הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

Summary

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

Abstract

צמחים פורחים יש מערכת ייחודית רבייה מינית בשם ' הפריה כפולה ', שבה כל אחד מתאי הזרע מנתיכים בדיוק עם תא ביצה או תא מרכזי. לפיכך, שני אירועי הפריה עצמאיים מתרחשים כמעט בו זמנית. תא הביצית המופרית והתא המרכזי מתפתחים לזיגוטה ולאנדוזרע, בהתאמה. לכן, שליטה מדויקת של הפריה כפולה חיונית להתפתחות הזרעים שלאחר מכן. הפריה כפולה מתרחשת בתוך הנקבה המאובמת (שק העובר), אשר מוסתרים עמוקות מכוסה ברקמה עבה ורקמות שחלות. הבנייה הזאת רקמת העור עושה התבוננות וניתוח של הפריה כפולה די קשה ויצר את המצב הנוכחי שבו שאלות רבות לגבי המנגנון של הפריה כפולה נותרו ללא מענה. עבור הערכה תפקודית של מועמד פוטנציאלי לווסת הדישון, ניתוח פנוטימית של הפריה חשוב. כדי לשפוט את השלמת ההפריה ב Arabidopsis thaliana, הצורות של אותות פלואורסצנטית תיוג גרעינים זרע משמשים אינדיקטורים. תא זרע שאינו מגיע להפרות מצוין על-ידי אות מעובה מחוץ למשחק הנשי, ואילו תא זרע שמפרה בהצלחה מצוין על-ידי אות שאינו מעובד כתוצאה מקריסוגמיה בגרעין המגיים הנשי. השיטה המתוארת כאן מספקת כלי לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה תחת בתנאים vivo.

Introduction

צמחים פורחים לייצר זרעים באמצעות הפריה כפולה, תהליך זה נשלט ישירות על ידי אינטראקציות בין חלבונים מקומי על ממברנה פלזמה תא רבייה^1,2. פורח מפעל גברי, זוג תאים זרע, לפתח אבקה. שפופרת אבקה הצומחת לאחר האבקה מספקת זוג תאי זרע למשחק נקבה, תא ביצה ותא מרכזי, המתפתחים לתוך שק העובר. לאחר המשחק הגברי והנשי נפגשים, חלבונים על פני משטח גמטות לקדם הכרה, החזקה, והיתוך להשלים הפריה כפולה. במחקרים קודמים, קרום המשחק הגברי חלבונים תא מסוים 1 (GCS1)/הסיס 2 (HAP2)^3,4 ו-תא רבייה ביטא 2 (GEX2)⁵ זוהו כרגולטורים הפריה מעורבים היתוך תא רבייה ו מצורף, בהתאמה. לאחרונה זיהינו מDUF679 זכר הממברנה הספציפי חלבון, תחום ממברנה חלבון 9 (DMP9), כמו וסת הפריה מעורב אינטראקציה תא רבייה. מצאנו כי ירידה של DMP9 ביטוי התוצאות עיכוב משמעותי של הפריה תא ביצה במהלך הפריה כפולה ב . thaliana⁶.

כמו הפריה כפולה מתרחשת שק העובר, אשר מוטבע בתוך ביצית כי הוא עטוף עוד עם רקמת שחלות, קשה להתבונן ולנתח את מצבי תהליכים הפריה כפולה. מסיבה זו, עדיין יש הרבה נקודות ברורות שיגבילו הבנה מלאה של המנגנון כולו של בקרת הפריה כפולה. הקמת טכניקות התבוננות כדי לעקוב אחר התנהגותו של גמטות במהלך הפריה כפולה תחת בתנאים vivo היא הכרחית לניתוח פונקציונלי של מועמדים פוטנציאליים הפריה ווסת. מחקרים שנעשו לאחרונה הניבו קווי סמן שבו מבנים subcellular המשחק מסומנים עם חלבונים פלורסנט. במאמר זה, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט ומהיר להתבוננות הפריה כפולה שהתרחשה שק העובר נגזר מpistils מלאכותית מלאכותי. באמצעות תא זרע הגרעין סמן קו HTR10-mRFP⁷, מצב הדישון של כל מגיים נקבה יכול להיות מופלים על בסיס של זרע המבנה הגרעיני האותות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בשינוי מורפולוגי כזה של גרעיני הזרע בהפריה יכול להשיג ביעילות כמות מספקת של נתונים עבור הוכחה סטטיסטית. קו DMP9-מיקוד עם רקע HTR10-mrfp (DMP9^{KD/HTR10-mrfp}) שימש צמחים זכרים כדי להראות דפוס הפריה יחיד. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח פונקציונלי של מוסבי הפריה אחרים.

Protocol

1. האבקה מלאכותית

הערה: לפני שמתחילים בתהליך, נדרש זוג מלקחיים של No. 5.

1. הגדל thaliana (Col-0) ב -22 ° c תחת מחזור כהה של 16-h בחדר הגידול.
   הערה: גזור ולהסיר את קנה הפרח הראשון שפותח עם מספריים כדי לקדם את הפיתוח של ניצנים השחי. צמחים הגדלים במרץ (2-3 שבועות לאחר חיתוך של הקנה הראשון; גובה הצמח כ -25 ס מ) מתאימים לניתוח.
2. כדי לסרס, להסיר עלי גביע (איור 1b), כותרת (איור 1b), ו אבקן (איור 1b) של ניצנים פרח בשלב 11⁸ (איור 1b) באמצעות מלקחיים מס ' 5. ניצן עם פיסות של עלי כותרת לראות בראש הוא הטוב ביותר.
   הערה: השתמש המתאים הנקבה סמן קו הסימון. בפרוטוקול זה, השתמשנו בצמח סוג פראי כמו ההורה הנשי.
3. 15 עד 18 שעות לאחר אה, לקחת את אבקן של DMP9^{KD/HTR10-mrfp} פרח בשלב 13⁸ על ידי צובט את חוט הלהט עם מלקחיים.
4. כדי להאביק, בעדינות ללטף את הסטיגמה של מסורס פיסטיל מספר פעמים עם ביטול הריח.

2. הכנת ביצית להשגחה

הערה: הפריטים הבאים נדרשים: זכוכית שקופית עם קלטת כפולה מחוברת, מלקחיים מס ' 5, מחט הזרקת G 27, ומיקרוסקופ מבתר.

1. 7 כדי 8 h לאחר האבקה (האפ), לאסוף את פיסטיל ולמקם אותו על קלטת כפולה, ולאחר מכן לחץ בעדינות עם מלקחיים כדי לתקן את הפיסטיל על הקלטת (איור 2a, A ').
   הערה: רוב הברגי מקבל לפחות צינור אבקה אחד 10 האפ⁹. אם שניהם או כל אחד מתאי הזרע מן הצינור אבקה הראשון להיכשל להפרות, צינור אבקה השני יימשך על ידי הביצית בשל ההפריה הפריה מערכת¹⁰. כדי לנתח את המבנה של גרעין הזרע מצינור האבקה הראשון, מומלץ להשלים את ההכנה באמצעות 10 האפ לאחרונה.
2. חותכים את הקצוות העליונים והתחתונים של השחלה באמצעות מחט הזרקה תחת מיקרוסקופ מבתר (איור 2B, B ').
3. לחתוך את חומת השחלה לאורך שני צידי השזיף (איור 2c, C) על ידי הזזת קצה המחט הזריקה.
   הערה: הכנס את המחט הזריקה שתאפשר כדי למנוע הפרדה ביצית מן המחיצה.
4. אוורט את חומת השחלה באמצעות מחט ההזרקה (איור 2D, D ').
5. צבוט את בסיס המחיצה שאליה מחוברים המחוברים, והרימו אותו בזהירות עם מלקחיים (איור 2E).
6. העבר את המכסה לתוך טיפת מים על זכוכית שקופית, ובעדינות לכסות עם זכוכית כיסוי להתבוננות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2E, E ').

3. מיקרוסקופיה

הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית מצויד קוביית מסנן פלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים), מצלמה דיגיטלית, ואת התוכנה המלווה.

1. השיגו תמונות של שימוש בגרעינים המכילים גרעיני זרע עם mRFP באמצעות עדשת המטרה 20x או 40x ומצלמה דיגיטלית מצוידת.
2. אשר את מספר גרעיני הזרע המסומנים ב-mRFP בתוך שק העובר.
   הערה: ניתן לכלול בגודל האוכלוסיה שני גרעיני זרע בעלי תוויות של mRFP לניתוח סטטיסטי.
3. אשר את הצורה והמיקום של כל גרעין הזרע שכותרתו mRFP בתוך שק העובר.
   הערה: מיד לאחר ששוחרר מצינור האבקה, זוג גרעיני זרע מרוכז בעלי תוויות של mRFP מותאמים לבין הביצה לתא המרכזי. גרעין הזרע של mRFP מסומן על ידי שזיהה בצד של הצ מציין הפריה תא מרכזית, למשל. על-ידי שימוש בשורה מתאימה בצורת סמן ממברנה, כפי שמוצג באיור המשלים 1, בין אם תא הזרע עובר פלמוסוגמיה (לאחר היתוך ממברנה אבל לפני קריומיה) ניתן לפקח בבירור.

תוצאות

מתוך פיסטיל מואבקים עם DMP9^{KD/HTR10-mrfp} נאספו ב 7-8 האפ ו נצפתה.

רוב בעלי התפקידים הכילו שני גרעיני זרע mRFP המסומנים בתווית על תא הביצית (מיקרופיללר בצד) והתא המרכזי (צד הקצה של charazal), בהתאמה (איור 3A), המציין הפריה כפולה מוצ...

Discussion

HTR10-mRFP תוויות כרומטין אבהי (כלומר, לדמיין גרעיני תא זרע), ואת הדינמיקה הפריה כפולה דווחו⁷. מיד לאחר שחרורו מצינור אבקה, גרעיני זרע HTR10-mRFP עדיין צפוף. עם זאת, כל גרעין הזרע הוא לפרק עם מיזוג עם הגרעין הנקבי מגיים הנקבה בקאריומיה שלוש עד ארבע שעות לאחר פיוז ' ן קרום ממברנה⁷

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Olympus		Epifluorescence microscope
Cover glass	Matsunami glass	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape	Nichiban	NW-15S	15 mm width
DP72	Olympus		Degital camera
Forceps	Vigor		Any No. 5 forceps are available
Growth chamber	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7
Injection needle	Terumo	NN-2719S	27 gauge
Slide glass	Matsunami glass	S9443
SZX9	Olympus		Dissecting microscope
U-MRFPHQ	Olympus		Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x	Olympus		Objective lens (NA0.75), dry