Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

Resumo

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Resumo

Vesículas gigantes obtidas a partir de fosfolípidos e polímeros podem ser exploradas em diferentes aplicações: entrega de medicamentos controlados e direcionados, reconhecimento biomolecular dentro de biossensores para diagnóstico, membranas funcionais para células artificiais e desenvolvimento de micro/nanores bioinspirados. Em todas essas aplicações, a caracterização de suas propriedades de membrana é de fundamental importância. Entre as técnicas de caracterização existentes, a aspiração micropipette, pioneira por E. Evans, permite a medição de propriedades mecânicas da membrana, como modulus de compresibilidade de área, modulus de flexão e estresse e tensão de lise. Aqui, apresentamos todas as metodologias e procedimentos detalhados para obter vesículas gigantes a partir da película fina de um lipídico ou copolímero (ou ambos), a fabricação e o tratamento superficial de micropipettes e o procedimento de aspiração que leva à medição de todos os parâmetros mencionados anteriormente.

Introdução

Vesículas gigantes obtidas a partir de fosfolípidos (lipossomos) têm sido amplamente utilizados desde a década de 1970 como o modelo de membrana celular básica¹. No final da década de 1990, as morfologias vesiculares obtidas a partir da automontagem de copolímeros, denominadas polimerasias em referência aos seus análogos lipídicos^2,3, rapidamente apareceram como uma alternativa interessante aos lipossomas que possuem estabilidade mecânica fraca e má funcionalidade química modular. No entanto, seu caráter biomimético celular é bastante limitado em comparação com os lipossomos, uma vez que estes últimos são compostos de fosfolípidos, o principal componente da membrana celular. Além disso, sua baixa permeabilidade da membrana pode ser um problema em algumas aplicações, como a entrega de drogas, onde a difusão controlada de espécies através da membrana é necessária. Recentemente, a associação de fosfolípidos com polímeros de bloco para projetar vesículas e membranas polímeras-lipídios híbridas tem sido objeto de um número crescente de estudos^4,5. A idéia principal é projetar entidades que combinam sinergicamente os benefícios de cada componente (biofuncionalidade e permeabilidade de bicamadas lipídicas com a estabilidade mecânica e versatilidade química das membranas polímeras), que podem ser exploradas em diferentes aplicações: entrega de medicamentos controlados e direcionados, reconhecimento biomolecular dentro de biossensores para diagnóstico, membranas funcionais para células artificiais, desenvolvimento de micro/nano-reatores de inspiração biológica.

Hoje em dia, diferentes comunidades científicas (bioquímicos, químicos, biofísicos, químicos-físicos, biólogos) têm um interesse crescente no desenvolvimento de um modelo de membrana celular mais avançado. Aqui, nosso objetivo é apresentar, o mais detalhado possível, metodologias existentes (eletroformação, aspiração micropipette) para obter e caracterizar as propriedades mecânicas das vesículas gigantes e os recentes modelos de membrana celular "avançada" que são vesículas gigantes lipídicas de polímero híbrido^4,5.

O objetivo desses métodos é obter medição confiável da compresibilidade da área e moduli de flexão da membrana, bem como seu estresse e tensão de lyse. Uma das técnicas mais comuns existentes para medir a rigidez de flexão de uma vesícula gigante é a análise de flutuação^6,7,com base na observação direta do microscópio de vídeo; mas isso requer grande flutuação visível da membrana, e não é sistematicamente obtido em membranas espessas (por exemplo, polimémersos). Modulus de compresibilidade de área pode ser determinada experimentalmente usando a técnica Langmuir Blodgett, mas na maioria das vezes em um monocamada⁸. A técnica de aspiração micropipette permite a medição de ambos moduli em um bicamada formando vesícula unilamellar gigante (GUV) em um experimento.

O seguinte método é apropriado para todas as moléculas ou macromoléculas anfofílicas capazes de formar bicamadas e, consequentemente, vesículas por eletroformação. Isso requer um caráter fluido do bicamada à temperatura da eletroformação.

Protocolo

1. Fabricação de micropipettes

NOTA: Aqui, micropipettes com um diâmetro interno que variam de 6 a 12 μm e um comprimento de cone em torno de 3-4 mm são necessários. Um método detalhado de fabricação de micropipette é descrito no seguinte.

1. Coloque o capilar de vidro borosilicato na barra de desenho do puxador e corrigir uma das extremidades, apertando o botão.
2. Cuidadosamente deslize o vidro através dos buracos ao lado da câmara do aquecedor.
3. Aperte o botão de aperto do outro lado.
4. Controle o tamanho da ponta e o comprimento do taper para conseguir as especificações desejadas. Para isso, otimizar parâmetros técnicos como temperatura de aquecimento, tração, velocidade, atraso e pressão. Aqui está um exemplo de um programa usado:
   Calor: 550 °C
   Puxar: 10 (Alcance da máquina: 0-255 em unidades arbitrárias)
   Velocidade: 30 (Alcance: 0-255 em unidades arbitrárias)
   Atraso: 1 (Intervalo: 0-255 em unidades arbitrárias)
   Pressão: 500 (Alcance: 0-999 em unidades arbitrárias)
5. Clique no PULL para executar os eventos definidos pelo programa. O capilar é então separado em duas micropipettes, cujas dimensões têm de ser ajustadas através de uma microforja.
6. Insira a micropipette no suporte de pipeta de metal da microforja (ver Figura 1). Usando o objetivo 10x, ajuste o estágio do microscópio e o manipulador da pipeta (movimento vertical e horizontal) até que a ponta da pipeta esteja perto da superfície do grânulo de vidro.
7. Pressione o interruptor do pé para derreter a conta de vidro. Abaixe a ponta e coloque-a em contato com a conta de vidro derretido. O vidro derretido fluirá na pipeta pela ação capilar. Espere alguns segundos até que o nível do vidro derretido atinja uma certa altura, como mostrado na inserção da Figura 1.
8. Pare o aquecimento removendo a pressão no interruptor do pé, e puxe rapidamente a ponta afastado usando o manipulador vertical da pipeta para causar uma ruptura afiada.
9. Repita os passos 1,7 e 1,8 até que o diâmetro desejado seja obtido (6 a 12 μm).
   NOTA: Para melhorar a precisão da medição do diâmetro, durante a última etapa, use um objetivo 32x equipado com um reticle.

2. Revestimento dicas pipette com BSA (albumina séte bovina)

1. Para preparar uma solução de 0,1 M de glicose contendo 1% wt. BSA em água pura.
   1. Pese 180 mg de pó de glicose, coloque em um tubo cônico de polipropileno de 15 mL e complete com 10 mL de água pura.
   2. Adicione 0,1 g de pó BSA e agite suavemente usando um misturador rotatório tubo de ensaio até a dissolução completa (aproximadamente 4 h).
2. Tome a solução com uma seringa ler descartável de 10 mL equipada com uma agulha. Uma vez preenchido, retire a agulha e instale um filtro de celulose de acetato de 0,22 μm. Preencha vários tubos de microcentrífuga de polipropileno (1,5 mL) que serão usados para mergulhar a ponta.
3. Coloque os capilares verticalmente em suportes. Abaixe o suporte e mergulhe a ponta na solução da glicose/BSA durante a noite. A solução deve aumentar cerca de 1 cm de altura por ação capilar.
4. Retire a ponta da pipeta da solução de glicose/BSA. Prepare 5 mL de solução de glicose de 0,1 M (diluir 90 mg de pó de glicose em 5 mL de água pura) e filtrar através de um filtro de celulose de acetato de 0,22 μm.
5. Encha a pipeta com a solução de glicose usando uma seringa de vidro 500 μL equipada com um capilar de sílica fundido flexível. Em seguida, retire toda a solução de glicose, sugando-o de volta e descartá-lo (Figura 2). Repita esta etapa várias vezes para remover o BSA ilimitado.

3. Formação de GUVs e GHUVs por eletroformação

NOTA: A eletroformação é um técnico comumente usado desenvolvido por Angelova⁹. Os procedimentos para obter uma câmara de eletroformação, depositar um filme lipídico ou polímero (ou ambos para GHUVs (Vesículas Unilamellares Híbridos Gigantes)) e hidratar o filme um campo elétrico alternativo são descritos no seguinte. O procedimento de coleta do GUV obtido também é descrito.

1. Preparação de soluções de anfifilos, sacarose e glicose
   1. Prepare uma solução de anfifilos a uma concentração de 1 mg/mL. Pese 10 mg de anfifilo e dissolva-se em 10 mL de clorofórmio. Mantenha a solução em frascos selados para evitar a evaporação solvente.
   2. Prepare uma solução de estoque de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rhodamina B sulfonyl) (DOPE-Rhod) em 1 mg/mL em clorofórmio.
   3. Adicione 10 μL de solução lipídica fluorescente à solução de anfifilos. Mantenha as soluções em frascos selados para evitar a evaporação solvente.
   4. Prepare soluções de sacarose e glicose a uma concentração de 0,1 M. Pesa 342 mg e 180 mg de sacarose e glicose, respectivamente, e dissolva-as em 10 mL de água pura.
2. Preparação da câmara de eletroformação
   NOTA: Diferentes materiais condutores podem ser usados para fazer um dispositivo de eletroformação (por exemplo, fios de platina¹⁰, agulhas inoxidáveis^11). A câmara de eletroformação é composta por dois slides ITO separados por um espaçador de borracha O-ring que foi cortado de um lado para criar uma abertura. Os slides estão conectados a um gerador de tensão através de dois fios elétricos (Figura 3 e Figura 4A).
   1. Limpe os slides de ITO com solvente orgânico (por exemplo, clorofórmio). Identifique a superfície condutora usando um ohmmeter.
   2. Anexe os fios elétricos no lado condutor usando fita adesiva.
   3. Depoimento de solução anfífilo
      1. Mergulhe um capilar na solução até que o nível aumente pela ação capilar e colete cerca de 5 μL da solução.
      2. Coloque o capilar em contato com o centro da placa de vidro ITO e espalhe suavemente a solução. Espere 10 segundos para garantir a evaporação completa solvente(Figura 4A).
      3. Repita este procedimento 3 vezes para cada lado.
   4. Adicione uma camada de graxa livre de silício em ambos os lados do espaçador de anel O aberto. Coloque-o ao redor da área de depoimento. Coloque o rosto condutor da segunda placa de vidro ITO na parte superior do espaçador.
   5. Coloque a câmara de eletroformação vácuo por 3 horas para remover quaisquer vestígios de solvente orgânico.
3. Procedimento de eletroformação
   1. Ligue os fios elétricos ao gerador.
   2. Use as seguintes configurações para o gerador:
      Tensão sinusoidal alternativa
      Frequência: 10 Hz
      Amplitude: 2 V_{de pico a pico}
      NOTA: A frequência e a duração da tensão ideal devem ser encontradas para cada sistema.
   3. Certifique-se de que a tensão é aplicada antes da injeção da solução na câmara.
   4. Injete 1 mL de solução usando uma seringa com agulha de diâmetro interno de 0,8 mm para encher a câmara. Remova bolhas eventuais.
   5. Deixe a câmara a tensão aplicada/frequência por 75 min(Figura 4B).
4. GUVs colheita
   1. Desligue o gerador.
   2. Usando seringa de 1 mL com agulha de diâmetro interno de 0,8 mm, sugar uma pequena parte da solução, a fim de produzir uma bolha de ar dentro da câmara. Incline ligeiramente a câmara, a fim de fazer esta bolha se mover dentro da câmara. Isso pode ajudar os GUVs a se separarem da superfície ito(Figura 4C).
   3. Sugar toda a solução e transferi-lo para um tubo de plástico 1 mL.
   4. Retire os fios e limpe os slides de ITO com solventes orgânicos (tolueno, em seguida, clorofórmio).

4. Micromanipulação criada

NOTA: O princípio da aspiração micropipette é sugar uma única vesícula através de uma micropipette de vidro, aplicando uma depressão. O comprimento da língua dentro da pipeta é medido em função da pressão de sucção. O revestimento de pipeta com BSA, descrito anteriormente, é essencial para prevenir ou minimizar qualquer adesão entre as membranas vesículas e a pipeta.

O protocolo é ilustrado abaixo.

1. Conexão cheia de tubulação e água do reservatório
   NOTA: O tanque cheio de água e o micrômetro são fixados a uma placa deslizante. Um contador digital com uma cabeça de micrômetro permite um deslocamento vertical do dispositivo em uma faixa de 0 a 2,5 cm e uma precisão de 1 μm. Uma tubulação de silício conecta o reservatório e o suporte capilar(Figura 5A).
   1. Encha o tanque com água pura. Conecte uma seringa descartável de 5 mL ao suporte capilar do metal através da tubulação do silicone e aspira para criar um fluxo de água do tanque ao suporte.
   2. Toque o tubo ligeiramente para eliminar bolhas de ar. Simultaneamente, levante o tanque de água para criar uma pressão positiva. A seringa de 5 mL ainda está ligada ao suporte.
   3. Após o revestimento e a limpeza de etapas descritas previamente (veja a etapa 2), encha um capillary com a solução da glicose até que uma gota dê forma na extremidade. Retire a tubulação de seringa do suporte de metal para criar um ligeiro fluxo de água em sua extremidade.
   4. Vire o capilar de cabeça para baixo e conecte a queda de glicose com o fluxo de água do suporte. Corrigir o capilar e o titular, ferrando-os juntos.
2. Posicione uma pipeta
   NOTA: Durante esta operação, o tanque de água ainda está posicionado no trilho de alumínio para manter uma pressão positiva.
   1. Pegue o palco de alumínio caseiro equipado com duas lâminas de vidro (anteriormente limpo com etanol) e cole-os com graxa de vácuo de cada lado. Instalá-lo no estágio do microscópio e formar um menisco entre os dois slides usando uma seringa de 1 mL contendo 0,1 M de glicose, como mostrado na Figura 5B, C.
   2. Coloque a pipeta e seu suporte na unidade motora do micromanipulador e aperte o botão de aperto.
   3. Use o joystick do painel de controle na modalidade grosseira para abaixar o micropipette perto do menisco da glicose. Ajuste a posição da ponta para o centro do menisco usando o modo fino.
   4. Segure a ponta imersa em glicose por alguns minutos para limpar sua superfície externa e interna (como uma pressão positiva é mantida, o fluxo de água vai enxaguar a superfície interna da pipeta para remover BSA não revestido).
   5. Guarde a posição da ponta no teclado micromanipulador e retire-a do menisco.
   6. Retire o menisco de glicose e substituí-lo por um fresco. Chupar 2 μL de GUVs em 0,1 M sacarose usando uma micropipette de 20 μL e coloque-a no menisco de glicose fresca. Observe no modo DIC (contraste de interferência diferencial) os GUVs localizados na parte inferior devido à diferença de densidade entre a sacarose (principalmente dentro do GUVs) e a glicose (principalmente fora dos GUVs).
   7. Quando as vesículas são ligeiramente esvaziadas, reinserir a pipeta de sucção e se concentrar na ponta. Definir a altura H₀ do tanque de água para o qual a pressão é quase 0. Para isso, aproveite as pequenas vesículas ou partículas que estão naturalmente presentes na solução e ajustar a altura do tanque de água até que o movimento dessas partículas seja interrompido.
   8. Neste ponto, cercar o menisco com óleo mineral para evitar a evaporação da água, ver Figura 5D.
      NOTA: A temperatura ambiente deve ser controlada entre 20-22 °C usando ar condicionado.
3. Experimento de aspiração micropipette
   1. Abaixe a ponta da pipeta (6-12 μm no diâmetro) e crie uma sucção pequena (-1 cm) para aspirar uma vesícula (15-30 μm no diâmetro). A membrana do vesícula selecionado deve flutuar ligeiramente, e não deve apresentar quaisquer defeitos visíveis (sem bud ou filamento) (Figura 6).
   2. Elevá-lo a pipeta a um nível mais elevado para isolar a vesícula aspirada das outras vesículas, usando o micromanipulador e manter esta posição durante todo o experimento.
   3. Pré-estresse da vesícula, reduzindo o tanque cheio de água para aproximadamente -10 cm, em seguida, diminuir a pressão para retornar ao seu valor inicial (-1 cm). Repita esta etapa várias vezes para remover o excesso de membrana e pequenos defeitos da membrana.
   4. A partir de uma altura de -0,5 cm definida pela posição do tanque de água, diminuir lentamente a pressão de sucção com o micrômetro para chegar a um regime em que a membrana flutua. Em seguida, aumentar a pressão para visualizar claramente uma língua na ponta com um comprimento de projeção significativa (alguns mícrons).
      NOTA: A menor pressão aplicada (P₀₎que permite sugar o menor comprimento de projeção de membrana (L₀₎definirá o ponto de referência α₀ (Figura 7A). Todos os pontos da curva serão medidos de acordo com esta referência (ΔL = L-L₀ e ΔP = P-P_0).
   5. Aumentar a pressão de sucção com o micrômetro de forma passo a passo até atingir 0,5 -0,8 mN/m. A cada passo, espere 5 s e tire uma foto da língua. Este procedimento em baixa tensão permite a determinação do modulus da dobra.
   6. Continue aumentando a pressão de sucção de 0,5 mN/m para a tensão de ruptura, ajustando a altura da água cheia deslizando no trilho (variando de -2 a -50 cm) (Figura 7B-D). A partir deste experimento em regime de alta tensão, a área de compresibilidade modulus, tensão de lyse e tensão de lyse será medida.
   7. Estique cerca de 15-20 vesículas para adquirir estatísticas significativas. Cada experimento de aspiração micropipette leva entre 7 e 10 minutos. Realize a análise de imagem usando o software LASAF para medir o comprimento de projeção da língua, o diâmetro das vesículas e o raio do capilar.
4. Medição de modulus de flexão, modulus de compresibilidade da área, tensão de lyse e tensão de lyse
   1. Para acessar esses parâmetros, use o formalismo estabelecido por E. Evans¹². Calcule a pressão de sucção aplicada sobre a membrana da equação 1:
      Δ P = ρ_wg (h-h0) (1)
      onde g é a aceleração gravitacional (9,8 m ' s⁻²), ρ_w é a densidade da água (ρ = 1 gº cm^−3),h é a posição do tanque de água e h₀ é a posição inicial onde a pressão é igual a zero.
   2. Calcule a tensão da membrana da equação de Laplace:
      (2)
      onde δp é a pressão de sucção sobre a micropipette, R_p e R_v são a micropipette e vesicle radii (fora da micropipette), respectivamente. A tensão da área de superfície (α) da membrana é definida como:
      (3)
      sendo a área de membrana da vesícula na menor pressão de sucção.
   3. Calcule α a partir do aumento do comprimento de projeção δl de vesícula dentro da ponta capilar de acordo com a Equação 4¹²:
      (4)
   4. um regime de tensão muito baixa, a suavização das ondulações térmicas dobrando domina a aparente expansão. Enredo ln (σ) vs α. Em valores de baixo-σ (tipicamente 0,001-0,5 mN.m^−113),isso dá uma linha reta cuja inclinação está ligada ao modulus flexão, K_b (primeiro mandato da equação 5)¹⁴:
      (5)
      NOTA: altas tensões (> 0.5 mN.m^−1),ondulações de membrana são completamente suprimidas e a área da membrana aumenta como resultado do aumento do espaçamento entre moléculas. Neste regime, o segundo mandato da equação 5 domina e dá acesso à compresibilidade da área modulus K_a (Figura 8 e Figura 9).

Resultados

Com o protocolo acima mencionado, estudamos diferentes vesículas unilamellares sintéticas (GUV), obtidas a partir de um fosfolípido: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (POPC), um polímero tribloco: Poli (etileóxido)-b-Poly (dimetilsiloxane) -b-Poly (etilenoóxido) (PEO₁₂-b-PDMS₄₃-b-PEO₁₂) sintetizado em um estudo anterior¹³, e um diblock copolímero Poly (dimetilsiloxane) ...

Discussão

O revestimento da micropipette é um dos pontos-chave para obter medições confiáveis. A adesão da vesícula à micropipette deve ser evitada, e um revestimento é comumente usado na literatura^{17,18,19,20,21,}com BSA, β-casein ou surfasil. Detalhes do procedimento de revestimento raramente são mencionados.

A dissolução da BSA ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment and materials for micropipette design
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively.
Filament installed	Sutter Instrument Co.	FB255B	2.5mm*2.5mm Box Filament
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97
Microforge	NARISHGE Co.	MF-900	fitted with two objectives (10x and 32x)
Materials for coating pipette tips with BSA
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)	Sigma-Aldrich	10735078001
Disposable 1 ml syringe Luer Tip	Codan	62.1612
Disposable 10 ml syringe Luer Tip	Codan	626616
Disposable 5 ml syringe Luer Tip	Codan	62.5607
Disposable acetate cellulose filter	Cluzeau Info Labo	L5003SPA	Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm
Flexible Fused Silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies.	TSP530660	Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm,
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT	Hamilton Syringe Company	1750
Test tube rotatory mixer	Labinco	28210109
Micromanipulation Set up
Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series	Newport
Damped Optical Table	Newport		used as support of microscope to prevent external vibrations.
Micromanipulator	Eppendorf	Patchman NP 2	The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter.
Micrometer	Mitutoyo Corporation	350-354-10	Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm
Plexiglass water reservoir (100 ml)	Home made
TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).	Leica
X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread	Newport
Materials for sucrose and amphiphile solution preparation
2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Sigma-Aldrich
Chloroform	VWR	22711.244
L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)	Sigma-Aldrich	810146C	Rhodamine tagged lipid
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Electroformation set up
10 µL glass capillary ringcaps	Hirschmann	9600110
Disposable 1 ml syringe Luer Tip	Codan	62.1612
H Grease	Apiezon	Apiezon H Grease	Silicon-free grease
Indium tin oxide coated glass slides	Sigma-Aldrich	703184
Needle	Terumo	AN2138R1	0.8 x 38 mm
Ohmmeter (Multimeter)	Voltcraft	VC140
Toluene	VWR	28676.297
Voltage generator	Keysight	33210A