امتصاص الحويصلات الهجينة العملاقة أحاديه الجانب بالكهرباء وقياس خواصها الميكانيكية من خلال شفط الماصات المجهرية

Summary

والهدف من البروتوكول هو قياس الخواص الميكانيكية الغشائية للحويصلات العملاقة بشكل موثوق من خلال شفط الماصة المجهرية.

Abstract

ويمكن استغلال الحويصلات العملاقة التي يتم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية والبوليمرات في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والاعتراف بالجزيئات الحيوية في التشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير مفاعلات مجهريه/نانو. في جميع هذه التطبيقات ، وتوصيف خصائص غشاء لها اهميه أساسيه. ومن بين تقنيات التوصيف الحالية ، فان طموح الماصة المجهرية ، الذي كان رائدا من قبل e. ايفانز ، يسمح بقياس الخواص الميكانيكية لغشاء مثل معامل انضغاط المنطقة ، ومعامل الانحناء ، والإجهاد تحلل والسلالة. هنا ، نقدم جميع المنهجيات والإجراءات التفصيلية للحصول علي حويصلات عملاقه من الغشاء الرقيق للدهون أو البوليمرات (أو كليهما) ، والتصنيع والمعالجة السطحية من الماصات الدقيقة ، والاجراء الطموح الذي يؤدي إلى قياس جميع المعلمات المذكورة سابقا.

Introduction

الحويصلات العملاقة التي تم الحصول عليها من الدهون الفوسفاتية (الدهنية) وقد استخدمت علي نطاق واسع منذ 1970s كنموذج غشاء الخلية الاساسيه¹. في أواخر 1990s ، التي تم الحصول عليها من التجميع الذاتي من البوليمرات النحاسية ، اسمه بوليميرسوميس في اشاره إلى نظيره الدهون^2،3، ظهرت بسرعة كبديل مثيره للاهتمام للدهنيات التي تمتلك الاستقرار الميكانيكية ضعيفه والفقراء وظائف الكيميائية وحدات. ومع ذلك ، فان الطابع الحيوي للخلية الخاصة بهم محدوده بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية لان الاخيره تتكون من الدهون الفوسفاتية ، المكون الرئيسي لغشاء الخلية. وعلاوة علي ذلك ، فان نفاذيه غشاء منخفضه يمكن ان يكون مشكله في بعض التطبيقات مثل تسليم المخدرات حيث الانتشار الخاضع للرقابة من الأنواع من خلال الغشاء مطلوب. في الاونه الاخيره ، كانت جمعيه الفوسفورية مع كتله البوليمرات لتصميم الهجينة البوليمر الدهون الحويصلات والاغشيه موضوعا لعدد متزايد من الدراسات^4،5. الفكرة الرئيسية هي لتصميم الكيانات التي تازر الجمع بين فوائد كل مكون (الوظائف الحيوية ونفاذيه الطبقات الدهنية مع الاستقرار الميكانيكي وبراعة الكيميائية من اغشيه البوليمر) ، والتي يمكن استغلالها في تطبيقات مختلفه: تسليم المخدرات الخاضعة للرقابة والمستهدفة ، والتعرف علي الجزيئات الحيوية داخل الخلايا البيولوجية للتشخيص ، والاغشيه الوظيفية للخلايا الاصطناعية ، وتطوير المجهرية مستوحاه من بيو-/نانوسوتوريس.

في الأيام الحالية ، المجتمعات العلمية المختلفة (الكيمياء الحيوية ، الكيميائيين ، الصيدلة البيولوجية ، الفيزيائية الكيميائية ، علماء الاحياء) لديها اهتمام متزايد في تطوير نموذج غشاء الخلية أكثر تقدما. هنا ، هدفنا هو تقديم ، علي النحو المفصل بقدر الإمكان ، المنهجيات الموجودة (الكهرباء ، شفط الماصات الدقيقة) للحصول علي وتوصيف الخواص الميكانيكية للحويصلات العملاقة ونماذج غشاء الخلية "المتقدمة" الاخيره التي هي الهجين البوليمر الدهون العملاقة حويصلات⁴

والغرض من هذه الأساليب هو الحصول علي قياس موثوق بها للضغط المنطقة والانحناء بلتيير من الغشاء ، فضلا عن الإجهاد تحلل وسلاله. واحده من التقنيات الأكثر شيوعا الموجودة لقياس صلابة الانحناء من حويصلة عملاقه هو تذبذب تحليل^6،7، استنادا إلى مراقبه المجهر الفيديو المباشر ؛ ولكن هذا يتطلب تذبذبا كبيرا في الغشاء المرئي ، ولا يتم الحصول عليه بشكل منتظم علي الاغشيه السميكة (مثل بوليميرسوميس). يمكن تحديد معامل الانضغاط المنطقة بالتجربة باستخدام تقنيه لانموير بلودغيت ولكن في معظم الأحيان علي أحادي الطبقة⁸. تسمح تقنيه شفط الماصات المجهرية بقياس كل من التحوير علي طبقه ثنائيه تشكل الحويصلة الاحاديه العملاقة (GUV) في تجربه واحده.

الطريقة التالية مناسبه لجميع الجزيئات البرمائية أو الجزيئات قادره علي تشكيل الطبقات الثنائية ، التالي ، حويصلات بالكهرباء. وهذا يتطلب طابعا سائلا من الطبقة الثنائية عند درجه حرارة الكهرباء.

Protocol

1. افتعال ميكروبييتس

ملاحظه: هنا ، الماصات الدقيقة ذات القطر الداخلي تتراوح بين 6 إلى 12 ميكرومتر وطول تفتق حول 3-4 مم ضرورية. ويرد وصف لطريقه مفصله لتصنيع الماصات المجهرية في ما يلي.

1. ضع الشعرية الزجاجية البورسيليكات في قضيب الساحب وأصلح أحد الطرفين بشد مقبض الباب.
2. الشريحة بعناية الزجاج من خلال الثقوب في الجانب من غرفه سخان.
3. تشديد مقبض الباب لقط في الطرف الآخر.
4. السيطرة علي حجم غيض وطول تفتق لتحقيق المواصفات المطلوبة. لذلك ، وتحسين المعايير التقنية مثل درجه حرارة التدفئة ، وسحب ، والسرعة ، والتاخير والضغط. وفيما يلي مثال علي البرنامج المستخدم:
   الحرارة: 550 درجه مئوية
   سحب: 10 (مجموعه من الجهاز: 0-255 في وحدات التعسفي)
   السرعة: 30 (المدى: 0-255 في الوحدات العشوائية)
   التاخير: 1 (النطاق: 0-255 في الوحدات العشوائية)
   الضغط: 500 (النطاق: 0-999 في الوحدات العشوائية)
5. انقر علي بولL لتنفيذ الاحداث المحددة من قبل البرنامج. ثم يتم فصل الشعرية إلى اثنين من الماصات الدقيقة ، التي يجب تعديل ابعادها باستخدام ميكروفورج.
6. تضاف الماصة المجهرية إلى حامل الماصة المعدنية في الميكروفورج (انظر الشكل 1). باستخدام الهدف 10x ، اضبط مرحله المجهر ومتلاعب الماصة (الحركة العمودية والافقيه) حتى يكون طرف الماصة قريبا من سطح الخرزة الزجاجية.
7. اضغط علي مفتاح القدم لأذابه حبه الزجاج. خفض غيض ووضعها في اتصال مع حبه الزجاج المنصهر. وسوف تتدفق الزجاج المنصهر في ماصه من قبل العمل الشعرية. انتظر بضع ثوان حتى يصل مستوي الزجاج المنصهر إلى ارتفاع معين كما هو مبين في ادراج الشكل 1.
8. وقف التدفئة عن طريق أزاله الضغط علي التبديل القدم ، وسحب بسرعة غيض بعيدا باستخدام المتلاعب الراسي ماصه للتسبب في كسر حاد.
9. كرر الخطوات 1.7 و 1.8 حتى يتم الحصول علي القطر المطلوب (6 إلى 12 ميكرومتر).
   ملاحظه: لتحسين دقه قياس القطر ، خلال الخطوة الاخيره ، استخدم هدف 32x مجهز بشبكاني.

2. نصائح ماصه الطلاء مع جيش صرب البوسني (الزلال المصل البقري)

1. لاعداد محلول 0.1 M من الجلوكوز التي تحتوي علي 1 ٪ wt. جيش صرب البوسنيين في المياه النقية.
   1. تزن 180 ملغ من مسحوق الجلوكوز ، ومكان في أنبوب مخروطي 15 مل من البولي بروبيلين وكامله مع 10 مل من الماء النقي.
   2. أضافه 0.1 غرام من مسحوق الجيش الصربي البوسني ويهز بلطف باستخدام خلاط أنبوب اختبار دواره حتى حل كامل (حوالي 4 ساعة).
2. خذ الحل مع حقنه Luer 10 مل القابل للتصرف مزوده بابره. شغل مره واحده ، وأزاله الابره وتثبيت فلتر خلات السليلوز 0.22 μm. ملء العديد من البولي بروبيلين الصغرى--أنابيب الطرد المركزي (1.5 mL) التي سيتم استخدامها لتزج الطرف.
3. ضع الشعيرات الدموية راسيا في أصحابها. اخفض الحامل واغمر الطرف في محلول الجلوكوز/جيش صرب البوسنيين بين عشيه وضحيها. وينبغي ان يرتفع الحل حوالي 1 سم عاليه عن طريق العمل الشعرية.
4. قم بازاله طرف الماصة من محلول الجلوكوز/الجيش الصربي. اعداد 5 مل من محلول الجلوكوز 0.1 M (تمييع 90 ملغ من مسحوق الجلوكوز في 5 مل من الماء النقي) وتصفيه من خلال مرشح خلات السليلوز 0.22 μm.
5. أملا الماصة بمحلول الجلوكوز باستخدام حقنه زجاجيه 500 μL مجهزه بالشعيرات الشعرية المرنة المنصهرة. ثم قم بازاله كل محلول الجلوكوز عن طريق امتصاصه مره أخرى وتجاهله (الشكل 2). كرر هذه الخطوة عده مرات لأزاله الجيش الصربي البوسني غير المحدود.

3. تشكيل GUVs والغبرة عن طريق الكهرباء

ملاحظه: التشكيل الكهربي هو تكنيك شائعه الاستخدام التي وضعتها Angelova⁹. الإجراءات للحصول علي غرفه الكهرباء ، وإيداع فيلم الدهون أو البوليمر (أو علي حد سواء ل غفس (العملاقة أحاديه الهجين الحويصلات)) وهيدرات الفيلم تحت حقل كهربائي بديل ويرد وصفها في ما يلي. ويرد أيضا وصف لإجراءات جمع البيانات التي تم الحصول عليها.

1. اعداد حلول البرمائيات والسكروز والجلوكوز
   1. اعداد محلول البرمائيات في تركيز 1 مغ/مل. تزن 10 ملغ من امفيفايل وتذوب في 10 مل من كلوروفورم. الحفاظ علي الحل في قارورة مختومه لتجنب التبخر المذيبات.
   2. اعداد حل الأوراق المالية من 1 ، 2-dioleoyl-sn-غليسرو-3-فوسفونوثانولامين-N-(lissamine رونامامين ب السلفونيل) (منشطات-رود) في 1 ملغ/مل في كلوروفورم.
   3. أضف 10 ميكرولتر من محلول الدهن الفلوري إلى المحلول البرمائي. الحفاظ علي الحلول في قوارير مختومه لتجنب التبخر المذيبات.
   4. اعداد السكروز وحلول الجلوكوز في تركيز 0.1 م. تزن 342 ملغ و 180 ملغ من السكروز والجلوكوز ، علي التوالي ، وحلها في 10 مل من الماء النقي.
2. اعداد غرفه الكهرباء
   ملاحظه: يمكن استخدام المواد الموصلة المختلفة لجعل جهاز كهربائي (علي سبيل المثال ، أسلاك البلاتين¹⁰، الابر غير القابل للصدا¹¹). تتكون الغرفة الكهربية من منزلقين ايتو يفصل بينهما فاصل مطاطي من النوع الدائري تم قطعه علي جانب واحد لإنشاء فتحه. يتم توصيل الشرائح إلى مولد الجهد عن طريق اثنين من الأسلاك الكهربائية (الشكل 3 والشكل 4ا).
   1. تنظيف الشرائح ايتو مع المذيبات العضوية (علي سبيل المثال ، كلوروفورم). تحديد سطح موصل باستخدام ohmmeter.
   2. نعلق الأسلاك الكهربائية علي الجانب موصل باستخدام شريط لاصق.
   3. ترسيب المحلول البرمائي
      1. تراجع الشعرية في الحل حتى المستوي يزيد من العمل الشعرية وجمع حوالي 5 μL من الحل.
      2. وضع الشعرية في اتصال مع مركز لوحه الزجاج ايتو ونشر بلطف الحل. انتظر 10 ثوان لضمان التبخر المذيب الكامل (الشكل 4ا).
      3. كرر هذا الاجراء 3 مرات لكل جانب.
   4. أضافه طبقه من الشحوم الخالية من السيليكون علي كلا الجانبين من الفاصل المفتوح أو الدائري. ضعه حول منطقه الترسيب ضع الوجه الموصل للوحه الزجاج ايتو الثانية علي قمة الفاصل.
   5. وضع الغرفة الكهربائية تحت فراغ لمده 3 ساعات لأزاله اي اثار من المذيبات العضوية.
3. عمليه التشكيل الكهربي
   1. توصيل الأسلاك الكهربائية إلى المولد.
   2. استخدم الإعدادات التالية للمولد:
      التوتر الجيب البديل
      التردد: 10 هرتز
      السعه: 2 V_{الذروة إلى الذروة}
      ملاحظه: يجب العثور علي تردد الجهد الأمثل ومده لكل نظام.
   3. تاكد من ان يتم تطبيق الجهد قبل حقن المحلول في الغرفة.
   4. حقن 1 مل من محلول باستخدام حقنه مع 0.8 mm الداخلية ابره القطر لملء الغرفة. أزاله فقاعات في نهاية المطاف.
   5. السماح للغرفة تحت الجهد التطبيقي/تردد لمده 75 دقيقه (الشكل 4ب).
4. الحصاد GUVs
   1. أطفئ المولد
   2. باستخدام حقنه 1 مل مع 0.8 mm ابره القطر الداخلي ، تمتص جزء صغير من الحل من أجل إنتاج فقاعه الهواء داخل الغرفة. أماله قليلا الغرفة من أجل جعل هذه الخطوة فقاعه داخل الغرفة. هذا يستطيع ساعدت ال [غفس] ان يفصل من ال [ايتو] سطح (شكل 4[ك]).
   3. تمتص كل الحل ونقلها إلى أنبوب من البلاستيك 1 مل.
   4. أزاله الأسلاك وتنظيف الشرائح ايتو مع المذيبات العضوية (تولوين ثم كلوروفورم).

4-اعداد الجزئيات

ملاحظه: مبدا شفط الماصات المجهرية هو امتصاص حويصلة واحده من خلال الماصة الزجاجية بتطبيق الاكتئاب. يتم قياس طول اللسان داخل الماصة كداله لضغط الشفط. ان طلاء الماصة بالجيش الصربي البوسني ، الموصوف سابقا ، ضروري لمنع أو تقليل اي التصاق بين اغشيه الحويصلات والماصة.

ويرد أدناه توضيح للبروتوكول.

1. توصيل الخزان بالماصة والمياه
   ملاحظه: يتم إصلاح خزان مملوء بالماء والميكرومتر إلى لوحه منزلقه. يسمح العداد الرقمي براس ميكرومتر بازاحه عموديه للجهاز في نطاق من 0 إلى 2.5 سم ودقه 1 μm. الازاحه علي طول السكك الحديدية ألومنيوم البصرية من الممكن ما يصل إلى 1 متر في الطول. أنبوب السيليكون يربط الخزان وحامل الشعرية (الشكل 5ا).
   1. أملا الخزان بالماء النقي. توصيل حقنه القابل للتصرف 5 مل إلى حامل المعدن الشعرية عن طريق أنابيب سيليكون ويستنشق لخلق تدفق المياه من الخزان إلى حامل.
   2. لمس أنبوب قليلا للقضاء علي فقاعات الهواء. في وقت واحد ، ورفع خزان المياه لخلق ضغط إيجابي. لا يزال يتم إرفاق حقنه 5 مل إلى حامل.
   3. بعد الطلاء والتنظيف الخطوات الموصوفة سابقا (انظر الخطوة 2) ، وملء الشعرية مع محلول الجلوكوز حتى اشكال قطره في نهاية المطاف. أزاله أنابيب حقنه من حامل المعدن لخلق تدفق المياه طفيف في نهايته.
   4. تحويل الشعرية راسا علي عقب وربط قطره الجلوكوز مع تدفق المياه من حامل. إصلاح الشعرية وحامل عن طريق الشد لهم معا.
2. وضع ماصه
   ملاحظه: خلال هذه العملية ، لا يزال يتم وضع خزان المياه علي السكك الحديدية ألومنيوم للحفاظ علي ضغط إيجابي.
   1. تاخذ مرحله ألومنيوم محليه الصنع مجهزه اثنين من الشرائح الزجاجية (تنظيفها سابقا مع الايثانول) والغراء لهم الشحوم فراغ علي كل جانب. تثبيته علي مرحله المجهر وتشكيل الغضروف المفصلي بين الشريحتين باستخدام حقنه 1 مل تحتوي علي 0.1 M من الجلوكوز كما هو مبين في الشكل 5ب ، ج.
   2. وضع الماصة وحاملها علي وحده المحرك من الجزئي وتشديد مقبض الباب لقط.
   3. استخدم جويستيك لوحه التحكم في الوضع الخشن لخفض الماصة المجهرية بالقرب من الغضروف المفصلي للجلوكوز. ضبط موضع الطرف إلى مركز الغضروف المفصلي باستخدام الوضع الدقيق.
   4. عقد الطرف مغمورة في الجلوكوز لبضع دقائق لتنظيف سطحه الخارجي والداخلي (كما يتم الحفاظ علي الضغط الإيجابي ، فان تدفق المياه شطف السطح الداخلي للماصة لأزاله الجيش الصربي البوسني غير المصقول).
   5. تخزين موقف غيض علي لوحه المفاتيح الجزئي وسحبها من الغضروف المفصلي.
   6. أزاله الغضروف المفصلي الجلوكوز واستبداله بواحده جديده. تمتص 2 μL من GUVs في 0.1 M السكروز باستخدام ميكروماص 20 μL ووضعها في الغضروف المفصلي الجلوكوز الطازجة. مراقبه في وضع DIC (تباين التداخل التفاضلي) GUVs تقع في الجزء السفلي بسبب اختلاف الكثافة بين السكروز (أساسا داخل GUVs) والجلوكوز (أساسا خارج GUVs).
   7. عندما تنكمش الحويصلات قليلا ، أعد تركيب ماصه الشفط وركز علي الطرف. تعيين ارتفاع H₀ من خزان المياه التي الضغط هو تقريبا 0. لذلك ، والاستفادة من الحويصلات الصغيرة أو الجزيئات التي هي موجودة بشكل طبيعي في الحل وضبط ارتفاع خزان المياه حتى يتم إيقاف حركه هذه الجزيئات.
   8. عند هذه النقطة ، تحيط الغضروف المفصلي مع الزيوت المعدنية لمنع تبخر المياه ، انظر الشكل 5د.
      ملاحظه: يجب التحكم في درجه حرارة الغرفة بين 20-22 درجه مئوية باستخدام تكييف الهواء.
3. تجربه شفط الماصة المجهرية
   1. اخفض طرف الماصة (6-12 ميكرومتر في القطر) واصنع شفط صغير (-1 سم) ليستنشق الحويصلة (15-30 ميكرومتر في القطر). غشاء الحويصلة المختارة يجب ان تتقلب قليلا ، ويجب ان لا يقدم اي عيوب مرئية (لا برعم أو خيوط) (الشكل 6).
   2. رفع الماصة إلى مستوي اعلي لعزل الحويصلة الغضروفية من الحويصلات الأخرى ، باستخدام الجزئية والحفاظ علي هذا الموقف خلال التجربة بأكملها.
   3. قبل الضغط علي الحويصلة عن طريق خفض خزان مملوء بالماء إلى ما يقرب من-10 سم ، ثم تقليل الضغط للعودة إلى قيمته الاوليه (-1 سم). كرر هذه الخطوة عده مرات لأزاله الاغشيه الزائدة والعيوب الصغيرة من الغشاء.
   4. من ارتفاع-0.5 سم المحددة من قبل موقف خزان المياه ، وخفض ببطء ضغط الشفط مع ميكرومتر للوصول إلى النظام الذي يتقلب الغشاء. ثم زيادة الضغط لتصور بوضوح اللسان في الطرف مع طول الإسقاط كبيره (بضعة ميكرون).
      ملاحظه: الضغط الأدنى المطبق (P₀) الذي يسمح بامتصاص أصغر طول لإسقاط الغشاء (L₀) سيحدد النقطة المرجعية α₀ (الشكل 7ا). سيتم قياس جميع نقاط المنحني وفقا لهذا المرجع (ΔL = L-L₀ و ΔP = P-p₀).
   5. زيادة ضغط الشفط مع ميكرومتر بطريقه متدرجة حتى تصل إلى 0.5-0.8 mN/م. في كل خطوه ، والانتظار 5 ليالي وتاخذ لقطه من اللسان. هذا الاجراء في التوتر المنخفض يتيح تحديد معامل الانحناء.
   6. الحفاظ علي زيادة ضغط الشفط من 0.5 mN/م إلى التوتر تمزق عن طريق ضبط ارتفاع المياه تملا انزلاق علي السكك الحديدية (تتراوح بين-2--50 سم) (الشكل 7B-D). من هذه التجربة في نظام التوتر العالي ، سيتم قياس معامل الانضغاط المنطقة ، وتحلل التوتر وسلاله تحلل.
   7. تمتد حوالي 15-20 حويصلات للحصول علي إحصاءات هامه. تستغرق كل تجربه شفط الماصات الدقيقة ما بين 7 و 10 دقائق. اجراء تحليل الصورة باستخدام برنامج LASAF لقياس طول الإسقاط من اللسان ، وقطر الحويصلات ونصف قطر الشعرية.
4. قياس معامل الانحناء ، ومعامل الانضغاط المنطقة ، والتوتر تحلل وسلاله تحلل
   1. للوصول إلى هذه المعلمات, استخدام الشكلية التي انشاتها e. ايفانز¹². احسب ضغط الشفط المطبق علي الغشاء من المعادلة 1:
      Δ P = ρ_wg (h − h0) (1)
      حيث g هو تسارع الجاذبية (9.8 م^{− 2}) ، ρ_w هو كثافة المياه (ρ = 1 غرام-³) ، h هو موقف خزان المياه و h₀ هو الموقف الاولي حيث الضغط يساوي الصفر....
   2. حساب التوتر غشاء من معادله لابلاس:
      2
      حيث ΔP هو ضغط الشفط علي الماصات الدقيقة ، R_p و r_v هي الماصة المجهرية والحويصلة الشعاعية (خارج الماصة المجهرية) علي التوالي. يتم تعريف سلاله المساحة السطحية (α) من الغشاء علي النحو التالي:
      3
      يجري المنطقة غشاء من حويصلة في ضغط الشفط اقل.
   3. احسب α من الزيادة في طول الإسقاط ΔL من حويصلة داخل الطرف الشعرية وفقا للمعادلة 4¹²:
      4
   4. وفي ظل نظام التوتر المنخفض جدا ، فان تجانس التموجات الحرارية يهيمن علي التوسع الظاهر. مؤامرة ln (σ) vs α. في القيم منخفضه الσ (عاده 0.001-0.5 mN. m^{− 113}) ، وهذا يعطي خط مستقيم الذي يرتبط الميل إلى معامل الانحناء ، K_b (الفترة الاولي من المعادلة 5)¹⁴:
      5
      ملاحظه: تحت التوترات العالية (> 0.5 mN. m^{− 1}) ، يتم قمع التموجات غشاء تماما وزيادة مساحة الغشاء نتيجة لزيادة التباعد بين الجزيئات. وفي هذا النظام ، تهيمن العبارة الثانية من المعادلة 5 وتتيح امكانيه الوصول إلى معامل الضغط المحلي K_a (الشكل 8 والشكل 9).

النتائج

مع البروتوكول المذكور أعلاه ، وقد درسنا مختلفه الاصطناعية العملاقة اونياميلار الحويصلة (GUV) ، التي تم الحصول عليها من فوسفورية: 2-oleoyl-1-بالميتويل--سغليرو-3-فوسفونوكولين (popc) ، بوليمر ثلاثي الكتل: بولي (ايثيل_{الأكسيد})-ب-بولي (ديميثيلسيلاوكسان)-بي-بولي (ايثي...

Discussion

ان طلاء الماصات المجهرية هو أحد النقاط الرئيسية للحصول علي قياسات موثوقه. يجب منع التصاق الحويصلة بالماصة ، ويشيع استخدام الطلاء في الأدب^{17،18،19،20،21}، مع جيش صرب الجمهورية ، β-الكازين أو surfasil. ونادرا م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment and materials for micropipette design
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.
Filament installed	Sutter Instrument Co.	FB255B	2.5mm*2.5mm Box Filament
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97
Microforge	NARISHGE Co.	MF-900	fitted with two objectives (10x and 32x)
Materials for coating pipette tips with BSA
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)	Sigma-Aldrich	10735078001
Disposable 1 ml syringe Luer Tip	Codan	62.1612
Disposable 10 ml syringe Luer Tip	Codan	626616
Disposable 5 ml syringe Luer Tip	Codan	62.5607
Disposable acetate cellulose filter	Cluzeau Info Labo	L5003SPA	Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm
Flexible Fused Silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies.	TSP530660	Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm,
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT	Hamilton Syringe Company	1750
Test tube rotatory mixer	Labinco	28210109
Micromanipulation Set up
Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series	Newport
Damped Optical Table	Newport		used as support of microscope to prevent external vibrations.
Micromanipulator	Eppendorf	Patchman NP 2	The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.
Micrometer	Mitutoyo Corporation	350-354-10	Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm
Plexiglass water reservoir (100 ml)	Home made
TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).	Leica
X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread	Newport
Materials for sucrose and amphiphile solution preparation
2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Sigma-Aldrich
Chloroform	VWR	22711.244
L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)	Sigma-Aldrich	810146C	Rhodamine tagged lipid
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Electroformation set up
10 µL glass capillary ringcaps	Hirschmann	9600110
Disposable 1 ml syringe Luer Tip	Codan	62.1612
H Grease	Apiezon	Apiezon H Grease	Silicon-free grease
Indium tin oxide coated glass slides	Sigma-Aldrich	703184
Needle	Terumo	AN2138R1	0.8 x 38 mm
Ohmmeter (Multimeter)	Voltcraft	VC140
Toluene	VWR	28676.297
Voltage generator	Keysight	33210A