Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

Zusammenfassung

Wir zeigen eine Methode zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung auf Basis der Spermien-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppelbefruchtung mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Zusammenfassung

Blühende Pflanzen haben ein einzigartiges sexuelles Reproduktionssystem namens "Doppelte Befruchtung", in dem jede der Spermien präzise mit einer Eizelle oder einer zentralen Zelle verschmilzt. So finden fast gleichzeitig zwei unabhängige Düngeereignisse statt. Die befruchtete Eizelle und die Zentralzelle entwickeln sich zu Zygoten bzw. Endospermen. Daher ist eine präzise Kontrolle der Doppeldüngung für die anschließende Saatgutentwicklung unerlässlich. Die doppelte Befruchtung erfolgt im weiblichen Gametophyten (Embryosack), der tief versteckt und mit dicken Eizellen und Eierstockgeweben bedeckt ist. Diese Stempelgewebekonstruktion erschwert die Beobachtung und Analyse der Doppeldüngung und hat die gegenwärtige Situation geschaffen, in der viele Fragen zum Mechanismus der Doppeldüngung unbeantwortet bleiben. Für die funktionelle Bewertung eines potenziellen Kandidaten für die Düngungsregulierer ist eine phänotypische Analyse der Befruchtung wichtig. Um den Abschluss der Befruchtung in Arabidopsis thalianazu beurteilen, werden die Formen von Fluoreszenzsignalen, die Spermienkerne kennzeichnen, als Indikatoren verwendet. Eine Spermienzelle, die nicht befruchtet, wird durch ein kondensiertes Fluoreszenzsignal außerhalb der weiblichen Gameten angezeigt, während eine Spermienzelle, die erfolgreich befruchtet, durch ein dekondensiertes Signal aufgrund von Karyogamie mit dem Weiblichen Gametenkern angezeigt wird. Die hier beschriebene Methode stellt ein Werkzeug zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung unter in vivo-Bedingungen dar.

Einleitung

Blühende Pflanzen produzieren Samen durch doppelte Befruchtung, ein Prozess, der direkt durch Wechselwirkungen zwischen Proteinen gesteuert wird, die auf Gamete Plasmamembran^1,2lokalisiert sind. Blühende Pflanzenmännchen gameten, ein Paar Spermien, entwickeln sich in Pollen. Ein Pollenrohr, das nach der Bestäubung wächst, liefert ein Paar Spermien an weibliche Gameten, eine Eizelle und eine zentrale Zelle, die sich in einem Embryosack entwickeln. Nachdem sich die männlichen und weiblichen Gameten treffen, fördern Proteine auf der Gamete-Oberfläche Die Erkennung, Anhaftung und Fusion, um eine doppelte Befruchtung zu vollenden. In früheren Studien wurden die männlichen Gamete-Membranproteine GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)^3,4 und GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)⁵ als Befruchtungsregulatoren identifiziert, die an der Gamete-Fusion und Anlage. Kürzlich haben wir ein männliches Gamete-spezifisches Membranprotein, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), als Düngeregulator identifiziert, der an der Gamete-Interaktion beteiligt ist. Wir fanden heraus, dass eine Abnahme der DMP9-Expression zu einer signifikanten Hemmung der Befruchtung von Eizellen während der Doppelbefruchtung in A. thaliana⁶führt.

Da die Doppelbefruchtung in einem Embryosack auftritt, der in eine Eizelle eingebettet ist, die weiter mit Eierstockgewebe umwickelt ist, ist es schwierig, die Zustände von Doppelbefruchtungsprozessen zu beobachten und zu analysieren. Aus diesem Grund gibt es noch viele unklare Punkte, die ein vollständiges Verständnis des gesamten Mechanismus der doppelten Düngungskontrolle behindern. Die Etablierung von Beobachtungstechniken zur Verfolgung des Verhaltens von Gameten während der Doppelten Befruchtung unter in vivo-Bedingungen ist für die funktionelle Analyse potenzieller Kandidaten für Diebesregulatoren unerlässlich. Jüngste Studien haben Markerlinien ergeben, in denen subzelluläre Strukturen von Gamete mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet sind. In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und schnelles Protokoll zur Beobachtung der doppelten Befruchtung, das in einem Embryosack aufgetreten ist, der aus künstlich bestäubten Stempeln stammt. Mit Spermienkern MarkerLinie HTR10-mRFP⁷, kann der Befruchtungszustand jeder weiblichen Gamete auf der Grundlage der Spermien Kernsignal Morphologie diskriminiert werden. Unser Protokoll, das sich auf eine solche morphologische Veränderung der Spermienkerne bei der Befruchtung konzentriert, kann effizient eine ausreichende Menge an Daten für den statistischen Nachweis erhalten. Eine DMP9-Knockdown-Linie mit HTR10-mRFP-Hintergrund (DMP9^{KD/HTR10-mRFP}) wurde als männliche Pflanzen verwendet, um ein einzelnes Düngemuster zu zeigen. Das Protokoll eignet sich auch für die funktionelle Analyse anderer Düngeregler.

Protokoll

1. Künstliche Bestäubung

HINWEIS: Vor Beginn des Prozesses ist ein Paar Nr. 5 Zangen erforderlich.

1. A. thaliana (Col-0) bei 22 °C unter einem 16-h-Licht-/8-h-Dunkelzyklus in einer Wachstumskammer anbauen.
   HINWEIS: Schneiden und entfernen Sie den ersten entwickelten Blütenstiel mit der Schere, um die Entwicklung von Achselknospen zu fördern. Kräftig wachsende Pflanzen (2-3 Wochen nach dem Schneiden des ersten Stiels; Pflanzenhöhe ca. 25 cm) sind für die Analyse geeignet.
2. Entfernen Sie Sepal (Abbildung 1B), Blütenblatt (Abbildung 1C) und Stamen (Abbildung 1D) der Blütenknospen im Stadium 11⁸ (Abbildung 1A) mit Nr. 5 Zangen. Bud mit Flecken von Blütenblättern an der Spitze zu sehen ist am besten.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine geeignete weibliche Gamete-Marker-Linie. In diesem Protokoll haben wir eine Wild-Typ-Pflanze als weibliches Elternteil verwendet.
3. Fünfzehn bis achtzehn Stunden nach der Entschämung, nehmen Sie das Stamen einer DMP9^{KD/HTR10-mRFP} Blume in Stufe 13^8, indem Sie das Filament mit Zangen kneifen.
4. Um zu bestäuben, klopfen Sie das Stigma eines entstickten Stempels mehrmals mit einem dehiscent Anther.

2. Vorbereitung von Ovule zur Beobachtung

HINWEIS: Folgende Gegenstände sind erforderlich: ein Gleitglas mit doppelseitigem Klebeband, Nr. 5 Zangen, eine 27 G Injektionsnadel und ein Sezieren des Mikroskops.

1. 7 bis 8 h nach der Bestäubung (HAP), sammeln Sie den Stempel und legen Sie ihn auf das doppelseitige Band, dann drücken Sie sanft mit Zangen, um den Stempel auf dem Band zu befestigen (Abbildung 2A,A').
   HINWEIS: Die meisten Eizellen in einem Stempel erhalten mindestens ein Pollenrohr 10 HAP⁹. Wenn beide oder eine der Spermien aus dem ersten Pollenrohr nicht befruchtet, würde ein zweites Pollenrohr durch die Eizelle aufgrund des Düngungsrückgewinnungssystems^{angezogen werden 10}. Um die Spermienkernmorphologie aus dem ersten Pollenrohr zu analysieren, wird empfohlen, die Ovule-Vorbereitung spätestens um 10 HAP abzuschließen.
2. Schneiden Sie die oberen und unteren Enden des Eierstocks mit einer Injektionsnadel unter einem Sezierendes Mikroskop ab (Abbildung 2B,B').
3. Schlitzen Sie die Eierstockwand entlang beider Seiten des Replum (Abbildung 2C,C') durch Bewegen der Spitze der Injektionsnadel.
   HINWEIS: Setzen Sie die Injektionsnadel flach ein, um eine Ovuletrennung vom Septum zu verhindern.
4. Evert die Eierstockwand mit der Injektionsnadel (Abbildung 2D,D').
5. Kneifen Sie die Basis des Septums, mit dem die Ovules verbunden sind, und heben Sie sie vorsichtig mit Zangen an (Abbildung 2E).
6. Übertragen Sie die Eizellen in einen Tropfen Wasser auf einem Gleitglas, und decken Sie vorsichtig mit einem Deckglas zur Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2E,E').

3. Mikroskopie

HINWEIS: In diesem Protokoll verwendeten wir ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Fluoreszenzfilterwürfel (siehe Materialtabelle),einer Digitalkamera und der dazugehörigen Software ausgestattet ist.

1. Erfassen Sie Bilder von Eizellen, die Mit mRFP beschriftete Spermakerne enthalten, mit einem 20-fachen oder 40-fachen Objektiv und der mitgelieferten Digitalkamera.
2. Bestätigen Sie die Anzahl der mRFP-markierten Spermakerne in einem Embryosack.
   HINWEIS: Ovules, die zwei mRFP-markierte Spermakerne enthalten, können für statistische Analysen in die Populationsgröße einbezogen werden.
3. Bestätigen Sie die Form und Position jedes mRFP-markierten Spermakerns in einem Embryosack.
   HINWEIS: Unmittelbar nach der Freigabe aus einem Pollenrohr wird ein Paar kondensierter mRFP-markierter Spermakerne zwischen dem Ei und der Zentralzelle lokalisiert. Ein dekondensierter mRFP-markierter Spermakern, der an der Seite des Chalazal-Endes nachgewiesen wurde, weist beispielsweise auf eine zentrale Zellbefruchtung hin. Durch die Verwendung einer geeigneten weiblichen Gamete-Membran-Markerlinie, wie in DerErgänzungsabbildung 1dargestellt, kann die Frage, ob die Spermien plasmogamie (nach Membranfusion, aber vor Karyogamy) durchlaufen, eindeutig überwacht werden.

Ergebnisse

Ovules aus einem mit DMP9^{KD/HTR10-mRFP} bestäubten Stempel wurden bei 7-8 HAP gesammelt und beobachtet.

Die meisten Eizellen enthielten zwei dekondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Eizelle (Mikropylarseite) und zentralen Zellkernpositionen (Abbildung3A),was auf eine erfolgreiche Doppelbefruchtung hindeutet. Darüber hinaus wurden Ovule beobachtet, die einen dekondensier...

Diskussion

HTR10-mRFP-Etiketten väterliches Chromatin (d. h. visualisiert Spermienkerne), und die Dynamik bei der Doppelbefruchtung wurde berichtet⁷. Unmittelbar nach der Freisetzung aus einem Pollenrohr werden HTR10-mRFP-markierte Spermakerne noch kondensiert. Jedoch, jeder der Spermienkerne wird bei der Verschmelzung mit einem befruchteten weiblichen Gamete-Kern bei Karyogamy drei bis vier Stunden nach Gamete Membranfusion⁷dekondensiert. Unbefruchtete Spermien bleiben kondensiert, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	Olympus		Epifluorescence microscope
Cover glass	Matsunami glass	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape	Nichiban	NW-15S	15 mm width
DP72	Olympus		Degital camera
Forceps	Vigor		Any No. 5 forceps are available
Growth chamber	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7
Injection needle	Terumo	NN-2719S	27 gauge
Slide glass	Matsunami glass	S9443
SZX9	Olympus		Dissecting microscope
U-MRFPHQ	Olympus		Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x	Olympus		Objective lens (NA0.75), dry