	Olympus		Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x	Olympus		Objective lens (NA0.75), dry