רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

Summary

שחזור הוושט הוא הליך מאתגר, ופיתוח של הוושט רקמה מהונדסים המאפשרת התחדשות של רירית הוושט ואת השריר, כי ניתן להשתיל כמו שתל מלאכותי הוא הכרחי. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו כדי ליצור ושט מלאכותי, כולל ייצור פיגום, טיפוח ביוריאקטור, וטכניקות ניתוח שונות.

Abstract

השימוש בחומרים ביולוגיים לשיקום הוושט הוא משימה מאתגרת מבחינה טכנית בחולדות ודורשת טכניקת שתל אופטימלית עם תמיכה תזונתית. לאחרונה, היו ניסיונות רבים הנדסת רקמת הוושט, אבל שיעור ההצלחה הוגבלה בשל קושי הרקמות המוקדמות בסביבה מיוחדת של פריסטלזיס. כאן, פיתחנו ושט מלאכותי שיכול לשפר את התחדשות רירית הוושט ואת שכבות השריר דרך פיגום שני שכבתית, תא גזע mesenchymal מבוססי מערכת, וטכניקת האכלה מעקף עם שינוי . הכול בסדר הפיגום עשוי פוליאוריתן (PU) ננו סיבים בצורת גליל עם תלת מימדי (3D) מודפס גדיל polycalacטונוס עטוף סביב הקיר החיצוני. לפני ההשתלה, בתאי גזע של mesenchymal, שנגזרו על ידי בני אדם הפכו לתוך לומן הפיגום, והטיפוח הביולוגי בוצע כדי לשפר את הפעילות החוזרת התאית. שיפרנו את שיעור ההישרדות של השתל על ידי החלת השקה כירורגי וכיסוי תותבת מושתל עם דש בלוטת התריס, ואחריו האכלה זמנית שאינם אוראלי הזנה. שתלים אלה הצליחו ללכוד את הממצאים של האפיתל הראשונית התחדשות שרירים סביב האתרים מושתל, כפי שניתן להדגים על ידי ניתוח היסטולוגית. בנוסף, הגדילו את סיבי האלסטין ו ניאוואסקולריזציה נצפו בפריפריה של השתל. לכן, מודל זה מציג טכניקה חדשה פוטנציאלית לשיקום הוושט.

Introduction

הטיפול בהפרעות הוושט, כגון מומים מולדים וקרצינומות הוושט, יכול להוביל לאובדן קטע מבניים של הוושט. ברוב המקרים, שתלי החלפת אוטוולוגי, כגון תעלות משיכה בקיבה או המעי הגס, בוצעו^1,2. עם זאת, אלה מחליפים הוושט יש מגוון של סיבוכים כירורגיים הפעלה מחדש סיכונים³. כך, השימוש ברקמות מהונדסים הוושט פיגומים קפלי מחקה את הוושט יליד יכול להיות אסטרטגיה חלופית מבטיח בסופו של דבר מתחדשות רקמות איבד^4,5,6.

למרות הוושט מהונדסים רקמות פוטנציאלי מציע חלופה לטיפולים הנוכחיים של פגמים הוושט, יש מחסומים משמעותיים עבור שלה ביישום vivo. פוסט anastomotic דליפה ונמק של הגרדום הוושט מושתל בהכרח להוביל זיהום קטלני של מרחב אספטי שמסביב, כגון קרומי⁷. לכן, חשוב מאוד למנוע זיהום של מזון או רוק בפצע ושפופרת הקיבה. יש לשקול את הטיפול בחלזונות או בעירוי עד להשלמת ריפוי הפצע הראשוני. עד כה, הנדסת רקמת הוושט בוצעה במודלים בעלי חיים גדולים, כי בעלי חיים גדולים ניתן להאכיל רק על ידי ורידי hyperalimentation עבור 2-4 שבועות לאחר השרטת של הגרדום⁸. עם זאת, מודל כזה האכלה ללא אוראלי לא הוקמה להישרדות מוקדמת לאחר השתלת הוושט בבעלי חיים קטנים. זה בגלל החיות היו פעילים מאוד בלתי נשלט, כך הם לא יכלו לשמור את צינור האכלה בבטן שלהם למשך זמן ממושך. מסיבה זו, היו מקרים מעטים של השתלת הוושט מוצלחת בבעלי חיים קטנים.

לאור הנסיבות של הנדסת רקמת הוושט, עיצבנו בשני שכבות פיגום צינורי המורכב של אלקטרוסיבי ננו (השכבה הפנימית; איור 1א) ו-גדיל מודפס תלת-ממדי (שכבה חיצונית; איור 1ב) כולל טכניקת הגמניפולציה שהשתנתה. הננו סיבים פנימיים עשוי פו, פולימר לא תכלה, ומונע דליפת המזון והרוק. הגדילים החיצוניים תלת-ממדיים עשויים מסיבי פוליקטטון מתכלה (PCL), אשר יכולים לספק גמישות מכנית ולהסתגל לתנועה הפריסטלטית. בתאי גזע האדם הנגזרים משומן האנושי (היה-MSCs) הופרה על השכבה הפנימית של הפיגום כדי לקדם את האפיתל החדש. מבנה nanofiber יכול להקל על התחדשות המקורי רירית ידי מתן מטריצה מבניים (ecm) הסביבה להעברת תאים.

כמו כן הגבירו את שיעור ההישרדות ואת הפעילות הביואקטיביות של התאים שחוסנו באמצעות טיפוח ביוריאקטור שחקן. הגרדום המושתל היה מכוסה בכנף בלוטת התריס כדי לאפשר התחדשות יציבה יותר של רירית הוושט ושכבת השריר. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקולים עבור טכניקות הנדסת רקמת הוושט, כולל ייצור הפיגום, mesenchymal גזע תא מבוסס וטיפוח ביוריאקטור, טכניקת האכלה מעקף עם הגסטרו שונה, ו כירורגי שונה טכניקת ההשקה לשיקום שחזור הוושט במודל חולדה.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC No. 17-0164-S1A0) של האוניברסיטה הלאומית של סיאול בית החולים.

1. ייצור פיגום

הערה: שני פיגומים על הוושט מיוצרים על ידי שילוב אלקטרורוטווד והדפסת תלת מימד. הקרום הפנימי של הפיגום הכרישים היה מפוברק על ידי אלקטרוטווייה פוליאוריטן (פו) עם מסתובב מפלדת אל-חלד כמו האספנים⁹.

1. להכנת הננו סיבים הכרישים הצינורי, להכין 20% (w/v) פתרון של הפוליאורטן פולימר על ידי ערבוב ב N, N-diמתילטופסממיד (DMF) עבור 8 h בטמפרטורת החדר.
2. מניחים את התמיסה פוליאורטן על המזרק עם מחט מתכת קהה (22 גרם), ו אלקטרוספין על סיבוב מנגו פלדת אל-חלד (קוטר = 2 מ"מ) במרחק של 30 ס מ בין קצה המחט והאספן המסתובב.
   הערה: ספק הכוח מוגדר כזרם ישיר במתח גבוה של 15 kV פוטנציאל. שיעור ההזנה של הפתרון הוא קבוע ב 0.5 mL/h באמצעות משאבת מזרק.
3. הפוך את שכבת ננו-סיב צינורי על פני השטח של המנל מסתובבת ב-3.14 m.
4. יבש את ה-ננוסיב הפוליאורטן בתנור ואקום ב-40 ° c למשך הלילה כדי להסיר לחלוטין את הממס השיורי.
   הערה: הקיר החיצוני המודפס בתלת-ממד של פיגום הוושט מוכן באמצעות מערכת אבי טיפוס מהירה. ציוד ההדפסה התלת-ממדי כולל מנפק, זרבובית, בקרי דחיסה/חום, שלב המרה של 3 צירים ומערכת תוכנה.
5. כדורי PCL מומסים ב-100 ° c בצילינדר חימום ולאחר מכן מודפסים על פני השטח של הננו-סיבים בלחץ גבוה (7 bar) תחת שליטתה של מערכת ביוביויובית. גודל החרירים הוא 300 יקרומטר ומרחק הגדיל הוא 700 יקרומטר.
6. לאחר הסרת הפיגום שתי שכבות מן mandrel, לעקר על ידי הטבילה ב 70% אתנול תחת אור אולטרה סגול.
   הערה: מאפיינים מפורטים יותר של הפיגום דווחו במחקרים קודמים¹⁰.

2. שזריעת תאים על השתלים וטיפוח ביוריאקטור

הערה: בתאי גזע האדם הנגזרים מהאדיפוז (hMSCs) שנרכשו מחברה שימשו ללא שינוי.

1. לפני השתלת תאים, לחטא את הוושט המודפס 3D לגרדום 1 h תחת אור אולטרה סגול, רטוב זה עבור 10 דקות עם אתנול, ולשטוף אותו 3d עם מלוחים מאגור פוספט (PBS).
2. תרבות ולהרחיב את hMSCs בינונית צמיחה (בסיס בינוני/גדילה תוסף). שתי שכבות של פיגומים עם כיריים הועברו ללוחות לוחיות התרבות של הרקמות.
3. כדי לחבר את התאים למשטח הפנימי של הפיגום, הוסף בעדינות את ההשעיה של hMSC בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/mL במטריצת מרתף ממברנה המכילה את מדיום הגידול.
4. הפקדה אחידה הבולם המרתף ממברנה ההשעיה על פני השטח הפנימי של הגרדום שני שכבתית.
5. מתקן בחוזקה את הפיגום הצינורי של hMSC עד למחזיק האקריליק בחדר התרבות של הביוריאקטור באמצעות מערכת זרימה ביוריאקטור.
   הערה: מערכת ביוריאקטור חקן מעוצב בהתאמה אישית כוללת משאבה, מלכודת בועה, תא זרימה, מד לחץ, שסתום לשליטה, ומאגר בינוני. בעת החלת לחץ הטיה בחדר התרבות, לאפשר זמן מנוחה של 1-2 מינימום¹¹.
6. להוסיף מדיום צמיחה לחדר התרבות ולהחיל 0.1 דיין/cm² זרימה הנגרמת הלחץ הטיה תחת אווירה מחולל לחות המכיל 5% CO₂¹⁰.
   הערה: הערך של מתח הטיה מושרה בזרימה מחושב על ידי הדמיית הפריסטלזיס של רקמת הוושט הנגזרת מהגוף האנושי ממחקרים קודמים¹⁰.
7. לקבוע את התגובות התאים על המשטחים הפנימיים של שכבות הפיגומים הכרישים בעלי שני השכבות מבלי לטפח ולאחר 5 ימים באמצעות ערכת שיטת הכדאיות החי/מת בהתאם להוראות היצרן. השיגו תמונות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בעזרת הכלי מחסנית Z.
8. ביום השלישי, שימו לב למבנה פני השטח של הפיגום הצינורי הנזרע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה (SEM).
   1. תקן את הפיגום שהיה מודל עם hMSC עם 2.5% גלוטארלדהיד ו OsO4 עבור 24 שעות ומייבשים עם אתנול.
   2. מעיל hMSCs קבוע עם פלטינה באמצעות coater אטר התאים בתנאים אטמוספרי ארגון ולהשיג תמונות SEM במתח מואץ של 25 kV.

3. הכנה כירורגית לניתוחי בעלי חיים

הערה: תרופות כירורגיות מוחלות לפני השתלת הגסטרו והוושט.

1. הגדר את כלי הניתוח סטרילי: להב האזמל, מפסק Weitlaner, microneedle, מלקחיים מיקרותפרים, מלקחיים מיקרורקמות, מיקרו מספריים, מחזיק המחט מאיו-Hegar, מספריים הפעלה, איריס מספריים, מלקחיים ההלבשה, מלקחיים רקמות, מלקחיים קיסם, מלקחיים איריס, 5 מ ל מזרק (21 גרם מחט), 10 מ"ל מזרק (22 גרם מחט), 9-0 תפר פוליאמיד, 4-0 polyglactin תפר.
2. לסמם את בעל החיים עם זריקה שרירית של tiletamine/זאזפם (50 mg/g מינון) ו 2% xylazine הידרוכלוריד (2 מ"ג/ק"ג מינון).
   הערה: למבוגרים ספראג-דאולי (SD) חולדות במשקל 398-420 g שימשו השתלת הוושט.
3. לפני המעבר אל העטוף כירורגי, לבדוק את המצב הרדמה המתאים של החיה על ידי צובט את הזנב עם מלקחיים.
4. מניחים את החיה בתנוחה פרקדן על העטוף הסטרילי ולהשתמש בקוצץ כדי להסיר את השיער מהצוואר (עבור השתלת הוושט) או בטן (עבור החלזונות). ואז לקרצף את האתר הכירורגי. עם בטאדין ו70% אתנול
5. לפני החיתוך, תת-עורי להזריק כאבים כגון בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג) עבור הקלה בכאב.

4. כירורגיה של חלזונות באמצעות T-tube בחולדות

הערה: בעלי החיים הניסיוניים בוצעו בכל החיות הנסיוניות כדי לאפשר הזנה זמנית של צינור מעקפים (n = 5).

1. יש חולדות מהר יום לפני הניתוח. . הכן ניתוח בסעיף 3
2. לחשוף את הבטן דרך חתך באמצע קו של העור ואת שרירי הבטן של החולדות מורדם.
3. צור מפתח 3 מ"מ בקיר הקיבה הקדמי עם להב אזמל.
4. הכנס את קצה T-tube הסיליקון לתוך האתר פגם כדי לתקן את זה לקיר הקיבה.
5. תפר כראוי כך T-tube אינו ניתוק מהקיר הקיבה.
6. הוצא את הקצה המרוחק של הצינור המושתל דרך המנהרה התת עורית אל גב הצוואר.
7. הכנס את כובע הפארין לקצה ה-T כדי למנוע מתכולת הקיבה לזרום אחורנית.
   הערה: השתמש ב-אנגיוקטטר כדי לחבר את הקצה של T-tube עם כובע הפארין.
8. תפר את כל השכבות של קיר הבטן והעור באמצעות 4-0 polyglactin תפרים.
9. לשמור את כל העכברושים הניסיוניים נפרדים בכלוב מטבולית לאחר השלמת החלזונות.

5. השתלת הוושט

הערה: השתלת הוושט של הפיגום בעל שתי שכבות מבוצעת כשבוע לאחר הגמעי (n = 5). לפני ההשתלה, חסן (צפיפות תא: 1 x 10⁶ תאים/mL בתוך מטריצה ממברנה מרתף) לתוך הקיר הפנימי של כל פיגום ו דגירה עבור 3 ימים במערכת ביוריאקטור שחקן. ההליך הכירורגי הוא כדלקמן.

1. הסר את שיער הצוואר של חיות המודל ולבצע כורכת רגיל של האתר כירורגי לניתוח אספטי.
   הערה: ליצור שטח גילוח גדול מומלץ לשמור על ניתוח מעקפים על החיה.
2. לאחר החתך החציוני הקדמי של הצוואר, הפרד את שרירי הרצועה וחשוף את מבנה הוושט.
3. במיומנות לנתח את העצב תועה מן הוושט לפני מחדש את הקטע, אחרת הנשימה של החיה הוא נפרץ.
4. תחת הגדלה, לבודד את הצד השמאלי של הוושט מקנה הנשימה ולהפריד בזהירות את החלק העליון של בלוטת התריס.
5. צור 5 מילימטר מלוא מלא פגם המכיל את כל השכבות של הוושט באמצעות מספריים כירורגי.
   הערה: לפני השתלת הוושט, חותכים את הפיגומים המוכנים בעזרת מספריים כירורגיים כדי להתאים לאורך אתר ההשתלה.
6. תחת מיקרוסקופ, לבצע השקה מיקרולשני הקצוות של פגם הוושט המרוחק באמצעות חוט תפר 9-0. מניחים את התפר הראשון בין השוליים inferoposterior הנכון של הוושט העליון השריד. המשך לעבור מימין לשמאל בין שארית הוושט העליון לבין הפיגום. Anastomose הפיגום באותו אופן כמו השוליים העליונים של הוושט התחתון.
   הערה: בצע השקה מיקרוכלי דם כפי שנעשה בניתוח קליני לצורך השתלת הוושט. לעבוד עם מיקרוסקופ עבור מדויק, האטומה לאחר הצורך של אתר השתל.
7. לאחר מכן, להניח את בלוטת התריס המקיף דש מעל האתר מושתלים כדי להבטיח תחזוקה יציבה של אספקת כלי דם לשתלים.
8. לאחר ההשתלה, תפר את השריר התת עורית ואת רקמת העור עם תפר 4-0.
9. לשמור את כל החולדות הנסיוניות באופן אינדיבידואלי בכלובים מטבוליים.

6. הליכים שלאחר הניתוח

הערה: הליכים שלאחר הניתוח מבוצעים לאחר השתלת הגסטרו והוושט.

1. לאחר סגירת פצע הבטן, לשים את החולדות לתוך כלובים מטבולית בודדים ולמקם את הכלובים על התקני התחממות אינפרא אדום כדי למנוע היפותרמיה.
2. עקוב אחר בעלי החיים עד שהם משיגים ושומרים על שכיבה משנית (כלומר, שוכב זקוף על החזה).
3. כדי למזער את הדלקת באתר כירורגי, ניהול gentamicin אנטיביוטי (20 מ"ג/ק"ג) מדי יום לחולדות.
4. התחל נוזל אוראלי האכלה ביום השלישי שלאחר העבודה עד נקודת הקצה של המחקר. לספק את נוסחת התזונה כולה (20.6 g/100 מ"ל [g%] פחמימות, 3.8 g% חלבון, 0.2 g% fat) דרך כובע הפארין 3x ליום מתחיל יום אחרי הניתוח.
5. בדוק את המראה של בעלי החיים ואת משקל הגוף מדי יום. בדוק כדי לנהל את ההתנהגות, כגון הפגיעה עצמית באתר או התנגדות לצריכת הצינורית, כמו גם סיבוכים כירורגיים שונים. כאשר משקל הגוף של מודלים חולדה פוחתת במהירות על ידי 20% או יותר, לבצע המתת חסד על ידי CO₂ שאיפת.

7. היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה

הערה: לניתוח היסטולוגית, כל רקמת הוושט של בעלי החיים המורדמים מופק באמצעות מספריים כירורגיים. המטאוקסילין והאאוזין והצביעת התלת-כרום של מאסנה בוצעו באמצעות טכניקות היסטולוגית סטנדרטיות. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על פי הפרוטוקול הבא.

1. תקן את הוושט כולו המכיל את האתרים המושתלים ב 4% פאראמפורמלדהיד. יצירת בלוק פרפין וחותכים 4 יקרומטר סעיפים עבים.
2. . ומייבשים אותם בסדרת אתנול הישאב את שקופיות הרקמה לתוך מאגר ציטראט וחום במשך 10 דקות במיקרוגל. מגניב את התאים עם PBS קר עבור 20 דקות. לטבול ב 3% חמצן מימן עבור 6 דקות, ולשטוף עם PBS עבור 10 דקות.
3. מודדת ב 3% בסרום שור (BSA) עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לחסום תגובות שאינן ספציפיות של מקטעי רקמות.
4. לשטוף את 3x עם PBS עבור 5 דקות. הדגירה עם נוגדנים העיקרי נגד Desmin (מדולל כדי 1:200), קרטין 13 (מדולל כדי 1:100), ו פון Willebrand פקטור (vWF; מדולל ל 1:100) לילה ב 4 ° c.
5. לשטוף את 3x עם PBS עבור 15 דקות. מודקרת עם הנוגדן המשני המתאים בריכוז של 1:500 עבור Desmin ו קרטין 13 בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף את השקופיות פעמיים עם PBS במשך 10 דקות.
   הערה: מקטעי רקמות עבור vWF היו מודבטים באמצעות ערכת peroxidase-מצוחזרת (ראה טבלת חומרים) ולאחר מכן דמיינו שימוש ב-3, 3 '-diaminobenzidine (טיפה).
6. הר באמצעות שמיכות זכוכית ו 4 ', 6-diamidino-2-פנייולדול (DAPI) המכיל הרכבה בינונית.

תוצאות

איור 1 מציג תרשים סכמטי של תהליך הייצור של הפיגום הצינורי הדו-PCL שני שכבות. הפתרון PU היה אלקטרוסובב מ 18 גרם מחט לעשות מבנה פנימי גלילי עם עובי של 200 μm. לאחר מכן, PCL מומס הודפס על הקיר החיצוני של nanofiber PU במרווחי זמן קבועים. ניתן לראות את המבנה הפנימי של הקירות הפ...

Discussion

לימודי בעלי חיים קיימים בושט מלאכותי עדיין מוגבלים במספר גורמים קריטיים. לפיגום הוושט המלאכותי האידיאלי צריך להיות ביולוגי ולהיות בעל סגולות פיזיות מצוינות. זה אמור להיות מסוגל לחדש את האפיתל רירית בתקופה הפוסט מוקדם כדי למנוע דליפה anastomotic. התחדשות של שכבות המעגל הפנימי העגול החיצוני שר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014