JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Arabidopsis çift döllenmede sperm nükleer morfolojisi temelinde epifloresan mikroskobu kullanılarak başarılı veya başarısız döllenmeyi belirlemek için bir yöntem gösterilmektedir.

Özet

Çiçekli bitkilerin benzersiz bir cinsel üreme sistemi 'çift döllenme' olarak adlandırılan, hangi sperm hücrelerinin her tam bir yumurta hücresi veya merkezi bir hücre ile kaynaşır. Böylece, iki bağımsız döllenme olayları hemen hemen aynı anda gerçekleşir. Döllenmiş yumurta hücresi ve merkezi hücre sırasıyla zigot ve endosperm haline gelişir. Bu nedenle, çift gübreleme nin kesin kontrolü takip eden tohum gelişimi için gereklidir. Çift döllenme kadın gametophyte oluşur (embriyo kesesi), derin gizli ve kalın ovule ve yumurtalık dokuları ile kaplı. Bu pistil doku yapısı, çift döllenmenin gözlem ve analizini oldukça zorlaştırmış ve çift gübreleme mekanizmasıile ilgili birçok sorunun cevapsız kaldığı mevcut durumu yaratmıştır. Döllenme düzenleyicisi için potansiyel bir adayın fonksiyonel değerlendirilmesi için döllenmenin henotibik analizi önemlidir. Arabidopsis thalianadöllenmenin tamamlanmasını yargılamak için, sperm çekirdeklerini etiketleyen floresan sinyallerinin şekilleri gösterge olarak kullanılır. Döllenmeyi başaramayan bir sperm hücresi dişi gametlerin dışında yoğunlaştırılmış floresan sinyali ile gösterilirken, başarılı bir şekilde döllenen bir sperm hücresi, dişi gametlerin çekirdeğiile karyogami nedeniyle yoğunlaştırılmış bir sinyalle gösterilir. Burada açıklanan yöntem in vivo koşullar altında başarılı veya başarısız döllenme belirlemek için bir araç sağlar.

Giriş

Çiçekli bitkiler çift gübreleme yoluyla tohum üretmek, doğrudan gamet plazma membran lokalize proteinler arasındaki etkileşimler tarafından kontrol edilen bir süreç1,2. Çiçekli bitki erkek gametler, sperm hücrelerinin bir çift, polen gelişir. Tozlaşma dan sonra büyüyen bir polen tüpü kadın gametler, bir yumurta hücresi ve bir embriyo kesesinde geliştirmek merkezi bir hücre, sperm hücrelerinin bir çift sunar. Erkek ve dişi gametler karşılaştıktan sonra, gamet yüzeyindeki proteinler çift döllenmeyi tamamlamak için tanıma, bağlanma ve füzyonu teşvik eder. Daha önceki çalışmalarda erkek gamet membran proteinleri GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 ve GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 gamet füzyonu ile ilgili döllenme düzenleyicileri olarak tanımlanmış ve sırasıyla ek. Yakın zamanda bir erkek gamet özgü membran proteini, DUF679 DOMAIN MEMBRAN PROTEIN 9 (DMP9), gamet etkileşimi dahil bir döllenme regülatörü olarak tespit. DMP9 ekspresyonundaki azalmanın A. thaliana6'da çift döllenme sırasında yumurta hücresi döllenmesinin önemli ölçüde inhibisyonuna yol açabilen bir azalma olduğunu bulduk.

Çift döllenme yumurtalık dokusu ile daha fazla sarılmış bir ovule gömülü bir embriyo kese, oluşur gibi, gözlemlemek ve çift döllenme süreçlerinin durumları analiz etmek zordur. Bu nedenle, çift döllenme kontrolü tüm mekanizmasının tam bir anlayış engelleyen birçok belirsiz noktaları hala vardır. İn vivo koşullarda çift döllenme sırasında gametlerin davranışlarını takip etmek için gözlem tekniklerinin oluşturulması, döllenme düzenleyicileri için potansiyel adayların fonksiyonel analizi için vazgeçilmezdir. Son çalışmalarda gamet alt hücreli yapıların floresan proteinlerile etiketlendiği marker çizgileri ortaya çıkar. Bu makalede, yapay tozlaşma pistillerden elde edilen bir embriyo kesesinde meydana gelen çift döllenmeyi gözlemlemek için basit ve hızlı bir protokol göstermiş bulunuyoruz. Sperm hücresi çekirdek marker hattı HTR10-mRFP7kullanılarak, her dişi gametin döllenme durumu sperm nükleer sinyal morfolojisi temelinde ayrımcılığa uğrayabilir. Döllenmede sperm çekirdeklerinin bu kadar morfolojik değişimine odaklanan protokolümüz, istatistiksel kanıt için yeterli miktarda veri elde edebilir. Tek bir döllenme paterni göstermek için erkek bitki olarak HTR10-mRFP arka planlı(DMP9KD/HTR10-mRFP)dmp9-knockdown hattı kullanılmıştır. Protokol aynı zamanda diğer gübreleme regülatörlerinin fonksiyonel analizi için de uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Yapay Tozlaşma

NOT: İşleme başlamadan önce, 5 numaralı forceps bir çift gereklidir.

  1. A. thaliana (Col-0) 22 °C'de 16-h ışık/8-h karanlık bir döngü altında bir büyüme odasında büyüyün.
    NOT: Kes ve aksiller tomurcukları gelişimini teşvik etmek makas ile ilk geliştirilen çiçek sapı kaldırın. Şiddetle büyüyen bitkiler (ilk sap kestikten 2-3 hafta sonra; bitki yüksekliği yaklaşık 25 cm) analiz için uygundur.
  2. Emasculate için, sepal kaldırmak (Şekil 1B), yaprak (Şekil 1C), ve stamen (Şekil 1D) evre118 (Şekil1A) No 5 forceps kullanarak çiçek tomurcukları. Üst kısmında görülen yaprakları parçaları ile Tomurcuk en iyisidir.
    NOT: Uygun bir kadın gamet işaretleyici hattı kullanın. Bu protokolde, kadın ebeveyn olarak yabani bir bitki kullandık.
  3. Emasculation sonra on beş ila on sekiz saat, evre 138 bir DMP9KD/HTR10-mRFP çiçek stamen almak forceps ile filament pinching tarafından.
  4. Tozlaşmak için, hafifçe bir dehiscent anther ile bir hadım pistil birkaç kez stigma pat.

2. Gözlem için Ovule hazırlanması

NOT: Aşağıdaki öğeler gereklidir: çift taraflı bant takılı bir slayt cam, No. 5 forceps, 27 G enjeksiyon iğnesi, ve bir diseksiyon mikroskop.

  1. Tozlaşmadan (HAP) 7 ila 8 saat sonra, pistil'i toplayın ve çift taraflı bandın üzerine yerleştirin, ardından banttaki pisti düzeltmek için plasepsiyonla hafifçe bastırın (Şekil2A,A').
    NOT: Bir pistil en ovules en az bir polen tüpü 10 HAP9alırsınız. İlk polen tüpünden sperm hücrelerinin her ikisi de veya herhangi biri döllenmeyi başaramazsa, ikinci bir polentüpü döllenme kurtarma sistemi nedeniyle ovule tarafından çekilir 10 . İlk polen tüpünden sperm çekirdekleri morfolojisini analiz etmek için ovule preparatını en geç 10 HAP ile tamamlaması önerilir.
  2. Bir diseksiyon mikroskobu altında bir enjeksiyon iğnesi kullanarak yumurtalığın üst ve alt uçlarını kesin (Şekil2B,B').
  3. Enjeksiyon iğnesinin ucunu hareket ettirerek yumurtalık duvarını replum 'un her iki tarafı boyunca (Şekil2C,C') yarık.
    NOT: Ovule'nin septumdan ayrılmasını önlemek için enjeksiyon iğnesini sığ bir şekilde yerleştirin.
  4. Evert enjeksiyon iğnesi kullanarak yumurtalık duvarı (Şekil 2D,D').
  5. Ovules'in bağlı olduğu septumun tabanını çimdikle ve forsepslerle dikkatlice kaldırın (Şekil2E).
  6. Ovules bir slayt cam üzerinde su damlası içine aktarın ve yavaşça bir floresan mikroskobu altında gözlem için bir kapak cam ile kaplayın (Şekil2E,E').

3. Mikroskopi

NOT: Bu protokolde, floresan filtre küpü (bkz. MalzemeTablosu), bir dijital fotoğraf makinesi ve beraberindeki yazılımla donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullandık.

  1. 20x veya 40x objektif lens ve donanımlı dijital fotoğraf makinesi kullanarak mRFP ile etiketlenmiş sperm çekirdekleri içeren ovules görüntüleri elde edin.
  2. Bir embriyo kesesinde mRFP etiketli sperm çekirdeklerinin sayısını doğrulayın.
    NOT: İki mRFP etiketli sperm çekirdeği içeren ovules istatistiksel analiz için popülasyon büyüklüğüne dahil edilebilir.
  3. Bir embriyo kesesinde mRFP etiketli her sperm çekirdeğinin şeklini ve konumunu doğrulayın.
    NOT: Polen tüpünden çıktıktan hemen sonra, bir çift yoğunlaştırılmış mRFP etiketli sperm çekirdeği yumurta ile merkezi hücre arasında lokalize edilir. Chalazal end tarafında saptanan bir decondensed mRFP etiketli sperm çekirdeği merkezi hücre döllenme gösterir, örneğin. Uygun bir kadın gamet membran marker hattı kullanılarak, Ek Şekil1'de gösterildiği gibi, sperm hücresinin plazmogami geçirilip geçirilmediği (membran füzyonundan sonra ama karyogamiden önce) net bir şekilde izlenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

DMP9KD/HTR10-mRFP ile tozlanmış bir pistil ovules 7-8 HAP toplandı ve gözlendi.

Ovulların çoğunda yumurta hücresi (mikropylar yan) ve merkezi hücre (charazal end side) çekirdek pozisyonlarında sırasıyla (Şekil3A)iki adet yoğuşmalı mRFP etiketli sperm çekirdeği bulunurve bu da başarılı çift döllenmeyi gösterir. Buna ek olarak, merkezi hücre çekirdeğind...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

HTR10-mRFP etiketleri baba kromatin (yani, sperm hücre çekirdekleri görselleştirir), ve çift döllenme dinamikleri bildirilmiştir7. Polen tüpünden salındıktan hemen sonra HTR10-mRFP etiketli sperm çekirdekleri hala yoğunlaşır. Ancak, sperm çekirdeklerinin her biri gamet membran füzyon7sonra karyogamy üç ila dört saat bir döllenmiş kadın gamet çekirdeği ile birleştirme üzerine decondensed . Döllenmemiş sperm hücreleri yoğun kalır, hangi gcs...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Japonya Bilim KAKENHI hibe (JP17H05832 T. I.) teşvik için Japonya Derneği tarafından desteklenen ve Phytochemical Bitki Moleküler Bilimler Stratejik Öncelik Araştırma Tanıtım Programı fon tarafından, Chiba Üniversitesi (Japonya).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BX51OlympusEpifluorescence microscope
Cover glassMatsunami glassC018181
DMP9KD/HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tapeNichibanNW-15S15 mm width
DP72OlympusDegital camera
ForcepsVigorAny No. 5 forceps are available
Growth chamberNihonikaLPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFPArabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. (2007)7
Injection needleTerumoNN-2719S27 G
Slide glassMatsunami glassS9443
SZX9OlympusDissecting microscope
U-MRFPHQOlympusFluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40xOlympusObjective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20xOlympusObjective lens (NA 0.75), dry

Referanslar

  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076(2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 150geli im biyolojisig brelemegameti ekli bitkifloresan mikroskopovuletozla ma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır