الترقيع المهندس بالأنسجة لإعادة بناء المريء المحيطي في الفئران

In Gul Kim; Yanru Wu; Su A. Park; Hana Cho; Jung-Woog Shin; Eun-Jae Chung

doi:10.3791/60349

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

إعادة بناء المريء هو إجراء صعب ، وتطوير المريء المهندسة الأنسجة التي تمكن من تجديد الغشاء المخاطي المريء والعضلات والتي يمكن زرعها كطعم اصطناعي أمر ضروري. هنا ، نقدم بروتوكولنا لتوليد المريء الاصطناعي ، بما في ذلك تصنيع السقالات ، وزراعة المفاعلات الحيوية ، والتقنيات الجراحية المختلفة.

Abstract

استخدام المواد المتوافقة بيولوجيا لإعادة بناء المريء المحيطي هو مهمة صعبة من الناحية الفنية في الفئران ويتطلب تقنية زرع الأمثل مع الدعم الغذائي. في الآونة الأخيرة ، كانت هناك العديد من المحاولات في هندسة أنسجة المريء ، ولكن معدل النجاح كان محدودًا بسبب صعوبة الظهارة المبكرة في البيئة الخاصة للتمعش. هنا ، قمنا بتطوير مريء اصطناعي يمكن أن يحسن تجديد الغشاء المخاطي للمريء وطبقات العضلات من خلال سقالة أنبوبية ذات طبقتين ، ونظام مفاعل حيوي قائم على الخلايا الجذعية المتوسطة ، وتقنية تغذية مجازة مع تعديل استئصال المعدة. تتكون السقالة من ألياف النانو من البولي يوريثين (PU) في شكل أسطواني مع حبلا بوليكابرولاكتكونون مطبوع ثلاثي الأبعاد (3D) ملفوفحول الجدار الخارجي. قبل زرع، تم زرع الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من الإنسان في تجويف السقالة، وأجريت زراعة المفاعل الحيوي لتعزيز التفاعل الخلوي. لقد قمنا بتحسين معدل البقاء على قيد الحياة من خلال تطبيق الأنستوم الجراحي وتغطية الطرف الاصطناعي المزروع برفرف الغدة الدرقية ، يليه تغذية مؤقتة غير العضو المعدي غير الفموي. وكانت هذه الطعوم قادرة على تلخيص نتائج الظهارية الأولية وتجديد العضلات حول المواقع المزروعة، كما يتضح من التحليل النسيجي. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت زيادة ألياف الإيلاستين والأوعية الدموية الجديدة في محيط الكسب غير المشروع. لذلك، يقدم هذا النموذج تقنية جديدة محتملة لإعادة بناء المريء المحيطي.

Introduction

يمكن أن يؤدي علاج اضطرابات المريء، مثل التشوهات الخلقية وسرطان المريء، إلى فقدان الجزء الهيكلي للمريء. في معظم الحالات ، تم تنفيذ الطعوم البديلة الذاتية ، مثل قنوات سحب المعدة أو تداخل القولون ،¹^،^2. ومع ذلك ، فإن هذه بدائل المريء لديها مجموعة متنوعة من المضاعفات الجراحية ومخاطر إعادة التشغيل^3. وهكذا ، فإن استخدام سقالات المريء المهندسة الأنسجة التي تحاكي المريء الأصلي يمكن أن يكون استراتيجية بديلة واعدة لإعادة تجديد الأنسجة المفقودة في نهاية المطاف⁴^،⁵^،^6.

على الرغم من أن المريء المهندسة الأنسجة يحتمل أن يقدم بديلا للعلاجات الحالية من عيوب المريء، وهناك حواجز كبيرة لتطبيقه في الجسم الحي. تسرب الأنستوموموت بعد الجراحة ونخر سقالة المريء المزروعة يؤدي حتما إلى عدوى قاتلة من الفضاء العقيم المحيطة بها، مثل mediastinum^7. لذلك ، من المهم للغاية منع تلوث الطعام أو اللعاب في الجرح والأنبوب الأنفي. وينبغي النظر في استئصال المعدة أو التغذية عن طريق الوريد حتى يتم الانتهاء من التئام الجروح الأولية. حتى الآن ، تم إجراء هندسة أنسجة المريء في نماذج الحيوانات الكبيرة لأنه لا يمكن تغذية الحيوانات الكبيرة إلا عن طريق فرط الوريد لمدة 2-4 أسابيع بعد زرع السقالة^8. ومع ذلك ، لم يتم إنشاء مثل هذا النموذج التغذية غير الشفوية للبقاء على قيد الحياة في وقت مبكر بعد زرع المريء في الحيوانات الصغيرة. وذلك لأن الحيوانات كانت نشطة للغاية ولا يمكن السيطرة عليها ، لذلك لم تتمكن من الحفاظ على أنبوب التغذية في بطونها لفترة طويلة من الزمن. لهذا السبب، كانت هناك حالات قليلة من زرع المريء الناجح في الحيوانات الصغيرة.

في ضوء ظروف هندسة الأنسجة المريء، قمنا بتصميم سقالة أنبوبي من طبقتين تتكون من ألياف نانوية كهربائية (طبقة داخلية. الشكل 1A)وحبلا ً مطبوعًا ثلاثي الأبعاد (الطبقة الخارجية؛ الشكل 1B)بما في ذلك تقنية استئصال المعدة المعدلة. يرصد الألياف النانوية الداخلية من PU، البوليمر غير قابلة للتحلل، ويمنع تسرب الطعام واللعاب. مصنوعة خيوط المطبوعة الخارجية 3D من البولي كابرولاكدون القابلة للتحلل (PCL)، والتي يمكن أن توفر المرونة الميكانيكية والتكيف مع الحركة المعتمية. تم بذر الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من الدهنية البشرية (hAD-MSCs) على الطبقة الداخلية من السقالة لتعزيز إعادة النعت. يمكن لهيكل الألياف النانوية تسهيل التجدد المخاطي الأولي من خلال توفير بيئة مصفوفة خارج الخلية الهيكلية (ECM) لهجرة الخلايا.

كما قمنا بزيادة معدل البقاء على قيد الحياة والنشاط الحيوي للخلايا المنهوجة من خلال زراعة المفاعلات الحيوية. تم تغطية السقالة المزروعة برفرف الغدة الدرقية لتمكين تجديد أكثر استقرارًا للغشاء المخاطي للمريء وطبقة العضلات. في هذا التقرير ، نصف بروتوكولات تقنيات هندسة أنسجة المريء ، بما في ذلك تصنيع السقالات ، وزراعة الخلايا الجذعية القائمة على الخلايا الحيوية ، وتقنية التغذية الالتفافية مع استئصال المعدة المعدل ، والجراحة المعدلة تقنية anastomosis لإعادة بناء المريء المحيطي في نموذج الفئران.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC رقم 17-0164-S1A0) في مستشفى جامعة سيول الوطنية على جميع الطرق المذكورة هنا.

1. تصنيع السقالات

ملاحظة: يتم تصنيع سقالات المريء ذات الطبقات الثانية من خلال الجمع بين الغزل الكهربائي والطباعة ثلاثية الأبعاد. تم تصنيع الغشاء الداخلي للسقالة الأنبوبية بواسطة البولي يوريثين الكهربائي (PU) مع المندرات الفولاذية غير القابل للصدأ الدورية كما هواة جمع⁹.

لإعداد الألياف النانوية PU أنبوبي، وإعداد 20٪ (ث / v) حل البوليمر PU عن طريق التحريك في N،N-dimethylformmee (DMF) لمدة 8 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ضع محلول PU على الحقنة مع إبرة معدنية حادة (22 G) ، وelectrospin على المُدرّس اتّحادي الفولاذ المقاوم للصدأ (قطره = 2 مم) على مسافة 30 سم بين طرف الإبرة والجامع الدوار.
ملاحظة: يتم تعيين إمدادات الطاقة إلى تيار مباشر عالي الجهد من 15 كيلوفولت المحتملة. يتم تثبيت معدل تغذية المحلول عند 0.5 مل / ساعة باستخدام مضخة حقنة.
جعل طبقة الألياف النانوية أنبوبي على سطح المندريل الدورية في 3.14 م / ثانية.
جفف الألياف النانوية PU في فرن فراغ في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها لإزالة المذيبات المتبقية تماما.
ملاحظة: يتم إعداد الجدار الخارجي ثلاثي الأبعاد للسقالة المريئية باستخدام نظام النماذج الأولية السريع. تتكون معدات الطباعة ثلاثية الأبعاد من موزع وفوهة ووحدة تحكم ضغط / حرارة ومرحلة تحويل ثلاثية المحاور ونظام برامج.
يتم إذابة الكريات PCL في 100 درجة مئوية في اسطوانة التدفئة ومن ثم طباعتها على سطح الألياف النانوية في الضغط العالي (7 بار) تحت سيطرة نظام bioplott. حجم الفوهة هو 300 ميكرون ومسافة حبلا هو 700 ميكرون.
بعد إزالة السقالة ذات الطبقات من المندريل، قم بتعقيمها عن طريق نقع الإيثانول بنسبة 70٪ تحت الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: تم الإبلاغ عن خصائص أكثر تفصيلا من السقالة في الدراسات السابقة¹⁰.

2. البذر الخلية على الطعوم وزراعة المفاعلات الحيوية

ملاحظة: تم استخدام الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من الدهنية البشرية (hMSCs) التي تم شراؤها من شركة دون تعديل.

قبل زرع الخلايا، قم بتعقيم سقالة المريء المطبوعة ثلاثية الأبعاد لمدة ساعة واحدة تحت الأشعة فوق البنفسجية، وبللها لمدة 10 دقيقة مع الإيثانول، واغسلها 3x بمادة الكالسيوم العازلة للفوسفات (PBS).
الثقافة وتوسيع hMSCs في متوسط النمو (القاعدية المتوسطة / تكملة النمو). تم نقل السقالات الأنبوبية ذات الطبقتين إلى لوحات زراعة أنسجة الآبار غير الملتصقة بـ 24.
لإرفاق الخلايا بالسطح الداخلي للسقالة، أضف تعليق hMSC بلطف بكثافة 1 × 10⁶ خلايا / مل في مصفوفة غشاء الطابق السفلي التي تحتوي على وسط النمو.
إيداع موحد ة في الطابق السفلي غشاء تعليق مصفوفة على السطح الداخلي للسقالة أنبوبي طبقتين.
إصلاح بحزم سقالة أنبوبي hMSC المصنفة إلى حامل الاكريليك في غرفة الثقافة من المفاعل الحيوي باستخدام نظام مفاعل حيوي تدفق النابض.
ملاحظة: يتكون نظام المفاعل الحيوي المصمم خصيصًا من مضخة ، فخ فقاعة ، غرفة تدفق ، مقياس ضغط ، صمام يمكن التحكم فيه ، وخزان متوسط. عند تطبيق إجهاد القص في غرفة الثقافة ، اسمح بوقت راحة 1-2 دقيقة^11.
إضافة متوسط النمو إلى غرفة الثقافة وتطبيق 0.1 dyne/cm² ضغط القص الناجم عن التدفق تحت جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂^10.
ملاحظة: تم حساب قيمة إجهاد القص الناجم عن التدفق عن طريق محاكاة تشعب أنسجة المريء المشتقة من جسم الإنسان من الدراسات السابقة^10.
تحديد الاستجابات الخلية على الأسطح الداخلية من السقالات أنبوبي طبقتين دون زراعة مفاعل حيوي بعد 5 أيام باستخدام حية / DEAD Viability اختبار كيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحصول على الصور عبر المجهر confocal باستخدام أداة Z-مكدس.
في اليوم الثالث، لاحظ مورفولوجيا السطح للسقالة الأنبوبية المبذرة hMSC من خلال المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM).
1. إصلاح السقالة التي تم احتضانها مع hMSC مع 2.5٪ الجلوتولالديهيد وOsO4 لمدة 24 ساعة والمجففة مع الإيثانول.
2. معطف hMSCs ثابتة مع البلاتين باستخدام معطف سبوت تحت الظروف الجوية الأرجون والحصول على صور SEM في الجهد المتسارع من 25 كيلوفولت.

3. التحضير الجراحي لجراحة الحيوان

ملاحظة: يتم تطبيق المستحضرات الجراحية قبل كل من استئصال المعدة وزرع المريء.

إعداد الأدوات الجراحية العقيمة: شفرة مشرط، Weitlaner المتراجع، حامل microneedle، ملقط microsuture، ملقط الأنسجة الدقيقة، microscissors، مايو-هيغار حامل إبرة، مقص التشغيل، مقص القزحية، ملقط خلع الملابس، ملقط الأنسجة، ملقط منشقة، ملقط قزحية العينة، 5 مل حقنة (21 G إبرة)، 10 مل حقنة (22 G إبرة)، 9-0 خياطة البولي أميد، 4-0 البوليجلاكتين خياطة.
تخدر الحيوان مع حقن عضلي من تيلتامين / زولازيبام (50 ملغ / غرام جرعة) و 2٪ xylazine هيدروكلوريد (2 ملغ / كغ جرعة).
ملاحظة: استخدمت فئران سبراغ-داولي (SD) البالغة التي تزن 398-420 جم لزرع المريء.
قبل الانتقال إلى الستائر الجراحية ، تحقق من حالة التخدير المناسبة للكائن الحيواني عن طريق قرص الذيل بالملقط.
ضع الحيوان في وضع الثنية على الستائر المعقمة واستخدم المقصات لإزالة الشعر من الرقبة (لزراعة المريء) أو البطن (لاستئصال المعدة). ثم فرك الموقع الجراحي مع البيتادين والإيثانول 70٪.
قبل الشق، حقن مسكن تحت الجلد مثل البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغم/كغ) لتخفيف الألم.

4. جراحة استئصال المعدة باستخدام أنبوب تي في الفئران

ملاحظة: تم إجراء عملية تعديل في جميع الحيوانات التجريبية في جميع الحيوانات التجريبية للسماح المؤقت ة بالتغذية بالأنابيب غير الأوروبية (n = 5).

لديك الفئران الصيام في اليوم السابق للجراحة. إعداد الجراحة كما هو الحال في القسم 3.
كشف المعدة من خلال شق خط الوسط من الجلد وعضلات البطن من الفئران الهضاب.
إنشاء فتحة 3 ملم في جدار المعدة الأمامي مع شفرة مشرط.
أدخل طرف أنبوب T السيليكون في موقع العيب لإصلاحه في جدار المعدة.
خياطة بشكل صحيح بحيث T-أنبوب لا ينفصل عن جدار المعدة.
أخرج الطرف القاصي من الأنبوب T المزروع عبر النفق تحت الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة.
أدخل غطاء الهيبارين إلى نهاية الأنبوب T لمنع محتويات المعدة من التدفق إلى الوراء.
ملاحظة: استخدم قسطرة أنجيولة لتوصيل نهاية الأنبوب T بغطاء الهيبارين.
خياطة جميع طبقات جدار البطن والجلد باستخدام 4-0 خيوط البوليجلاكتين.
إبقاء جميع الفئران التجريبية منفصلة في قفص التمثيل الغذائي بعد الانتهاء من استئصال المعدة.

5. زرع المريء

ملاحظة: يتم إجراء زرع المريء للسقالة الأنبوبية ذات الطبقات ذات طبقتين بعد أسبوع واحد من استئصال المعدة (n = 5). قبل عملية الزرع، وتطعيم hMSCs (كثافة الخلية: 1 × 10⁶ خلايا / مل في مصفوفة غشاء الطابق السفلي) في الجدار الداخلي لكل سقالة واحتضان لمدة 3 أيام في نظام المفاعل الحيوي. الإجراء الجراحي هو على النحو التالي.

إزالة شعر الرقبة من الحيوانات نموذج وأداء اللف القياسية للموقع الجراحي لعملية جراحية العقيم.
ملاحظة: يوصى بإنشاء منطقة حلاقة كبيرة للحفاظ على جراحة متشككة على الحيوان.
بعد شق متوسط الأمامي من الرقبة، فصل العضلات حزام وفضح بنية القصبة الهوائية.
تشريح العصب المبهم بشكل صريح من المريء قبل استئصال الجزء ، وإلا فإن تنفس الحيوان يتعرض للخطر.
تحت التكبير، عزل الجانب الأيسر من المريء من القصبة الهوائية وفصل بعناية الجزء العلوي من الغدة الدرقية.
إنشاء عيب محيطي كامل بطول 5 مم يحتوي على جميع طبقات المريء باستخدام المقص الجراحي.
ملاحظة: قبل زرع المريء، اقطع السقالات المعدة باستخدام مقص جراحي ليتناسب مع طول موقع الزرع.
تحت المجهر، قم بإجراء التطبيب المجهري على طرفي عيب المريء القاصي باستخدام خيط خياطة 9-0. ضع أول خياطة بين الهامش الأيمن الفيرذي الخلفي لبقايا المريء العلوية والسقالة. مواصلة خياطة من اليمين إلى اليسار بين بقايا المريء العلوي والسقالة. Anastomose السقالة بنفس الطريقة التي الهامش العلوي من بقايا المريء السفلي.
ملاحظة: إجراء التهاب الأوعية الدموية الدقيقة كما هو مستخدم في الجراحة السريرية لزراعة المريء. العمل مع المجهر لخياطة دقيقة ومحكم من موقع زرع.
بعد ذلك ، ضع رفرف الغدة الدرقية المحيط فوق الموقع المزروع لضمان الصيانة المستقرة وإمداد الأوعية الدموية للطعوم.
بعد الزرع، قم بخياطة العضلات وأنسجة الجلد تحت الجلد بخياطة 4-0 فيكريل.
إبقاء جميع الفئران التجريبية بشكل فردي في أقفاص التمثيل الغذائي.

6 - الإجراءات السارية بعد العملية الجراحية

ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراءات بعد الجراحة بعد كل من استئصال المعدة وزرع المريء.

بعد إغلاق جرح البطن ، ضع الفئران في أقفاص التمثيل الغذائي الفردية ووضع الأقفاص على أجهزة الاحترار بالأشعة تحت الحمراء لمنع انخفاض حرارة الجسم.
مراقبة الحيوانات حتى تحقيق والحفاظ على الرّكالة القصّة (أي، الكذب منتصباً على الصدر).
لتقليل الالتهاب في موقع الجراحة ، قم بإعطاء المضادات الحيوية جنتاميسين (20 ملغ / كجم) يوميًا للفئران.
ابدأ التغذية السائلة عن طريق الفم في اليوم الثالث بعد الجراحة حتى نقطة النهاية للدراسة. توريد صيغة التغذية بأكملها (20.6 غ/100 مل [ز%] الكربوهيدرات, 3.8 ز% بروتين, 0.2 ز% الدهون) من خلال غطاء الهيبارين 3x يوميا ابتداء من اليوم التالي للجراحة.
تحقق من مظهر الحيوانات ووزن الجسم يوميًا. تحقق لإدارة السلوك، مثل موقع شق إيذاء الذات أو مقاومة مدخول الأنبوب، فضلا عن المضاعفات الجراحية المختلفة. عندما ينخفض وزن الجسم من نماذج الفئران بسرعة بنسبة 20٪ أو أكثر، أداء القتل الرحيم عن طريق استنشاق CO_2.

7- علم الأنسجة والكيمياء المناعية

ملاحظة: للتحليل النسيجي، يتم استخراج جميع أنسجة المريء للحيوانات القتل الرحيم باستخدام مقص جراحي. تم تنفيذ هيماتوكسيلين وتلطيخ الإيوسين وتلطيخ ثلاثي الكروم في ماسون باستخدام تقنيات الهيماتوكسيلين القياسية. تم إجراء الكيمياء المناعية وفقا للبروتوكول التالي.

إصلاح المريء كله يحتوي على المواقع المزروعة في 4٪ paraformaldehyde. إنشاء كتلة البارافين وقطع 4 ميكرون أقسام سميكة.
deparaffinize أقسام الأنسجة وتجفيف ها في سلسلة الإيثانول. تزج الشرائح الأنسجة في المخزن المؤقت المنديل والحرارة لمدة 10 دقيقة في الميكروويف. تبريد الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة لمدة 20 دقيقة. تزج في بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 6 دقيقة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
احتضان في 3٪ الألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لمنع ردود الفعل غير محددة من أقسام الأنسجة.
غسل 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ضد Desmin (المخفف إلى 1:200)، الكيراتين 13 (المخفف إلى 1:100)، وفون ويلبراند عامل (vWF؛ المخفف إلى 1:100) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
غسل 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة بتركيز 1:500 لDesmin والكيراتين 13 في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: تم احتضان أقسام الأنسجة لـ vWF باستخدام مجموعة من البيروكسيديز الفجّر (انظر جدول المواد)ثم تم تصورها باستخدام 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
جبل باستخدام غطاء زجاجي و 4',6-diamidino-2-الفينوليندول (DAPI) التي تحتوي على تركيب المتوسطة.

النتائج

ويبين الشكل 1 رسما تخطيطيا لعملية تصنيع السقالة الأنبوبية ذات الطبقات الثانية PU-PCL. وكان حل PU electrospun من إبرة 18 G لجعل بنية داخلية أسطوانية بسماكة 200 ميكرومتر. ثم، تم طباعة PCL ذاب على الجدار الخارجي للألياف النانوية PU على فترات منتظمة. يمكن رؤية مورفولوجيا الس...

Discussion

لا تزال الدراسات الحيوانية الحالية على المريء الاصطناعي محدودة بعدة عوامل حاسمة. يجب أن تكون سقالة المريء الاصطناعية المثالية متوافقة بيولوجيًا ولها خصائص فيزيائية ممتازة. يجب أن تكون قادرة على تجديد ظهارة الغشاء المخاطي في الفترة المبكرة بعد الجراحة لمنع تسرب anastomotic. تجديد الطبقات العض...

Disclosures

وقد تم تسويق نظام المفاعل الحيوي المصمم لهذه الدراسة (رقم النموذج: ACBF-100).

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل مشروع البحث والتطوير في مجال تكنولوجيا الصحة في كوريا من خلال معهد تطوير الصناعة الصحية الكوري (KHIDI) ، الذي تموله وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI16C0362) وأبحاث العلوم الأساسية برنامج من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة التربية والتعليم (2017R1C1B2011132). تم توفير العينات الحيوية والبيانات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل البنك الحيوي لمستشفى جامعة سيول الوطنية، وهو عضو في شبكة بيوبنك الكورية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO₄	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014

References

Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: