Greffe tissulaire pour la reconstruction oesophagielle circonférence chez les rats

Résumé

La reconstruction oesophagienne est une procédure difficile, et le développement d’un oesophage tissulaire qui permet la régénération de la muqueuse et du muscle oesophagiens et qui peut être implanté comme une greffe artificielle est nécessaire. Ici, nous présentons notre protocole pour générer un oesophage artificiel, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteurs, et diverses techniques chirurgicales.

Résumé

L’utilisation de matériaux biocompatibles pour la reconstruction oesophagienne circonférence est une tâche techniquement difficile chez les rats et nécessite une technique d’implant optimale avec un soutien nutritionnel. Récemment, il y a eu beaucoup de tentatives à l’ingénierie oesophagielle de tissu, mais le taux de succès a été limité en raison de la difficulté dans l’épithélisation tôt dans l’environnement spécial du péristaltisme. Ici, nous avons développé un oesophage artificiel qui peut améliorer la régénération de la muqueuse oesophagienne et des couches musculaires à travers un échafaudage tubulaire à deux couches, un système de bioréacteur à base de cellules souches mésenchymales, et une technique d’alimentation de dérivation avec modifié Gastrostomy. L’échafaudage est fait de nanofibres de polyuréthane (PU) en forme cylindrique avec un brin de polycaprolactone imprimé en trois dimensions (3D) enroulé autour de la paroi extérieure. Avant la transplantation, les cellules souches mésenchymales d’origine humaine ont été ensemiées dans le lumen de l’échafaudage, et la culture de bioréacteur a été exécutée pour augmenter la réactivité cellulaire. Nous avons amélioré le taux de survie de greffe en appliquant l’anastomose chirurgicale et couvrant la prothèse implantée avec un aileron de glande thyroïde, suivi de l’alimentation nonorale temporaire de gastrostomy. Ces greffes ont pu récapituler les résultats de l’épithélialization initial et de la régénération de muscle autour des emplacements implantés, comme démontré par l’analyse histologique. En outre, des fibres d’élastine accrues et la néovascularisation ont été observées dans la périphérie de la greffe. Par conséquent, ce modèle présente une nouvelle technique potentielle pour la reconstruction oesophagielle cirférent.

Introduction

Le traitement des désordres oesophagiens, tels que les malformations congénitales et les carcinomes oesophagiens, peut mener à la perte structurale de segment de l’oesophage. Dans la plupart des cas, des greffes de remplacement autologues, telles que des conduits gastriques ou des interpositions du côlon, ont été effectuées^1,2. Cependant, ces remplacements oesophagiens ont une variété de complications chirurgicales et de risques de réopération³. Ainsi, l’utilisation d’échafaudages d’œsophage tissulaires imitant l’œsophage indigène peut être une stratégie alternative prometteuse pour finalement régénérer les tissus perdus^4,5,6.

Bien qu’un oesophage tissulaire offre potentiellement une alternative aux traitements actuels des défauts oesophagiens, il existe des barrières importantes pour son application in vivo. La fuite anastomotique postopératoire et la nécrose de l’échafaudage oesophagique implanté mènent inévitablement à une infection mortelle de l’espace aseptique environnant, tel que le mediastinum^7. Par conséquent, il est extrêmement important de prévenir la contamination des aliments ou de la salive dans la plaie et le tube nasogastrique. La gastrostomie ou la nutrition intraveineuse devrait être envisagée jusqu’à ce que la cicatrisation primaire des plaies soit terminée. À ce jour, l’ingénierie des tissus oesophagiens a été réalisée dans de grands modèles animaux parce que les grands animaux ne peuvent être nourris que par hyperalimentation intraveineuse pendant 2-4 semaines après l’implantation de l’échafaudage⁸. Cependant, un tel modèle d’alimentation non orale n’a pas été établi pour la survie tôt après la transplantation oesophagienne chez de petits animaux. C’est parce que les animaux étaient extrêmement actifs et incontrôlables, de sorte qu’ils ne pouvaient pas garder le tube d’alimentation dans leur estomac pendant une longue période de temps. Pour cette raison, il y a eu peu de cas de transplantation oesophagique réussie chez de petits animaux.

Compte tenu des circonstances de l’ingénierie des tissus oesophagiens, nous avons conçu un échafaudage tubulaire à deux couches composé de nanofibres électrospun (couche intérieure; Figure 1A) et un brin imprimé en 3D (couche extérieure; Figure 1B) incluant une technique de gastrostomie modifiée. La nanofibre interne est faite de PU, un polymère non dégradable, et empêche les fuites de nourriture et de salive. Les brins imprimés 3D externes sont faits de polycaprolactone biodégradable (PCL), qui peut fournir une flexibilité mécanique et s’adapter au mouvement péristaltique. Des cellules souches mésenchymales dérivées de l’adipose humaine (HAD-MSCs) ont été ensemiées sur la couche interne de l’échafaudage pour favoriser la réépithhéliarisation. La structure nanofibre peut faciliter la régénération muqueuse initiale en fournissant un environnement structurel de matrice extracellulaire (ECM) pour la migration cellulaire.

Nous avons également augmenté le taux de survie et la bioactivité des cellules inoculées grâce à la culture de bioréacteurs. L’échafaudage implanté a été recouvert d’un rabat de glande thyroïde pour permettre une régénération plus stable de la muqueuse oesophagienne et de la couche musculaire. Dans ce rapport, nous décrivons des protocoles pour des techniques d’ingénierie de tissu oesophagées, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteur sénchymal à base de cellules souches, une technique d’alimentation de dérivation avec gastrostomy modifié, et une chirurgie modifiée technique d’anastomosis pour la reconstruction oesophagienne circonféide dans un modèle de rat.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC no 17-0164-S1A0) de l’Hôpital universitaire national de Séoul.

1. Fabrication d’échafaudages

REMARQUE : Les échafaudages oesophagiens à deux couches sont fabriqués en combinant l’électrospinning et l’impression 3D. La membrane interne de l’échafaudage tubulaire a été fabriquée par le polyuréthane électrospinning (PU) avec des mandrels en acier inoxydable rotatifs comme les collecteurs⁹.

1. Pour la préparation des nanofibres tubulaires PU, préparer une solution de 20% (w/v) de polymère PU en remuant dans N,N-dimethylformamide (DMF) pendant 8 h à température ambiante.
2. Placez la solution PU sur la seringue à l’aide d’une aiguille métallique émoussée (22 g) et électrospinez sur des mandrels en acier inoxydable rotatifs (diamètre de 2 mm) à une distance de 30 cm entre l’extrémité de l’aiguille et le collecteur rotatif.
   REMARQUE : L’alimentation est réglé sur un courant direct à haute tension d’un potentiel de 15 kV. Le taux d’alimentation de la solution est fixé à 0,5 ml/h à l’aide d’une pompe à seringues.
3. Faire une couche tubulaire de nanofibre sur la surface du mandrel tournant à 3.14 m/s.
4. Séchez la nanofibre PU dans un four à vide à 40 oC pendant la nuit pour enlever complètement le solvant résiduel.
   REMARQUE : La paroi extérieure imprimée en 3D de l’échafaudage oesophagine est préparée à l’aide d’un système de prototypage rapide. L’équipement d’impression 3D se compose d’un distributeur, d’une buse, d’un contrôleur de compression/chaleur, d’un stade de conversion à 3 axes et d’un système logiciel.
5. Les granulés de PCL sont dissous à 100 oC dans un cylindre de chauffage, puis imprimés à la surface des nanofibres à haute pression (7 barres) sous le contrôle d’un système de bioplotting. La taille de la buse est de 300 m et la distance du brin est de 700 m.
6. Après avoir retiré l’échafaudage à deux couches du mandrel, stériliser en trempant dans 70% d’éthanol sous la lumière ultraviolette.
   REMARQUE : Des caractéristiques plus détaillées de l’échafaudage ont été rapportées dans des études antérieures¹⁰.

2. Ensemencement cellulaire sur les greffes et la culture de bioréacteurs

REMARQUE : Les cellules souches mésenchymales dérivées de l’adipose humaine (HMSCs) achetées à une entreprise ont été utilisées sans modification.

1. Avant la transplantation cellulaire, stériliser l’échafaudage de l’œsophage imprimé en 3D pendant 1 h sous la lumière ultraviolette, mouiller pendant 10 min avec de l’éthanol, et le laver 3x avec du phosphate tamponné saline (PBS).
2. Culture et d’élargir les hMSCs dans le milieu de croissance (supplément de moyenne/croissance de base). Des échafaudages tubulaires à deux couches ont été transférés dans 24 plaques de culture de tissu de puits non adhérentes.
3. Pour attacher les cellules à la surface intérieure de l’échafaudage, ajouter délicatement la suspension hMSC à une densité de 1 x 10⁶ cellules/mL dans la matrice de membrane du sous-sol contenant le milieu de croissance.
4. Déposez uniformément la suspension de la matrice membranaire du sous-sol sur la surface intérieure de l’échafaudage tubulaire à deux couches.
5. Fixez fermement l’échafaudage tubulaire ensemencé de hMSC au support acrylique dans la chambre de culture du bioréacteur à l’aide d’un système de bioréacteur à débit pulsatile.
   REMARQUE : Le système de bioréacteur conçu sur mesure se compose d’une pompe, d’un piège à bulles, d’une chambre d’écoulement, d’une jauge de pression, d’une soupape contrôlable et d’un réservoir moyen. Lorsque vous appliquez le stress de cisaillement dans la chambre de culture, prévoir un temps de repos de 1-2 min¹¹.
6. Ajouter le milieu de croissance à la chambre de culture et appliquer 0,1 dyne/cm² stress de cisaillement induit par le flux sous une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂¹⁰.
   REMARQUE : La valeur du stress de cisaillement induit par le flux a été calculée en simulant le péristaltisme du tissu oesophagien dérivé du corps humain des études précédentes¹⁰.
7. Déterminer les réponses cellulaires sur les surfaces intérieures des échafaudages tubulaires à deux couches sans culture de bioréacteur après 5 jours à l’aide d’un kit d’analyse de viabilité LIVE/DEAD selon les instructions du fabricant. Obtenir des images par microscopie confocale à l’aide de l’outil Z-stack.
8. Le troisième jour, observez la morphologie de surface de l’échafaudage tubulaire ensemié par le hMSC à l’aumicro à balayage (SEM).
   1. Fixer l’échafaudage qui a été incubé avec hMSC avec 2,5% de glutaraldéhyde et OsO4 pendant 24 h et déshydrater avec de l’éthanol.
   2. Enrober les HMSC fixes de platine à l’aide d’un enduit de creusdans dans des conditions atmosphériques d’argon et obtenir des images SEM à une tension d’accélération de 25 kV.

3. Préparation chirurgicale pour la chirurgie animale

REMARQUE : Les préparations chirurgicales sont appliquées avant la gastrostomy et la transplantation oesophagielle.

1. Configurez les instruments chirurgicaux stériles : lame de scalpel, rétracteur de Weitlaner, support de microaiguille, forceps de microsuture, forceps de microtissue, microscissors, support d’aiguille de Mayo-Hegar, ciseaux d’opération, ciseaux d’iris, forceps d’habillage, forceps de tissu, forceps d’éclat, forceps d’iris, seringue de 5 ml (21 G d’aiguille), seringue de 10 ml (22 G aiguille), 9-0 suture polyamide, 4-0 suture de polyglactin.
2. Anesthésiez l’animal par injection intramusculaire de tiletamine/zolazepam (50 mg/g de dose) et 2 % d’hydrochlorure de xylazine (2 mg/kg de dose).
   REMARQUE : Des rats adultes de Sprague-Dawley (SD) pesant 398-420 g ont été employés pour la transplantation oesophagielle.
3. Avant de transférer sur le drapé chirurgical, vérifiez l’état anesthésique approprié de l’animal en pinçant la queue avec les forceps.
4. Placez l’animal en position de supine sur le drapé stérile et utilisez des tondeuses pour enlever les poils du cou (pour la transplantation oesophagielle) ou de l’abdomen (pour la gastrostomie). Ensuite, frottez le site chirurgical avec de la bêtadine et 70% de l’éthanol.
5. Avant l’incision, injectez sous-cutanée un analgésique comme la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg) pour soulager la douleur.

4. Chirurgie gastrostomy utilisant un T-tube chez les rats

REMARQUE : Une gastrostomie modifiée a été effectuée chez tous les animaux expérimentaux afin de permettre l’alimentation temporaire par voie de contournement non orale (n - 5).

1. Avoir des rats vite la veille de la chirurgie. Préparer la chirurgie comme dans la section 3.
2. Exposer l’estomac par une incision médiane de la peau et les muscles abdominaux des rats anesthésiés.
3. Créer un orifice de 3 mm dans la paroi gastrique antérieure avec une lame de scalpel.
4. Insérez la pointe du tube T en silicone dans le site du défaut pour le fixer à la paroi de l’estomac.
5. Suture correctement de sorte que le tube T ne se détache pas de la paroi gastrique.
6. Sortez l’extrémité distale du tube T implanté par le tunnel sous-cutané à l’arrière du cou.
7. Insérez le bouchon d’héparine à l’extrémité du tube T pour empêcher le contenu de l’estomac de couler vers l’arrière.
   REMARQUE : Utilisez un angiocatheter pour relier l’extrémité du tube T avec le bouchon d’héparine.
8. Suturer toutes les couches de la paroi abdominale et de la peau à l’aide de 4-0 sutures en polyglactatine.
9. Gardez tous les rats expérimentaux séparés dans une cage métabolique après la gastrostomie a été terminée.

5. Transplantation oesophagée

REMARQUE : La transplantation oesophagielle de l’échafaudage tubulaire à deux couches est effectuée 1 semaine après la gastrostomie (n ' 5). Avant la transplantation, inoculez les HMSC (densité cellulaire : 1 x 10⁶ cellules/mL dans la matrice de membrane du sous-sol) dans la paroi interne de chaque échafaudage et incubez pendant 3 jours dans le système de bioréacteur. L’intervention chirurgicale est la suivante.

1. Enlever les poils du cou des animaux modèles et effectuer le drapage standard du site chirurgical pour la chirurgie aseptique.
   REMARQUE : Il est recommandé de créer une grande aire de rasage pour maintenir la chirurgie asceptic sur l’animal.
2. Après l’incision médiane antérieure du cou, séparez les muscles de courroie et exposez la structure tracheoesophageal.
3. Disséquer carrément le nerf vague de l’œsophage avant de réséquer le segment, sinon la respiration de l’animal est compromise.
4. Sous grossissement, isoler le côté gauche de l’œsophage de la trachée et séparer soigneusement la partie supérieure de la glande thyroïde.
5. Créer un défaut circoncire complet de 5 mm de long contenant toutes les couches de l’œsophage à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
   REMARQUE : Avant la transplantation oesophagielle, coupez les échafaudages préparés à l’aide de ciseaux chirurgicaux pour correspondre à la longueur du site de transplantation.
6. Sous un microscope, effectuer la microanastomose aux deux extrémités du défaut oesophagique distal à l’aide d’un fil de suture 9-0. Placez la première suture entre la marge inferopostérieure droite du reste et de l’échafaudage de l’œsophage supérieur. Continuer à suturer de droite à gauche entre le reste de l’œsophage supérieur et l’échafaudage. Anastomose l’échafaudage de la même manière que la marge supérieure du reste inférieur de l’œsophage.
   REMARQUE : Exécutez l’anastomose microvasculaire comme utilisé dans la chirurgie clinique pour la transplantation oesophagienne. Travaillez avec un microscope pour une suture précise et étanche du site de l’implant.
7. Ensuite, aplatissez le rabat environnant de glande thyroïde au-dessus du site transplanté pour assurer le maintien stable et l’approvisionnement vasculaire aux greffes.
8. Après la transplantation, coudre le muscle sous-cutané et le tissu cutané avec une suture vicryl 4-0.
9. Gardez tous les rats expérimentaux individuellement dans des cages métaboliques.

6. Procédures postopératoires

REMARQUE : Les procédures postopératoires sont exécutées après la gastrostomy et la transplantation oesophagielle.

1. Après la fermeture de la plaie abdominale, mettre les rats dans des cages métaboliques individuelles et placer les cages sur des dispositifs de réchauffement infrarouge pour prévenir l’hypothermie.
2. Surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils atteignent et maintiennent la charge sternale (c.-à-d., couché droit sur la poitrine).
3. Pour minimiser l’inflammation au site chirurgical, administrer la gentamicine antibiotique (20 mg/kg) quotidiennement aux rats.
4. Commencer l’alimentation liquide orale le troisième jour postopératoire jusqu’au point final de l’étude. Fournir l’ensemble de la formule nutritionnelle (20,6 g/100 ml [g%] de glucides, 3,8 g% de protéines, 0,2 g% de matières grasses) à travers le bouchon d’héparine 3x par jour à partir du lendemain de la chirurgie.
5. Vérifiez l’apparence et le poids des animaux tous les jours. Vérifier pour gérer le comportement, comme l’automutilation site d’incision ou de résistance à la prise de tube, ainsi que diverses complications chirurgicales. Lorsque le poids corporel des modèles de rats diminue rapidement de 20 % ou plus, effectuez l’euthanasie par inhalation de CO_2.

7. Histologie et immunohistochimie

REMARQUE : Pour l’analyse histologique, tout le tissu oesophagique des animaux euthanasiés est extrait à l’aide de ciseaux chirurgicaux. La coloration de l’hématoxylin et de l’éosine et la coloration trichrome de Masson ont été exécutées en utilisant des techniques histologiques standard. L’immunohistochimie a été exécutée selon le protocole suivant.

1. Fixer l’œsophage entier contenant les sites transplantés dans 4% de paraformaldéhyde. Créez un bloc de paraffine et coupez des sections de 4 m d’épaisseur.
2. Déparaffiniser les sections de tissus et les déshydrater dans une série d’éthanol. Immerger les lames de tissu dans un tampon de citrate et chauffer pendant 10 minutes au micro-ondes. Refroidir les cellules avec du PBS froid pendant 20 min. Immerger dans 3 % de peroxyde d’hydrogène pendant 6 min, et laver avec du PBS pendant 10 min.
3. Incuber dans 3% d’albumine de sérum bovin (BSA) pendant 1 h à température ambiante pour bloquer les réactions non spécifiques des sections de tissu.
4. Laver 3x avec PBS pendant 5 min. Incuber avec des anticorps primaires contre Desmin (dilué à 1:200), kératine 13 (dilué à 1:100), et von Willebrand Factor (vWF; dilué à 1:100) pendant la nuit à 4 oC.
5. Laver 3x avec PBS pendant 15 min. Incuber avec l’anticorps secondaire approprié à une concentration de 1:500 pour Desmin et Kératine 13 à température ambiante. Ensuite, lavez les diapositives deux fois avec DU PBS pendant 10 min.
   REMARQUE : Des sections de tissu pour vWF ont été incubées à l’aide d’un kit conjugué au peroxidase de raifort (voir Tableau des matériaux)et ensuite visualisées à l’aide de 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
6. Mont à l’aide d’un couvercle en verre et 4',6-diamidino-2-phénolindole (DAPI) contenant le milieu de montage.

Résultats

La figure 1 montre un diagramme schématique du processus de fabrication de l’échafaudage tubulaire à deux couches PU-PCL. La solution PU a été électrospun à partir d’une aiguille de 18 G pour faire une structure interne cylindrique d’une épaisseur de 200 m. Ensuite, le PCL fondu a été imprimé sur la paroi extérieure de la nanofibre PU à intervalles réguliers. La morphologie de surface des parois intérieures et extérieures de l’échafau...

Discussion

Les études animales existantes sur l’oesophagi artificiel sont encore limitées par plusieurs facteurs critiques. L’échafaudage oesophagique artificiel idéal doit être biocompatible et avoir d’excellentes propriétés physiques. Il devrait pouvoir régénérer l’épithélium muqueux dans la période postopératoire tôt pour empêcher la fuite anastomotique. La régénération des couches musculaires longitudinales circulaires et externes est également importante pour le péristaltisme fonctionnel

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014