애기장의 정자 핵 형태를 추적하여 수정 상태의 평가 이중 수정

요약

우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 애기장대 이중 수정에 있는 정액 핵 형태에 근거하여 성공또는 실패한 수정을 결정하는 방법을 보여줍니다.

초록

꽃 피는 식물은 '이중 수정'이라는 독특한 성적 재생 시스템을 가지고, 있는 정자 세포의 각각은 정확하게 계란 세포 또는 중앙 세포와 융합. 따라서, 2개의 독립적인 풍부하게 함 사건은 거의 동시에 일어든다. 수정란 세포와 중앙 세포는 각각 접합체와 배유로 발전합니다. 따라서, 이중 풍부하게 함의 정밀한 통제는 계속되는 종자 발달을 위해 필수적이다. 이중 수정은 깊게 숨겨져 두꺼운 난소 와 난소 조직으로 덮여 여성 gametophyte (배아 낭)에서 발생합니다. 이 암술 조직 건설은 이중 수정의 관측 그리고 분석을 아주 어렵게 하고 이중 풍부하게 함의 기계장치에 관하여 많은 질문이 대답되지 않는 남아 있는 현재 상황을 만들었습니다. 수정 조절제에 대한 잠재적 인 후보의 기능적 평가를 위해, 풍부하게 함의 의 자형 분석이 중요하다. 애기장대에서수정의 완료를 판단하기 위해, 정자 핵을 표시하는 형광 신호의 모양은 지표로 사용됩니다. 수정하지 못하는 정자 세포는 여성 gametes 외부의 응축형 신호에 의해 표시되는 반면, 성공적으로 비옥하게 하는 정자 세포는 여성 gametes의 핵을 가진 karyogamy 때문에 decondensed 신호에 의해 표시됩니다. 여기서 설명된 방법은 생체 내 조건하에서 성공 또는 실패한 수정을 결정하는 도구를 제공한다.

서문

꽃 피는 식물은 이중 수정을 통해 씨앗을 생산, 직접 gamete 혈장 막에 국한 단백질 사이의 상호 작용에 의해 제어되는 과정^1,2. 꽃 식물 남성 gametes, 정자 세포의 쌍, 꽃가루에서 개발. 수분 후에 자라는 꽃가루 관은 배아 낭에서 발전하는 여성 gametes, 계란 세포 및 중앙 세포에 한 쌍의 정자 세포를 전달합니다. 남성과 여성의 게임들이 만난 후, gamete 표면의 단백질은 인식, 부착 및 융합을 촉진하여 이중 수정을 완료합니다. 이전 연구에서, 수컷 게임테막 단백질 생성 세포 특이적 1(GCS1)/HAPLESS2(HAP2)^3,4 및 GAMETE EXPRESSED 2(GEX2)^5는 게임테 융합에 관여하는 수정 조절제로서 확인되었고, 첨부 파일각각. 우리는 최근에 gamete 상호 작용에 관여하는 풍부하게 함 조정기로 남성 gamete 특이적인 막 단백질, DUF679 DOMAIN 막 단백질 9 (DMP9)를 확인했습니다. 우리는 DMP9 발현의 감소가 A. 탈리아나6에서 이중 수정 동안 난자 세포 수정의 현저한 억제를 초래한다는 것을 것을을 발견했습니다.

이중 수정은 난소 조직으로 더 싸여 있는 배아 낭에서 발생하므로 이중 수정 과정의 상태를 관찰하고 분석하기가 어렵습니다. 이러한 이유로, 이중 수정 제어의 전체 메커니즘의 완전한 이해를 방해하는 많은 불분명한 점이 여전히 있다. 생체 내 조건에서 이중 수정 시 게임테의 거동을 추적하는 관찰 기법의 확립은 수정 조절제에 대한 잠재적 후보의 기능적 분석에 필수적입니다. 최근 연구는 gamete 세포 내 구조물이 형광 성 단백질로 표지되는 마커 선을 산출했습니다. 이 기사에서는 인위적으로 수분된 암술에서 파생된 배아 낭에서 발생한 이중 수정을 관찰하기 위한 간단하고 빠른 프로토콜을 보여줍니다. 정자 세포 핵 마커 라인 HTR10-mRFP^7를사용하여, 각 여성 게임테의 수정 상태는 정자 핵 신호 형태에 기초하여 구별될 수 있다. 수정에서 정자 핵의 이러한 형태학적 변화에 초점을 맞춘 우리의 프로토콜은 통계적 증거를 위해 충분한 양의 데이터를 효율적으로 얻을 수 있습니다. HTR10-mRFP 배경을 이용한 DMP9-녹다운라인(DMP9KD/HTR10-mRFP)을남성 식물로 사용하여 단일 수정 패턴을 나타내게 하였다. 이 프로토콜은 또한 다른 풍부하게 함 조절제의 기능적 분석에 적합하다.

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프로토콜

1. 인공 수분

참고: 프로세스를 시작하기 전에 5번 집게가 필요합니다.

1. 성장 챔버에서 16-h 빛/8-h 암흑 주기 하에서 22°C에서 A. 탈리아나(Col-0)를 성장시다.
   참고: 잘라 서 드 싹의 개발을 촉진 하기 위해 가위로 첫 번째 개발 된 꽃 줄기를 제거 합니다. 활발하게 성장하는 식물 (첫 번째 줄기절단 후 2-3 주, 식물 높이 약 25cm)는 분석에 적합합니다.
2. 분리하려면, 5 위 집게를 사용하여 단계 11⁸ (그림 1A)에서 꽃 봉오리의 혈팔 (그림1B),꽃잎 (그림1C)및 스타멘 (그림1D)을제거하십시오. 상단에 보이는 꽃잎의 비트와 꽃봉오리가 가장 좋습니다.
   참고: 적합한 여성 게임 마커 라인을 사용합니다. 이 프로토콜에서는 야생 형 식물을 여성 부모로 사용했습니다.
3. 방출 후 15~18시간, 필라멘트를 집게로 꼬집어 13^{8단계에서} DMP9 KD/HTR10-mRFP꽃의 스타맨을 취한다.
4. 수분하기 위해, 부드럽게 dehiscent anther와 함께 여러 번 emasculated 암술의 낙인을 두드려.

2. 관찰을 위한 배풀의 준비

참고: 양면 테이프가 부착된 슬라이드 유리, 5호 집게, 27G 주사 바늘 및 해부 현미경이 필요합니다.

1. 수분 (HAP) 후 7 ~ 8 시간, 암포를 수집하고 양면 테이프에 배치 한 다음 테이프에 암술문제를 해결하기 위해 집게로 부드럽게 누릅니다 (그림2A,A').
   참고: 암술에서 대부분의 난자 적어도 하나의 꽃가루 튜브 10 HAP 9을받을 수 있습니다. 첫 번째 꽃가루 관에서 정자 세포 중 어느 하나 또는 어느 하나가 수정에 실패하면, 제 2 꽃가루 관은 수정 회복 시스템^(10)으로인해 배란에 의해 끌릴 것이다. 첫 번째 꽃가루 관에서 정자 핵 형태를 분석하기 위해, 늦어도 10 HAP에 의해 배란 준비를 완료하는 것이 좋습니다.
2. 해부 현미경의 밑에 주입 바늘을 사용하여 난소의 상부 및 하부 단부를 잘라냅니다 (도2B,B').
3. 주사 바늘의 끝을 이동시켜 리플럼(도2C,C')의양쪽을 따라 난소벽을 슬릿한다.
   참고: 중격에서 배란 분리를 방지하기 위해 주사 바늘을 얕게 삽입하십시오.
4. 주사 바늘을 이용하여 난소벽을 적재하였다(도2D,D').
5. 난것이 연결된 중격의 염기를 꼬집고 집게로 조심스럽게 들어 올립니다 (그림2E).
6. 미끄럼 틀에 있는 물 한 방울로 난란을 옮기고, 형광 현미경으로 관찰하기 위해 커버 유리로 부드럽게 덮습니다(그림2E,E').

3. 현미경 검사법

참고: 이 프로토콜에서는 형광 필터 큐브(재료 표참조), 디지털 카메라 및 수반되는 소프트웨어가 장착된 에피플루온 현미경을 사용했습니다.

1. 20x 또는 40x 대물 렌즈및 장착된 디지털 카메라를 사용하여 mRFP로 표지된 정자 핵을 포함하는 난자의 이미지를 획득합니다.
2. 배아 낭에서 mRFP 표지된 정자 핵의 수를 확인합니다.
   참고: 2개의 mRFP 표지된 정자 핵을 포함하는 난작은 통계 분석을 위한 인구 규모에 포함될 수 있다.
3. 배아 낭에서 각 mRFP 표지된 정자 핵의 모양 과 위치를 확인합니다.
   참고: 꽃가루 튜브에서 방출 된 직후, 응축 된 mRFP 표지 정자 핵 한 쌍은 계란과 중앙 세포 사이에 국한됩니다. chalazal 끝의 측에서 검출된 decondensed mRFP 표지된 정액 핵은 중앙 세포 풍부하게 함을, 예를 들면 나타냅니다. 보충 도1에 도시된 바와 같이 적합한 여성 게임테 막 마커 라인을 사용함으로써, 정자 세포가 플라스모가미(막 융합 후 하지만 카요가미 전)를 겪고 있는지 여부를 명확하게 모니터링할 수 있다.

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결과

DMP9 KD/HTR10-mRFP로수분된 암술로부터의 난을 7-8 HAP에서 수집하고 관찰하였다.

대부분의 난란은 난자 세포 (micropylar 측) 및 중앙 세포 (charazal 끝 측) 핵 위치에서 2 개의 decondensed mRFP 표지된 정액 핵을 각각 포함했습니다 (그림3A),성공적인 이중 수정을 나타내는. 또한, 중앙 세포 핵에 decondensed ...

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토론

HTR10-mRFP 라벨은 친자 염색질(즉, 정자 세포 핵을 시각화함)이며, 이중 수정에서의 역학은^7. 꽃가루 관에서 방출 직후, HTR10-mRFP 표지된 정액 핵은 아직도 응축됩니다. 그러나, 각각의 정자 핵은 가메라미에서 수정된 여성 게임테 핵과 병합시 에이치막 융합 7후3~4시간 동안 소멸된다. 수정되지 않은 정자 세포는 gcs1 정액 세포가 풍부하게 함 없이 체포되는 배...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Olympus		Epifluorescence microscope
Cover glass	Matsunami glass	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape	Nichiban	NW-15S	15 mm width
DP72	Olympus		Degital camera
Forceps	Vigor		Any No. 5 forceps are available
Growth chamber	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7
Injection needle	Terumo	NN-2719S	27 G
Slide glass	Matsunami glass	S9443
SZX9	Olympus		Dissecting microscope
U-MRFPHQ	Olympus		Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x	Olympus		Objective lens (NA 0.75), dry