Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos

Resumo

A reconstrução do esôfago é um procedimento desafiador, e o desenvolvimento de um esôfago projetado por tecido que permite a regeneração da mucosa esofágica e muscular e que pode ser implantado à medida que um enxerto artificial é necessário. Aqui, apresentamos nosso protocolo para gerar um esôfago artificial, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreatores e várias técnicas cirúrgicas.

Resumo

O uso de materiais biocompatíveis para reconstrução circunferencial do esôfago é uma tarefa tecnicamente desafiadora em ratos e requer uma técnica ideal de implante com suporte nutricional. Recentemente, houve muitas tentativas de engenharia de tecidos esofágicos, mas a taxa de sucesso foi limitada devido à dificuldade na epitação precoce no ambiente especial da peristalse. Aqui, desenvolvemos um esôfago artificial que pode melhorar a regeneração da mucosa esofágica e camadas musculares através de um andaime tubular de duas camadas, um sistema de bioreator à base de células-tronco mesenquiérmicos e uma técnica de alimentação de bypass com modificação Gastrostomia. O andaime é feito de nanofibras de poliuretano (PU) em uma forma cilíndrica com um fio de policaprolactona impresso tridimensional (3D) enrolado ao redor da parede externa. Antes do transplante, as células-tronco mesenquimals derivadas pelo homem foram semeadas no lúmen do andaime, e o cultivo de bioreator foi realizado para melhorar a reatividade celular. Melhoramos a taxa de sobrevivência do enxerto aplicando anastomose cirúrgica e cobrindo a prótese implantada com um retalho da glândula tireoide, seguido de alimentação temporária de gastrostomia não oral. Esses enxertos foram capazes de recapitular os achados da epitelialização inicial e regeneração muscular em torno dos locais implantados, como demonstrado pela análise histológica. Além disso, foram observadas fibras de elastina aumentadas e neovascularização na periferia do enxerto. Portanto, este modelo apresenta uma potencial nova técnica para a reconstrução circunferencial do esôfago.

Introdução

O tratamento de distúrbios esofágicos, como malformações congênitas e carcinomas esofágicos, pode levar à perda estrutural do segmento do esôfago. Na maioria dos casos, enxertos de substituição autólogas, como conduítes gástricos ou interposições de cólon, foram realizados^1,2. No entanto, essas substituições de esôfago têm uma variedade de complicações cirúrgicas e riscos de reoperação³. Assim, o uso de andaimes de esôfago projetados por tecido imitando o esôfago nativo pode ser uma estratégia alternativa promissora para, em última análise, regenerar tecidos perdidos^4,5,6.

Embora um esôfago projetado por tecido potencialmente ofereça uma alternativa aos tratamentos atuais de defeitos esofágicos, existem barreiras significativas para sua aplicação in vivo. Vazamento anastomótico pós-operatório e necrose do andaime esôfago implantado inevitavelmente levam a uma infecção letal do espaço asséptico circundante, como o mediastinum⁷. Por isso, é extremamente importante prevenir a contaminação de alimentos ou saliva na ferida e na sonda nasogástrica. Gastrostomia ou nutrição intravenosa devem ser consideradas até que a cicatrização da ferida primária seja concluída. Até o momento, a engenharia de tecidos esofágicos tem sido realizada em grandes modelos animais porque animais de grande porte só podem ser alimentados por hiperalimentação intravenosa por 2-4 semanas após a implantação do andaime⁸. No entanto, tal modelo de alimentação não oral não foi estabelecido para a sobrevivência precoce após o transplante de esôfago em animais pequenos. Isso porque os animais eram extremamente ativos e incontroláveis, então eles não podiam manter o tubo de alimentação em seus estômagos por um longo período de tempo. Por essa razão, houve poucos casos de transplante esofágico bem sucedido em animais pequenos.

Em vista das circunstâncias da engenharia de tecidos esofágicos, projetamos um andaime tubular de duas camadas composto por nanofibras eletrospun (camada interna; Figura 1A) e um fio impresso em 3D (camada externa; Figura 1B) incluindo uma técnica modificada de gastrostomia. A nanofibra interna é feita de PU, um polímero não degradável, e previne o vazamento de alimentos e saliva. Os fios impressos 3D externos são feitos de policaprolactona biodegradável (PCL), que pode fornecer flexibilidade mecânica e se adaptar ao movimento peristaltico. Células-tronco mesenquimicas derivadas de adiposas humanas (hAD-MSCs) foram semeadas na camada interna do andaime para promover a reepitada. A estrutura da nanofibra pode facilitar a regeneração mucosa inicial, fornecendo um ambiente estrutural de matriz extracelular (ECM) para migração celular.

Também aumentamos a taxa de sobrevivência e a bioatividade das células inoculadas através do cultivo de bioreatores. O andaime implantado foi coberto com uma aba de glândula tireoide para permitir uma regeneração mais estável da mucosa esofágica e da camada muscular. Neste relatório, descrevemos protocolos para técnicas de engenharia de tecidos esofágicos, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreator à base de células-tronco mesenquimicas, uma técnica de alimentação de bypass com gastrostomia modificada e uma cirurgia modificada técnica de anastomose para reconstrução circunferencial do esôfago em um modelo de rato.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC nº 17-0164-S1A0) do Hospital Universitário Nacional de Seul.

1. Fabricação de andaimes

NOTA: Andaimes esôfagos de duas camadas são fabricados combinando eletrofiação e impressão 3D. A membrana interna do andaime tubular foi fabricada por poliuretano eletrofispinning (PU) com mandrels de aço inoxidável rotativos como os coletores⁹.

1. Para a preparação das nanofibras tubulares pu, prepare uma solução de 20% (w/v) do polímero PU mexendo em N,N-dimmemúrmaside (DMF) por 8 h a temperatura ambiente.
2. Coloque a solução PU na seringa com uma agulha metálica sem corte (22 G) e eletrospin em mandrels de aço inoxidável rotativos (diâmetro = 2 mm) a uma distância de 30 cm entre a ponta da agulha e o coletor rotativo.
   NOTA: A fonte de alimentação é definida para uma corrente direta de alta tensão de 15 kV potencial. A taxa de alimentação da solução é fixada em 0,5 mL/h usando uma bomba de seringa.
3. Faça uma camada tubular de nanofibra na superfície do mandrel girando a 3,14 m/s.
4. Seque a nanofibra PU em um forno a vácuo a 40 °C durante a noite para remover completamente o solvente residual.
   NOTA: A parede externa impressa em 3D do andaime esofágico é preparada usando um sistema rápido de prototipagem. O equipamento de impressão 3D consiste em um distribuidor, bico, controlador de compressão/calor, estágio de conversão de 3 eixos e sistema de software.
5. As pelotas PCL são dissolvidas a 100 °C em um cilindro de aquecimento e depois impressas na superfície das nanofibras em alta pressão (7 barras) o controle de um sistema de bioplotagem. O tamanho do bocal é de 300 μm e a distância de fio é de 700 μm.
6. Depois de remover o andaime de duas camadas da mandrel, esterilizar-se absorvendo 70% de etanol luz ultravioleta.
   NOTA: Características mais detalhadas do andaime foram relatadas em estudos anteriores¹⁰.

2. Sementes de células nos enxertos e cultivo de bioreatores

NOTA: Células-tronco mesenquinais derivadas de adiposas humanas (hMSCs) compradas de uma empresa foram usadas sem modificação.

1. Antes do transplante de células, esterilizar o andaime de esôfago impresso em 3D por 1h luz ultravioleta, mestou-o por 10 min com etanol e lave-o 3x com soro felino tampão de fosfato (PBS).
2. Cultura e ampliar os hMSCs em meio de crescimento (suplemento basal médio/crescimento). Andaimes tubulares de duas camadas foram transferidos para placas de cultura de tecido não aderente 24.
3. Para anexar as células à superfície interna do andaime, adicione delicadamente a suspensão do HMSC a uma densidade de 1 x 10⁶ células/mL na matriz de membrana do porão contendo o meio de crescimento.
4. Deposite uniformemente a suspensão da matriz da membrana do porão na superfície interna do andaime tubular de duas camadas.
5. Fixar firmemente o andaime tubular semeado do HMSC ao suporte acrílico na câmara de cultura do bioreator usando um sistema de bioreator de fluxo pulsátil.
   NOTA: O sistema de bioreator personalizado consiste em uma bomba, armadilha de bolhas, câmara de fluxo, medidor de pressão, válvula controlável e reservatório médio. Ao aplicar o estresse da cisalhamento na câmara de cultura, permita um tempo de descanso de 1-2 min¹¹.
6. Adicione o meio de crescimento à câmara de cultura e aplique 0,1 dyne/cm² estresse de cisalhamento induzido pelo fluxo uma atmosfera umificada contendo 5% de CO₂¹⁰.
   NOTA: O valor do estresse da cisalhamento induzido pelo fluxo foi calculado simulando a peristalse do tecido esôfago derivado do corpo humano a partir de estudos anteriores¹⁰.
7. Determine as respostas das células nas superfícies internas dos andaimes tubulares de duas camadas sem cultivo de bioreator após 5 dias usando um Kit de Ensaio de Viabilidade LIVE/MORTO de acordo com as instruções do fabricante. Obtenha imagens através de microscopia confocal usando a ferramenta Z-stack.
8. No terceiro dia, observe a morfologia superficial do andaime tubular semeado do HMSC através de um microscópio eletrônico de varredura (SEM).
   1. Fixar o andaime que foi incubado com hMSC com 2,5% glutaraldeído e OsO4 por 24h e desidratar com etanol.
   2. Cubra os hMSCs fixos com platina usando um coater de sputter condições atmosféricas argônios e obtenha imagens SEM a uma tensão acelerada de 25 kV.

3. Preparação cirúrgica para cirurgia animal

NOTA: Preparações cirúrgicas são aplicadas antes do transplante de gastrostomia e esôfago.

1. Configure os instrumentos cirúrgicos estéreis: lâmina bisturi, retrator Weitlaner, suporte de microagulhas, fórceps de microsutura, fórceps microtecidos, microtesouras, suporte de agulha Mayo-Hegar, tesoura de operação, tesoura de íris, fórceps de curativo, fórceps de tecido, fórceps de lasca, fórceps de íris, seringa de 5 mL (agulha 21 G), seringa de 10 mL (agulha 22 G), sutura de poliamida 9-0, sutura de poliglactina 4-0.
2. Anestesiar o animal com injeção intramuscular de tiletamina/zolazepam (dose de 50 mg/g) e 2% de cloridrato de xilazina (dose de 2 mg/kg).
   NOTA: Ratos Adultos Sprague-Dawley (SD) pesando 398-420 g foram usados para transplante de esôfago.
3. Antes de transferir para a cortina cirúrgica, verifique a condição anestéstica adequada do animal beliscando a cauda com os fórceps.
4. Coloque o animal em posição de supina na cortina estéril e use cortadores para remover o cabelo do pescoço (para transplante esofágico) ou abdômen (para gastrostomia). Em seguida, esfregue o local cirúrgico com betadina e 70% de etanol.
5. Antes da incisão, injete subcutâneamente um analgésico como buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) para alívio da dor.

4. Cirurgia de gastrostomia usando um tubo T em Ratos

NOTA: Uma gastrostomia modificada foi realizada em todos os animais experimentais para permitir a alimentação temporária do tubo não oral (n = 5).

1. Tenha ratos rápido um dia antes da cirurgia. Prepare a cirurgia como na seção 3.
2. Exponha o estômago através de uma incisão midline da pele e músculos abdominais dos ratos anestesiados.
3. Crie um orifício de 3 mm na parede gástrica anterior com uma lâmina bisturi.
4. Insira a ponta do tubo T de silicone no local do defeito para fixá-lo na parede do estômago.
5. Sutura corretamente para que o tubo T não se desconecte da parede gástrica.
6. Tire a extremidade distal do tubo T implantado através do túnel subcutâneo na parte de trás do pescoço.
7. Insira a tampa de heparina até a extremidade do tubo T para evitar que o conteúdo estomacal flua para trás.
   NOTA: Use um angiocateter para conectar a extremidade do tubo T com a tampa de heparina.
8. Sutura todas as camadas da parede abdominal e da pele usando suturas de poliglactina 4-0.
9. Mantenha todos os ratos experimentais separados em uma gaiola metabólica depois que a gastrostomia foi concluída.

5. Transplante esôfago

NOTA: O transplante esofágico do andaime tubular de duas camadas é realizado 1 semana após a gastrostomia (n = 5). Antes do transplante, os hMSCs inoculados (densidade celular: 1 x 10⁶ células/mL na matriz de membrana do porão) na parede interna de cada andaime e incubam por 3 dias no sistema de bioreator. O procedimento cirúrgico é o seguinte.

1. Remova o cabelo do pescoço dos animais modelo e realize o draping padrão do local cirúrgico para cirurgia asséptica.
   NOTA: Criar uma grande área de barbear é recomendado para manter uma cirurgia acética no animal.
2. Após incisão mediana anterior do pescoço, separe os músculos da correia e exponha a estrutura traqueoesophageal.
3. Dissecem sem rodeios o nervo vago do esôfago antes de resseccionar o segmento, caso contrário, a respiração do animal está comprometida.
4. ampliação, isole o lado esquerdo do esôfago da traqueia e separe cuidadosamente a parte superior da glândula tireoide.
5. Crie um defeito circunferencial completo de 5 mm de comprimento contendo todas as camadas do esôfago usando tesouras cirúrgicas.
   NOTA: Antes do transplante de esôfago, corte os andaimes preparados usando tesouras cirúrgicas para combinar com o comprimento do local do transplante.
6. um microscópio, realize a microanastomose em ambas as extremidades do defeito esofágico distal usando um fio de sutura 9-0. Coloque a primeira sutura entre a margem inferoposterior direita do remanescente superior do esôfago e do andaime. Continue suturing da direita para a esquerda entre o remanescente superior do esôfago e o andaime. Anastomose o andaime da mesma forma que a margem superior do remanescente esôfago inferior.
   NOTA: Realizar anastomose microvascular como utilizado em cirurgia clínica para transplante de esôfago. Trabalhe com um microscópio para sutura precisa e impermeável do local do implante.
7. Depois, coloque a glândula tireoide circundante sobre o local transplantado para garantir a manutenção estável e o fornecimento vascular aos enxertos.
8. Após o transplante, costure o músculo subcutâneo e o tecido da pele com uma sutura de 4-0 vicrilos.
9. Mantenha todos os ratos experimentais individualmente em gaiolas metabólicas.

6. Procedimentos pós-operatórios

NOTA: Os procedimentos pós-operatórios são realizados após transplante de gastrostomia e esôfago.

1. Após o fechamento da ferida abdominal, coloque os ratos em gaiolas metabólicas individuais e coloque as gaiolas em dispositivos de aquecimento infravermelho para evitar hipotermia.
2. Monitore os animais até que eles alcancem e mantenham a recumbência esnal (ou seja, deitados ereto no peito).
3. Para minimizar a inflamação no local cirúrgico, aplique o antibiótico gentamicina (20 mg/kg) diariamente aos ratos.
4. Comece a alimentação líquida oral no terceiro dia pós-operatório até o ponto final do estudo. Forneça toda a fórmula nutricional (20,6 g/100 ml [g%] carboidrato, 3,8 g% de proteína, 0,2 g% de gordura) através da tampa heparina 3x por dia a partir do dia seguinte à cirurgia.
5. Verifique a aparência dos animais e o peso corporal diariamente. Verifique para gerenciar comportamentos, como o local de incisão auto-prejudicial ou a resistência à ingestão do tubo, bem como várias complicações cirúrgicas. Quando o peso corporal dos modelos de ratos diminui rapidamente em 20% ou mais, realize a eutanásia por inalação de CO_2.

7. Histologia e imunohistoquímica

NOTA: Para análise histológica, todo o tecido esofágico dos animais eutanizados é extraído utilizando tesoura cirúrgica. A coloração hematoxilina e eosina e a coloração tricromática de Masson foram realizadas usando técnicas histológicas padrão. A imunohistoquímica foi realizada de acordo com o seguinte protocolo.

1. Conserte todo o esôfago contendo os locais transplantados em paraformaldeído de 4%. Crie um bloco de parafina e corte seções de 4 μm de espessura.
2. Deparafina as seções de tecido e as desidrata em uma série de etanol. Mergulhe os slides de tecido em tampão de ceítra e aqueça por 10 min no micro-ondas. Esfrie as células com PBS frio por 20 min. Mergulhe em 3% de peróxido de hidrogênio por 6 min, e lave com PBS por 10 min.
3. Incubar em 3% de albumina de soro bovino (BSA) por 1h de temperatura ambiente para bloquear reações inespecíficas de seções teciduais.
4. Lave 3x com PBS por 5 min. Incubar com anticorpos primários contra Desmin (diluído a 1:200), queratina 13 (diluída para 1:100) e von Willebrand Factor (vWF; diluído para 1:100) durante a noite a 4 °C.
5. Lave 3x com PBS por 15 min. Incubar com o anticorpo secundário apropriado em uma concentração de 1:500 para Desmin e Keratin 13 em temperatura ambiente. Em seguida, lave os slides duas vezes com PBS por 10 min.
   NOTA: As seções de tecido para vWF foram incubadas usando um kit conjugado com rabanete (ver Tabela de Materiais)e, em seguida, visualizadas usando 3,3'-diaminobenzidina (DAB).
6. Montar usando um deslizamento de cobertura de vidro e 4',6-diamidino-2-fenolindole (DAPI) contendo meio de montagem.

Resultados

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático do processo de fabricação do andaime tubular pu-PCL de duas camadas. A solução PU foi eletrosada a partir de uma agulha de 18 G para fazer uma estrutura interna cilíndrica com uma espessura de 200 μm. Em seguida, o PCL derretido foi impresso na parede externa da nanofibra PU em intervalos regulares. A morfologia superficial das paredes internas e externas do andaime tubular completo pode ser vista nas imagens d...

Discussão

Os estudos em animais existentes sobre esôfagos artificiais ainda são limitados por vários fatores críticos. O andaime artificial ideal deve ser biocompatível e ter excelentes propriedades físicas. Ele deve ser capaz de regenerar o epitélio mucosa no início do pós-operatório para evitar vazamento saofótico. A regeneração das camadas musculares circulares internas e longitudinal externas também é importante para a peristalse funcional^12,13.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014