Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti

Riepilogo

La ricostruzione esofagea è una procedura impegnativa e lo sviluppo di un esofago tissutale che consente la rigenerazione della mucosa e del muscolo esofageo e che può essere impiantato come un innesto artificiale. Qui, presentiamo il nostro protocollo per generare un esofago artificiale, tra cui la produzione di scaffold, la coltivazione di bioreattori e varie tecniche chirurgiche.

Abstract

L'uso di materiali biocompatibili per la ricostruzione esofagea circonferenziale è un compito tecnicamente impegnativo nei ratti e richiede una tecnica di impianto ottimale con supporto nutrizionale. Recentemente, ci sono stati molti tentativi di ingegneria dei tessuti esofagei, ma il tasso di successo è stato limitato a causa della difficoltà nell'epitelizzazione precoce nell'ambiente speciale della peristalsi. Qui, abbiamo sviluppato un esofago artificiale che può migliorare la rigenerazione della mucosa esofagea e degli strati muscolari attraverso uno scaffold tubolare a due strati, un sistema di bioreattore basato su cellule staminali mesenchymal, e una tecnica di alimentazione di bypass con modifica Gastrostomy. L'impalcatura è fatta di nanofibre di poliuretano (PU) in forma cilindrica con un filo policaprolactone stampato tridimensionale (3D) avvolto intorno alla parete esterna. Prima del trapianto, le cellule staminali mesenchimale derivate dall'uomo venivano seminata nel lume dell'impalcatura, e la coltivazione del bioreattore è stata eseguita per migliorare la reattività cellulare. Abbiamo migliorato il tasso di sopravvivenza dell'innesto applicando l'anastomosi chirurgica e coprendo la protesi impiantata con un lembo della ghiandola tiroidea, seguita da alimentazione temporanea della gastrostomia non orale. Questi innesti sono stati in grado di ricapitolare i risultati dell'epitelializzazione iniziale e della rigenerazione muscolare intorno ai siti impiantati, come dimostrato dall'analisi istologica. Inoltre, sono state osservate fibre di elastina aumentate e neovascolarizzazione nella periferia dell'innesto. Pertanto, questo modello presenta una nuova potenziale tecnica per la ricostruzione esofagea circonferenziale.

Introduzione

Il trattamento dei disturbi esofagei, come malformazioni congenite e carcinomi esofagei, può portare alla perdita di segmento strutturale dell'esofago. Nella maggior parte dei casi, gli innesti di sostituzione autologia, come condotti gastrici pull-up o interposizioni del colon, sono stati eseguiti^1,2. Tuttavia, queste sostituzioni esofagee hanno una varietà di complicazioni chirurgiche e rischi di rioperazione³. Così, l'uso di scaffold di esofago tessuto-ingegnerizzato imitando l'esofago nativo può essere una strategia alternativa promettente per rigenerare i tessuti persi^4,5,6.

Anche se un esofago tessuto-ingegnerizzato potenzialmente offre un'alternativa agli attuali trattamenti di difetti esofagei, ci sono barriere significative per la sua applicazione in vivo. Perdite anastomotiche postoperatorie e necrosi dell'impalcatura esofagea impiantata portano inevitabilmente a un'infezione letale dello spazio asettico circostante, come il mediastinum⁷. Pertanto, è estremamente importante prevenire la contaminazione da cibo o saliva nella ferita e nel tubo nasogastrico. La gastrostomia o la nutrizione endovenosa devono essere considerati fino a quando la guarigione della ferita primaria è completata. Ad oggi, l'ingegneria dei tessuti esofagei è stata eseguita in grandi modelli animali perché i grandi animali possono essere alimentati solo da iperalimentativi per 2-4 settimane dopo l'impianto dell'impalcatura⁸. Tuttavia, tale modello di alimentazione non orale non è stato stabilito per la sopravvivenza precoce dopo il trapianto di esofageo in piccoli animali. Questo perché gli animali erano estremamente attivi e incontrollabili, quindi non potevano tenere il tubo di alimentazione nello stomaco per un lungo periodo di tempo. Per questo motivo, ci sono stati pochi casi di successo del trapianto esofageo in piccoli animali.

Tenuto conto delle circostanze dell'ingegneria esofagea del tessuto, abbiamo progettato uno scaffold tubolari a due strati costituito da nanofibre elettrospun (strato interno; Figura 1A) e un filo stampato in 3D (strato esterno; Figura 1B) compresa una tecnica di gastrostomia modificata. La nanofibra interna è fatta di PU, un polimero non degradabile, e previene la fuoriuscita di cibo e saliva. I fili stampati in 3D esterni sono fatti di policaprolactone (PCL) biodegradabile, in grado di fornire flessibilità meccanica e adattarsi al movimento peristale. Le cellule staminali mesenchymale di derivazione adiposa umana (hAD-MSC) sono state seminate sullo strato interno dello scaffold per promuovere la ri-epiterizzazione. La struttura in nanofibra può facilitare la rigenerazione iniziale delle mucosali fornendo un ambiente strutturale a matrice extracellulare (ECM) per la migrazione cellulare.

Abbiamo anche aumentato il tasso di sopravvivenza e la bioattività delle cellule inoculate attraverso la coltivazione di bioreattori. L'impalcatura impiantata è stata coperta con un lembo della ghiandola tiroidea per consentire una rigenerazione più stabile della mucosa esofagea e dello strato muscolare. In questa relazione, descriviamo protocolli per tecniche di ingegneria tissutale esofagea, tra cui la produzione di scaffold, la coltivazione di bioreattori basati sulle cellule staminali mesenchymale, una tecnica di alimentazione di bypass con gastrostomia modificata e una anastomosi per la ricostruzione esofagea circonferenziale in un modello di ratto.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC N. 17-0164-S1A0) del Seoul National University Hospital.

1. Produzione di scaffold

NOTA: gli scaffold esofagei a due strati vengono prodotti combinando l'elettrospinning e la stampa 3D. La membrana interna dell'impalcatura tubolare è stata fabbricata mediante poliuretano elettrostrato (PU) con maciandi rotanti in acciaio inossidabile come i collettori⁹.

1. Per la preparazione di nanofibre tubolari PU, preparare una soluzione del 20% (w/v) di polimero PU mescolando in N,N-dimetilformamide (DMF) per 8 h a temperatura ambiente.
2. Posizionare la soluzione PU sulla siringa con un ago metallico smussato (22 G) ed elettrospin su masteri in acciaio inossidabile rotanti (diametro 2 mm) ad una distanza di 30 cm tra la punta dell'ago e il collettore rotante.
   NOTA: l'alimentazione è impostata su una corrente diretta ad alta tensione di 15 kV potenziale. Il tasso di alimentazione della soluzione è fissato a 0,5 mL/h utilizzando una pompa di siringa.
3. Fare uno strato di nanofibra tubolare sulla superficie del mandrel ruotando a 3,14 m / s.
4. Asciugare la nanofibra PU in un forno a vuoto a 40 gradi durante la notte per rimuovere completamente il solvente residuo.
   NOTA: La parete esterna stampata in 3D dell'impalcatura esofagea viene preparata utilizzando un sistema di prototipazione rapida. L'apparecchiatura di stampa 3D è costituita da un dispenser, ugello, controller di compressione/calore, fase di conversione a 3 assi e sistema software.
5. I pellet PCL vengono disciolti a 100 gradi centigradi in un cilindro di riscaldamento e quindi stampati sulla superficie delle nanofibre ad alta pressione (7 bar) sotto il controllo di un sistema di bioplotting. La dimensione dell'ugello è di 300 m e la distanza del filo è di 700 m.
6. Dopo aver rimosso l'impalcatura a due strati dal mandrel, sterilizzare immergendo in 70% etanolo sotto la luce ultravioletta.
   NOTA: Caratteristiche più dettagliate dell'impalcatura sono state riportate in studi precedenti¹⁰.

2. Semina a cellule sugli innesti e sulla coltivazione del bioreattore

NOTA: Le cellule staminali mesenchimiche adipose umane (hMSC) acquistate da un'azienda sono state utilizzate senza modifiche.

1. Prima del trapianto di cellule, sterilizzare l'impalcatura dell'esofago stampato in 3D per 1 h sotto la luce ultravioletta, umida per 10 minuti con etanolo e lavarla 3 volte con il salina con buffer fosfato (PBS).
2. Cultura ed espandere gli hMSC in mezzo di crescita (supplemento basale medio/crescita). Le impalcature tubolari a due strati sono state trasferite in piastre di coltura dei tessuti ben a due strati.
3. Per attaccare le cellule alla superficie interna dello scaffold, aggiungere delicatamente la sospensione hMSC ad una densità di 1 x 10⁶ cellule / mL nella matrice della membrana seminterrato contenente il mezzo di crescita.
4. Depositare uniformemente la sospensione della matrice della membrana del seminterrato sulla superficie interna dell'impalcatura tubolare a due strati.
5. Fissare saldamente l'impalcatura tubolare con semi hMSC al supporto acrilico nella camera di coltura del bioreattore utilizzando un sistema di bioreattore a flusso pulsatile.
   NOTA: il sistema di bioreattore su misura è costituito da una pompa, una trappola a bolle, una camera di flusso, un misuratore di pressione, una valvola controllabile e un serbatoio medio. Quando si applica lo stress di taglio nella camera di coltura, lasciare un tempo di riposo di 1-2 min¹¹.
6. Aggiungere il mezzo di crescita alla camera di coltura e applicare lo stress di taglio indotta dal flusso 0,1 dine/cm² sotto un'atmosfera umidizzata contenente il 5% di CO₂^10.
   NOTA: Il valore dello stress da taglio indotto dal flusso è stato calcolato simulando la peristalsi del tessuto esofageo derivato dal corpo umano da studi precedenti¹⁰.
7. Determinare le risposte delle cellule sulle superfici interne degli scaffold tubolari a due strati senza coltivazione del bioreattore dopo 5 giorni utilizzando un kit di test di sostenibilità LIVE/DEAD secondo le istruzioni del produttore. Ottenere immagini tramite microscopia confocale utilizzando lo strumento stack z.
8. Il terzo giorno, osservare la morfologia superficiale dell'impalcatura tubolare con semi hMSC attraverso un microscopio elettronico a scansione (SEM).
   1. Fissare l'impalcatura che è stata incubata con hMSC con 2,5% glutaraldeide e OsO4 per 24 h e disidratare con etanolo.
   2. Rivestire gli hMSC fissi con platino utilizzando un rivestimento sputter in condizioni atmosferiche argon e ottenere immagini SEM ad una tensione accelerata di 25 kV.

3. Preparazione chirurgica per la chirurgia animale

NOTA: I preparati chirurgici vengono applicati prima sia della gastrostomia che del trapianto di esofageo.

1. Impostare gli strumenti chirurgici sterili: lama Di scalpello, retrattore Weitlaner, portamicroa, pinze a microsutura, pinze mistoli, microscissors, porta aghi Mayo-Hegar, forbici operative, forbici da iride, pinze a medicazione, pinze tissutali, pinze scheggiate, pinze da iride, siringhe da 5 mL (21 G di ago), 10 mL di siringa (22 G di ago), 9-0 sutura poliammide, sutura poliglactina 4-0.
2. Anestetizzare l'animale con un'iniezione intramuscolare di tiletamina/zolazepam (dose di 50 mg/g) e 2% di idrocloruro di xilisina (dose di 2 mg/kg).
   NOTA: per il trapianto di esofageo sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (SD) adulti del peso di 398-420 g.
3. Prima di passare al drappo chirurgico, controllare le condizioni anestetiche appropriate dell'animale pizzicando la coda con le pinze.
4. Posizionare l'animale in posizione supina sul drappo sterile e utilizzare i clipper per rimuovere i capelli dal collo (per il trapianto di esofageo) o dall'addome (per la gastrostomia). Quindi strofinare il sito chirurgico con betadine e 70% etanolo.
5. Prima dell'incisione, iniettare sottocutaneamente un analgesico come la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per alleviare il dolore.

4. Chirurgia della gastrostomia Utilizzando un t-tube in Rats

NOTA: È stata eseguita una gastrostomia modificata in tutti gli animali sperimentali per consentire l'alimentazione temporanea dei tubi non orali di bypass (n ) .

1. Avere i ratti veloce il giorno prima dell'intervento chirurgico. Preparare l'intervento chirurgico come nella sezione 3.
2. Esporre lo stomaco attraverso un'incisione mediana della pelle e muscoli addominali dei ratti anestesi.
3. Creare un orifizio di 3 mm nella parete gastrica anteriore con una lama del bisturi.
4. Inserire la punta del tubo T in silicone nel sito del difetto per fissarlo alla parete dello stomaco.
5. Sutura correttamente in modo che il tubo T non si stacca dalla parete gastrica.
6. Estrarre l'estremità distale del tubo T impiantato attraverso il tunnel sottocutaneo nella parte posteriore del collo.
7. Inserire il tappo dell'eparina alla fine del tubo T per evitare che il contenuto dello stomaco scora all'indietro.
   NOTA: Utilizzare un angiocatheter per collegare l'estremità del tubo A con il tappo di eparina.
8. Suturare tutti gli strati della parete addominale e della pelle utilizzando suture di poliglactin 4-0.
9. Tenere separati tutti i ratti sperimentali in una gabbia metabolica dopo che la gastrostomia è stata completata.

5. Trapianto esofageo

NOTA: Il trapianto esofageo dell'impalcatura tubolare a due strati viene eseguito 1 settimana dopo la gastrostomia (n . 5). Prima del trapianto, inoculare hMSC (densità cellulare: 1 x 10⁶ cellule /mL nella matrice della membrana seminterrato) nella parete interna di ogni scaffold e incubare per 3 giorni nel sistema di bioreattore. La procedura chirurgica è la seguente.

1. Rimuovere i peli del collo degli animali modello ed eseguire drappeggiamento standard del sito chirurgico per la chirurgia asettica.
   NOTA: Si consiglia di creare una vasta area di rasatura per mantenere la chirurgia ascetica sull'animale.
2. Dopo l'incisione mediana anteriore del collo, separare i muscoli della cinghia ed esporre la struttura tracheoesofagea.
3. Sezionata mente il nervo vago dall'esofago prima di resedire il segmento, altrimenti la respirazione dell'animale è compromessa.
4. Sotto ingrandimento, isolare il lato sinistro dell'esofago dalla trachea e separare con cura la parte superiore dalla ghiandola tiroidea.
5. Creare un difetto circonferenziale completo lungo 5 mm contenente tutti gli strati dell'esofago utilizzando forbici chirurgiche.
   NOTA: Prima del trapianto esofageo, tagliare le impalcature preparate utilizzando forbici chirurgiche per abbinare la lunghezza del sito di trapianto.
6. Al microscopio, eseguire microanastomosi a entrambe le estremità del difetto esofageo distale utilizzando un filo di sutura 9-0. Posizionare la prima sutura tra il margine inferoposteriore destro del residuo e l'impalcatura dell'esofago superiore. Continuare a suturare da destra a sinistra tra il residuo dell'esofago superiore e l'impalcatura. Anastomosi l'impalcatura allo stesso modo del margine superiore del residuo dell'esofago inferiore.
   NOTA: Eseguire l'anastomosi microvascolare utilizzata nella chirurgia clinica per il trapianto esofageo. Lavorare con un microscopio per una sutura precisa e a tenuta stagna del sito dell'impianto.
7. Successivamente, posare il lembo della ghiandola tiroidea circostante sul sito trapiantato per garantire una manutenzione stabile e l'approvvigionamento vascolare agli innesti.
8. Dopo il trapianto, cucire il muscolo sottocutaneo e il tessuto cutaneo con una sutura vicle 4-0.
9. Conservare tutti i ratti sperimentali singolarmente in gabbie metaboliche.

6. Procedure post-operatorie

NOTA: Le procedure postoperatorie vengono eseguite dopo il trapianto di gastrostomia e di esofageo.

1. Dopo la chiusura della ferita addominale, mettere i ratti in gabbie metaboliche individuali e posizionare le gabbie su dispositivi di riscaldamento infrarossi per prevenire l'ipotermia.
2. Monitorare gli animali fino a quando non raggiungono e mantengono la recumbenza sternale (cioè, sdraiati in posizione verticale sul petto).
3. Per ridurre al minimo l'infiammazione nel sito chirurgico, somministrare quotidianamente la gentamicina antibiotica (20 mg/kg) ai ratti.
4. Iniziare l'alimentazione liquida orale nel terzo giorno postoperatorio fino al punto finale dello studio. Fornire l'intera formula nutrizionale (20,6 g/100 ml di carboidrati, 3,8 g% di proteine, 0,2 g% di grassi) attraverso il cappuccio dell'eparina 3x al giorno a partire dal giorno dopo l'intervento chirurgico.
5. Controllare l'aspetto degli animali e il peso corporeo ogni giorno. Controllare per gestire il comportamento, come il sito di incisione autolesionista o la resistenza all'assunzione del tubo, così come varie complicazioni chirurgiche. Quando il peso corporeo dei modelli di ratto diminuisce rapidamente del 20% o più, eseguire l'eutanasia per inalazione di CO_2.

7. Istologia e immunohistochimica

NOTA: Per l'analisi istologica, tutto il tessuto esofageo degli animali eutanasia viene estratto utilizzando forbici chirurgiche. L'ematossilina e la colorazione eosina e la colorazione tricromatica di Masson sono state eseguite utilizzando tecniche istologiche standard. L'immunoistochimica è stata eseguita secondo il seguente protocollo.

1. Fissare l'intero esofago contenente i siti trapiantati in 4% paraformaldeide. Creare un blocco di paraffina e tagliare 4 sezioni di spessore.
2. Deparaffina le sezioni di tessuto e disidratale in una serie di etanolo. Immergere i vetrini del tessuto nel tampone del citrato e riscaldare per 10 minuti nel microonde. Raffreddare le celle con PBS freddo per 20 min. Immergere nel 3% di perossido di idrogeno per 6 min e lavare con PBS per 10 min.
3. Incubare in 3% semaforo bovino albumina (BSA) per 1 h a temperatura ambiente per bloccare le reazioni non specifiche delle sezioni di tessuto.
4. Lavare 3x con PBS per 5 min. Incubare con anticorpi primari contro Desmin (diluito a 1:200), cheratina 13 (diluito a 1:100) e von Willebrand Factor (vWF; diluito a 1:100) durante la notte a 4 gradi centigradi.
5. Lavare 3x con PBS per 15 min. Incubare con l'anticorpo secondario appropriato ad una concentrazione di 1:500 per Desmin e Keratin 13 a temperatura ambiente. Quindi, lavare i vetrini due volte con PBS per 10 min.
   NOTA: le sezioni di tessuto per vWF sono state incubate utilizzando un kit coniugato di rafano (cfr. tabella dei materiali) e quindi visualizzate utilizzando 3,3'-diaminobenzidina (DAB).
6. Montaggio con coperchio in vetro e 4',6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) contenente supporto di montaggio.

Risultati

La figura 1 mostra un diagramma schematico del processo di produzione dello scaffold tubolare a due strati PU-PCL. La soluzione PU è stata elettrospun da un ago da 18 G per creare una struttura interna cilindrica con uno spessore di 200 m. Quindi, la PCL fusa è stata stampata sulla parete esterna della nanofibra PU a intervalli regolari. La morfologia superficiale delle pareti interne ed esterne dello scaffold tubolare completato può essere vista nelle imm...

Discussione

Gli studi esistenti sugli animali sull'esofago artificiale sono ancora limitati da diversi fattori critici. Lo scaffold esofageo artificiale ideale deve essere biocompatibile e avere eccellenti proprietà fisiche. Dovrebbe essere in grado di rigenerare l'epitelio mucosale nel primo periodo postoperatorio per prevenire perdite anastomiche. La rigenerazione degli strati muscolari longitudinali circolari ed esterni è importante anche per la peristalsi funzionale^12,13

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014