Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Resumo

Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.

Resumo

As plantas de florescência têm um sistema sexual original da reprodução chamado ' fertilização dobro ', em que cada um das pilhas do sperm funde precisamente com uma pilha de ovo ou uma pilha central. Assim, dois eventos de fertilização independente acontecem quase que simultaneamente. A pilha de ovo fertilizada e a pilha central tornam-se no zigoto e no endosperm, respectivamente. Portanto, o controle preciso da dupla adubação é essencial para o desenvolvimento de sementes que se seguiu. A fertilização dupla ocorre no gametófito fêmea (saco do embrião), que é profundamente escondida e coberta com os tecidos grossos do óvulo e do ovário. Esta construção do tecido do pistilo faz a observação e a análise da fertilização dobro completamente difícil e criou a situação atual em que muitas perguntas a respeito do mecanismo da fertilização dobro permanecem sem resposta. Para a avaliação funcional de um candidato potencial para o regulador da fertilização, a análise fenotípica da fertilização é importante. Para julgar a conclusão da fertilização em Arabidopsis Arabidopsis thaliana, as formas de sinais de fluorescência rotulando núcleos de espermatozóides são usadas como indicadores. Uma célula espermática que não fertilizar é indicada por um sinal de fluorescência condensado fora das gametas femininas, enquanto uma célula espermática que fertiliza com sucesso é indicada por um sinal desnaturado devido à carigamia com o núcleo feminino dos gametas. O método descrito aqui fornece uma ferramenta para determinar a fertilização bem-sucedida ou fracassada em condições in vivo.

Introdução

Plantas floridas produzem sementes através de dupla adubação, um processo que é controlado diretamente por interações entre proteínas localizadas na membrana plasmática^degameta 1,2. Os gametas masculinos da planta de florescência, um par de pilhas de esperma, desenvolvem-se no pólen. Um tubo de pólen que cresce após a polinização entrega um par de células espermáticas para gametas femininas, uma célula de ovo e uma célula central, que se desenvolvem em um saco embrionário. Depois que os gametas masculinos e femininos se encontram, as proteínas na superfície do gameta promovem o reconhecimento, o acessório, e a fusão para terminar a fertilização dobro. Em estudos prévios, as proteínas da membrana do gameta masculino Generative Cell SPECIFIC 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)^3,4e gameta expressadas 2 (GEX2)⁵ foram identificadas como reguladores de fertilização envolvidos na fusão de gametas e acessório, respectivamente. Nós identificamos recentemente uma proteína gameta-específica masculina da membrana, proteína 9 da membrana do domínio DUF679 (DMP9), como um regulador da fertilização envolvido na interação do gameta. Verificou-se que uma diminuição da expressão de DMP9 resulta em inibição significativa da adubação de células de ovo durante a dupla adubação em a. Arabidopsis thaliana⁶.

Como a fertilização dupla ocorre em um saco embrionário, que é incorporado em um óvulo que é mais envolvido com o tecido do ovário, é difícil observar e analisar os Estados de processos de fertilização dupla. Por esta razão, ainda há muitos pontos obscuros que impedem uma compreensão completa de todo o mecanismo de controle de fertilização dupla. O estabelecimento de técnicas de observação para traçar o comportamento dos gâmetas durante a dupla adubação condições in vivo é indispensável para a análise funcional de potenciais candidatos a reguladores de fertilização. Estudos recentes produziram linhas de marcador onde as estruturas subcelulares do gameta são rotuladas com proteínas fluorescentes. Neste artigo, demonstramos um protocolo simples e rápido para observar a dupla adubação que ocorreu em um saco embrionário derivado de pistilos artificialmente polinados. Usando a linha do marcador do núcleo da célula espermática HTR10-MRFP⁷, o estado da fertilização de cada gameta fêmea pode ser discriminado com base na morfologia nuclear do sinal do esperma. Nosso protocolo focalizando em tal mudança morfológica dos núcleos do esperma na fertilização pode eficientemente obter uma quantidade suficiente de dados para a prova estatística. Uma linha DMP9-knockdown com fundo HTR10-MRFP (DMP9^{KD/HTR10-MRFP}) foi usada como plantas masculinas para mostrar um único teste padrão da fecundação. O protocolo também é adequado para a análise funcional de outros reguladores de fertilização.

Protocolo

1. polinização artificial

Nota: Antes de iniciar o processo, é necessário um par de fórceps n º 5.

1. Cresça a. Arabidopsis thaliana (Col-0) em 22 ° c um ciclo escuro de 16-h Light/8-h em uma câmara de crescimento.
   Nota: Corte e remova a primeira haste desenvolvida da flor com as tesouras para promover o desenvolvimento de botões axilar. As plantas vigorously crescentes (2-3 semanas após o corte da primeira haste; a altura da planta aproximadamente 25 cm) são apropriadas para a análise.
2. Para emascular, remover Sepal (Figura 1b), pétala (Figura 1C), e estame (Figura 1D) de botões florais no estágio 11⁸ (Figura 1a) usando o fórceps no. 5. Bud com pedaços de pétalas visto na parte superior é o melhor.
   Nota: Use uma linha de marcador fêmea apropriada do gameta. Neste protocolo, utilizou-se um tipo de planta selvagem como o pai do sexo feminino.
3. Quinze a dezoito horas após a emasculação, tome o estame de uma flor de DMP9^{KD/HTR10-MRFP} no estágio 13⁸ apertando o filamento com fórceps.
4. Para polinizar, gentilmente Pat o estigma de um pistilo emasculado várias vezes com um Anther deiscentes.

2. preparação de ovule para observação

Nota: Os seguintes itens são necessários: um slide de vidro com fita dupla face anexado, no. 5 fórceps, uma agulha de injeção de 27 G, e um microscópio de dissecação.

1. 7 a 8 h após a polinização (HAP), recolher o pistilo e colocá-lo na fita dupla face, em seguida, pressione suavemente com fórceps para fixar o pistilo na fita (Figura 2a, a ').
   Nota: A maioria dos óvulos em um pistilo receber pelo menos um tubo de pólen 10 Hap⁹. Se ambas ou qualquer uma das células espermáticas do primeiro tubo de pólen não fertilizar, um segundo tubo de pólen seria atraído pelo óvulo devido ao sistema de recuperação da fertilização¹⁰. Para analisar a morfologia dos núcleos espermáticos do primeiro tubo polínico, recomenda-se concluir a preparação dos óvulo por 10 HAP, o mais tardar.
2. Corte as extremidades superior e inferior do ovário usando uma agulha de injeção um microscópio de dissecação (Figura 2b, B ').
3. Cortar a parede do ovário ao longo de ambos os lados do replum (Figura 2C, C ') movendo a ponta da agulha de injecção.
   Nota: Insira a agulha de injeção de forma superficialmente para evitar a separação dos óvulo do septo.
4. Evert a parede do ovário usando a agulha da injeção (Figura 2D, D ').
5. Aperte a base do septo ao qual os óvulos estão ligados e levante-o cuidadosamente com o fórceps (Figura 2e).
6. Transfira os óvulos em uma gota de água em um vidro de corrediça, e cubra delicadamente com um vidro da tampa para a observação um microscópio de fluorescência (Figura 2e, e ').

3. microscopia

Nota: Neste protocolo, utilizou-se um microscópio de epifluorescência equipado com um cubo de filtro de fluorescência (ver tabela de materiais), uma câmera digital e o software de acompanhamento.

1. Adquira imagens de óvulos contendo núcleos de espermatozóides rotulados com mRFP usando uma lente objetiva de 20x ou 40x e a câmera digital equipada.
2. Confirme o número de núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP em um saco embrionário.
   Nota: Ovules contendo dois núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP podem ser incluídos no tamanho da população para análise estatística.
3. Confirme a forma e a posição de cada núcleo de esperma rotulado por mRFP em um saco embrionário.
   Nota: Imediatamente após ser liberado de um tubo do pólen, um par de núcleos condensados mRFP-etiquetados do esperma é localizado entre o ovo e a pilha central. Um núcleo decondensed do esperma de MRFP-etiquetado detectado no lado da extremidade Haustório indica a fertilização central da pilha, por exemplo. Usando uma linha de marcador fêmea apropriada da membrana do gameta, como mostrado na Figura 1 suplementar , se ou não a pilha de esperma está submetendo-se à plasmogamia (após a fusão da membrana mas antes do karyogamy) pode ser monitorado claramente.

Resultados

Ovules de um pistilo polinizadas com DMP9^{KD/HTR10-MRFP} foram coletados em 7-8 HAP e observados.

A maioria dos óvulos continha dois núcleos de espermatozóides desnaturados com mRFP na célula do ovo (lado micropylar) e as posições do núcleo da célula central (lado final do charazal), respectivamente (Figura 3a), indicando dupla fertilização bem-sucedida. Além disso, for...

Discussão

HTR10-mRFP rotula a cromatina paterna (isto é, visualiza núcleos de células espermáticas), e a dinâmica na fertilização dupla foi relatada⁷. Imediatamente após a liberação de um tubo de pólen, HTR10-mRFP-rotulado núcleos de esperma ainda são condensados. Entretanto, cada um dos núcleos do esperma é desdensed em cima da fusão com um núcleo fêmea fertilizado do gameta em karyogamy três a quatro horas após a fusão⁷da membrana do gameta. As células de espe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Olympus		Epifluorescence microscope
Cover glass	Matsunami glass	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape	Nichiban	NW-15S	15 mm width
DP72	Olympus		Degital camera
Forceps	Vigor		Any No. 5 forceps are available
Growth chamber	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7
Injection needle	Terumo	NN-2719S	27 gauge
Slide glass	Matsunami glass	S9443
SZX9	Olympus		Dissecting microscope
U-MRFPHQ	Olympus		Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x	Olympus		Objective lens (NA0.75), dry