Ткань-инженерный трансплантат для обрезанной реконструкции пищевода у крыс

Резюме

Реконструкция пищевода является сложной процедурой, и развитие тканевого пищевода, который позволяет регенерации слизистой оболочки пищевода и мышц, и которые могут быть имплантированы в качестве искусственного трансплантата необходимо. Здесь мы представляем наш протокол для создания искусственного пищевода, в ключая производство эшафота, выращивание биореакторов и различные хирургические методы.

Аннотация

Использование биосовместимых материалов для окружной реконструкции пищевода является технически сложной задачей у крыс и требует оптимальной техники имплантата с питательной поддержкой. В последнее время было много попыток в пищеводной ткани инженерии, но успех был ограничен из-за трудностей в ранней эпителизации в специальной среде перистальты. Здесь мы разработали искусственный пищевод, который может улучшить регенерацию слизистой оболочки пищевода и мышечных слоев через двухслойную трубчатую эшафот, мезенхимальную систему биореактора на основе стволовых клеток и метод шунтирования с модифицированным гастростомия. Эшафот изготовлен из нановолокна полиуретана (ПУ) в цилиндрической форме с трехмерной (3D) печатной нитью поликапролактона, обернутой вокруг внешней стены. До трансплантации, человеческие стволовые клетки мезенхимальных были посеяны в просвет эшафот, и биореактор выращивания было выполнено для повышения клеточной реактивности. Мы улучшили выживаемость трансплантата, применив хирургический анастомоз и покрыв имплантированный протез лоскутом щитовидной железы, за которым последовало временное кормление от неоррорной гастростомии. Эти трансплантаты смогли резюмировать результаты первоначальной эпителиализации и регенерации мышц вокруг имплантированных участков, о чем свидетельствует гистологический анализ. Кроме того, на периферии трансплантата наблюдались повышенные эластинные волокна и неоваскуляризация. Таким образом, эта модель представляет собой потенциальную новую технику для окружной реконструкции пищевода.

Введение

Лечение заболеваний пищевода, таких как врожденные пороки развития и карциномы пищевода, может привести к потере структурного сегмента пищевода. В большинстве случаев, аутологичные замены трансплантатов, таких как желудочного подтягивания каналов или толстой кишки межпозиций, были выполнены^1,2. Тем не менее, эти эндофагеальные замены имеют различные хирургические осложнения и риски повторной операции^3. Таким образом, использование тканевых эшафот пищевода имитируя родной пищевод может быть перспективной альтернативной стратегией для в конечном итоге регенерации потерянных тканей^4,5,6.

Хотя ткань-инженерный пищевод потенциально предлагает алтернативу к в настоящее время обработка дефектов пищевода, будут значительно барьеры для своего применения in vivo. Послеоперационная анастомотическая утечка и некроз имплантированных эшафот пищевода неизбежно приводят к смертельной инфекции окружающего асептического пространства, такого как средостений⁷. Поэтому крайне важно предотвратить пищевые или слюнные загрязнения раны и назогастральной трубки. Гастрономия или внутривенное питание следует рассматривать до тех пор, пока первичное заживление раны не будет завершено. На сегодняшний день, пищеводных тканей инженерии была выполнена в крупных животных моделей, потому что крупные животные могут питаться только путем внутривенной гипералименции в течение 2-4 недель после имплантации эшафота⁸. Однако такая модель неорального кормления не была создана для раннего выживания после пересадки пищевода у мелких животных. Это потому, что животные были чрезвычайно активны и неконтролируемы, поэтому они не могли держать кормления трубки в желудке в течение длительного периода времени. По этой причине было несколько случаев успешной трансплантации пищевода у мелких животных.

С учетом обстоятельств инженерии тканей пищевода мы спроектировали двухслойную трубчатую эшафот, состоящую из электрострунна нановолокна (внутренний слой; Рисунок 1А) и прядь 3D-печати (внешний слой; Рисунок 1B) включая модифицированную методику гастростомии. Внутреннее нановолокно изготовлено из ПУ, неразлагаемого полимера, и предотвращает утечку пищи и слюны. Внешние 3D печатные нити изготовлены из биоразлагаемого поликапролактона (PCL), который может обеспечить механическую гибкость и адаптироваться к перистальтическим движениям. Человеческие жировые стволовые клетки (hAD-MSCs) были посеяны на внутреннем слое эшафота для содействия реэпителизации. Структура нановолокна может облегчить начальную регенерацию слизистой оболочки, обеспечивая структурную внеклеточную матрицу (ECM) среду для миграции клеток.

Мы также увеличили выживаемость и биоактивность привитых клеток за счет выращивания биореакторов. Имплантированная эшафот была покрыта щитовидной железой лоскут для обеспечения более стабильной регенерации слизистой оболочки пищевода и мышечного слоя. В этом отчете мы описываем протоколы для методов инженерии тканей пищевода, включая изготовление эшафотов, мезенхимальные стволовые клетки на основе биореактора, метод питания шунтирования с модифицированной гастростомией, и модифицированный хирургический анастомоз техники для окружной реконструкции пищевода в крысиной модели.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC No 17-0164-S1A0) Сеульской национальной университетской больницы.

1. Производство леса

ПРИМЕЧАНИЕ: Двухслойные эшафот пищевода производятся путем объединения электроспиннинга и 3D-печати. Внутренняя мембрана трубчатых эшафот был изготовлен электроспиннинг полиуретана (ПУ) с вращающимися мандрами из нержавеющей стали, как коллекционеры⁹.

1. Для приготовления трубчатых нановолокон PU приготовьте 20% (w/v) раствор из полимера ПУ, помешивая в N,N-диметилформамид (DMF) для 8 ч при комнатной температуре.
2. Поместите раствор PU на шприц с тупой металлической иглой (22 G) и электроспин на вращающихся мандристах из нержавеющей стали (диаметр 2 мм) на расстоянии 30 см между кончиком иглы и вращающимся коллектором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блок питания настроен на высоковольтный прямой ток мощностью 15 кВ. Скорость кормления раствора фиксируется на уровне 0,5 мл/ч с помощью шприского насоса.
3. Сделайте трубчатый слой нановолокна на поверхности мандрии, вращающийся со счетом 3,14 м/с.
4. Сухие PU нановолокна в вакуумной печи при температуре 40 градусов по Цельсию на ночь, чтобы полностью удалить остаточный растворитель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печать внешней стены эшафот пищевода готовится с помощью системы быстрого прототипирования. Оборудование для 3D-печати состоит из диспенсера, сопла, контроллера сжатия/тепла, этапа преобразования 3 оси и программной системы.
5. Гранулы PCL растворяются при 100 градусах Цельсия в нагревательном цилиндре, а затем печатаются на поверхности нановолокон при высоком давлении (7 бар) под контролем системы биоплотничества. Размер сопла составляет 300 мкм, а расстояние пряди - 700 мкм.
6. После удаления двухслойной эшафот из мандри, стерилизовать путем замачивания в 70% этанола под ультрафиолетовым светом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробные характеристики эшафот были зарегистрированы в предыдущих исследованиях¹⁰.

2. Посев клеток на прививках и выращивании биореакторов

ПРИМЕЧАНИЕ: Человек adipose полученных мезенхимальных стволовых клеток (HMSCs), приобретенных у компании были использованы без изменений.

1. До пересадки клеток, стерилизовать 3D печатных эшафот пищевода в течение 1 ч под ультрафиолетовым светом, мокрый его в течение 10 минут с этанолом, и мыть его 3x с фосфат-буфером солив (PBS).
2. Культура и расширить ГМСК в среде роста (базальная средняя/ добавка роста). Двухслойные трубчатые леса были перенесены в непридерживаемые 24 хорошо ткани культуры пластин.
3. Чтобы прикрепить клетки к внутренней поверхности эшафота, аккуратно добавьте hMSC подвески при плотности 1 х 10⁶ клеток / мл в подвале мембраны матрицы, содержащей среды роста.
4. Равномерно откладывать подвальную мембранную матримную подвеску на внутреннюю поверхность двухслойной трубчатой эшафота.
5. Твердо исправить hMSC-посеянных трубчатых эшафот акрилового держателя в камере культуры биореактора с помощью пульсатилного потока биореакторной системы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанная биореакторная система состоит из насоса, пузырьковой ловушки, камеры потока, датчика давления, управляемого клапана и среднего резервуара. При применении сдвига стресс в камере культуры, позволяют время отдыха 1-2 мин¹¹.
6. Добавить рост среды в культурную камеру и применять 0,1 dyne/cm² потока индуцированной сдвига стресс под увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значение потока индуцированной сдвига стресс был рассчитан путем имитации перистальты ткани пищевода, полученных из человеческого тела из предыдущих исследований¹⁰.
7. Определите реакции клеток на внутренних поверхностях двухслойных трубчатых эшафотбезов без выращивания биореактора после 5 дней с помощью набора LIVE/DEAD Viability Assay Kit в соответствии с инструкциями производителя. Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии с помощью инструмента стек.
8. На третий день, наблюдать поверхностную морфологию hMSC-посеянной трубчатой эшафот через сканирующий электронный микроскоп (SEM).
   1. Исправить эшафот, который был инкубирован с hMSC с 2,5% глютаральдегида и OsO4 для 24 ч и обезвоживание с этанолом.
   2. Пальто фиксированных hMSCs с платиной с помощью распылителя пальто в атмосферных условиях аргона и получить SEM изображения на ускорение напряжения 25 кВ.

3. Хирургическая подготовка для хирургии животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические препараты применяются как перед гастростомией и пересадки пищевода.

1. Настройка стерильных хирургических инструментов: Scalpel лезвие, Weitlaner втягиватель, микроиглы держатель, микросумп щипцы, микроткань щипцы, микросцы, Майо-Хегар держатель иглы, операционные ножницы, ножницы радужной оболочки, повязка щипцы, ткани щипцы, осколок щипцы, щипцы радужной оболочки, 5 мл шприца (21 G иглы), 10 мл шприца (22 G иглы), 9-0 полиамидшовый шов, 4-0 полигактина шов.
2. Анестезия животного с внутримышечной инъекции плитки / золазепама (50 мг/г дозы) и 2% гидрохлорид ксилазина (2 мг/кг дозы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые крысы Спраг-Доули (SD) весом 398-420 г использовались для трансплантации пищевода.
3. Перед переходом на хирургическую драпировку проверьте соответствующее обезопадевое состояние животного, защищая хвост щипками.
4. Поместите животное в положение на спине на стерильной драпировке и использовать клиперы для удаления волос с шеи (для пересадки пищевода) или живота (для гастростомии). Затем скраб хирургического сайта с бетадином и 70% этанола.
5. До разреза, подкожно вводят анальгетик, такие как бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) для облегчения боли.

4. Хирургия гастростомии С помощью Т-трубки у крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированная гастростомия была выполнена у всех экспериментальных животных, чтобы позволить временное шунтирование неорального кормления трубки (n No 5).

1. У крыс быстро за день до операции. Подготовка хирургии, как в разделе 3.
2. Разоблачить желудок через разрез средней линии кожи и мышц живота анестезируют крыс.
3. Создайте 3 мм в передней стенке желудка с ампелонным лезвием.
4. Вставьте кончик силиконовой T-трубки в дефект сайта, чтобы исправить его к стенке желудка.
5. Шов правильно, чтобы Т-трубка не отсоединила от стенки желудка.
6. Выньте дистальный конец имплантированной Т-трубки через подкожный туннель в задней части шеи.
7. Вставьте крышку гепарина в конец Т-трубки, чтобы содержимое желудка не текла назад.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ангиокатетер, чтобы соединить конец Т-трубки с крышкой гепарина.
8. Шов все слои брюшной стенки и кожи с помощью 4-0 полиплактиновых швов.
9. Держите всех экспериментальных крыс отдельно в метаболической клетке после гастростомии была завершена.

5. Трансплантация пищевода

ПРИМЕЧАНИЕ: Пересадка пищевода двухслойной трубчатой эшафотпроводит проводится через неделю после гастростомии (n No 5). Перед трансплантацией, прививать HMSC (плотность клеток: 1 х 10⁶ клеток / мл в подвале мембранной матрицы) во внутреннюю стену каждого эшафота и инкубировать в течение 3 дней в биореакторной системе. Хирургическая процедура заключается в следующем.

1. Удалить волосы на шее модели животных и выполнять стандартные драпировки хирургического сайта для асептической хирургии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Создать большую область бритья рекомендуется для поддержания аскетической хирургии на животном.
2. После переднего медианного разреза шеи отделите мышцы ремешка и разоблачите трахеоэзофагеальную структуру.
3. Грубо вскрыть блуждающий нерв из пищевода, прежде чем резекции сегмента, в противном случае дыхание животного скомпрометирована.
4. Под увеличением изолируйте левую сторону пищевода от трахеи и тщательно отделите верхнюю часть от щитовидной железы.
5. Создайте 5 мм длинный полный окружной дефект, содержащий все слои пищевода с помощью хирургических ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: До пересадки пищевода, сократить подготовленные леса с помощью хирургических ножниц, чтобы соответствовать длине места трансплантации.
6. Под микроскопом, выполнять микроанастомоз на обоих концах дистального дефекта пищевода с помощью 9-0 шов нить. Поместите первый шов между правой inferoposterior края остатков пищевода и эшафот. Продолжайте зашивать справа налево между верхним остатком пищевода и эшафотом. Анастомоз эшафот так же, как верхний край нижней части остатка пищевода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните микрососудистый анастомоз, используемый в клинической хирургии для трансплантации пищевода. Работайте с микроскопом для точного, водонепроницаемого зашвивания места имплантации.
7. После этого, положите окружающий щитовидной железы лоскут над пересаженный сайт для обеспечения стабильного поддержания и сосудистой поставки трансплантатов.
8. После трансплантации сшивать подкожную мышцу и ткани кожи с 4-0 vicryl шов.
9. Держите всех экспериментальных крыс индивидуально в метаболических клетках.

6. Послеоперационные процедуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационные процедуры выполняются после гастростомии и пересадки пищевода.

1. После закрытия брюшной раны, положить крыс в отдельные метаболические клетки и поместить клетки на инфракрасное потепление устройств для предотвращения переохлаждения.
2. Мониторинг животных до тех пор, пока они не достигнут и поддерживать суровый recumbency (т.е., лежа в вертикальном положении на груди).
3. Чтобы свести к минимуму воспаление в хирургическом месте, вводят антибиотик гентамицин (20 мг/кг) ежедневно крыс.
4. Начните перорное жидкое кормление на третий послеоперационный день до конечной точки исследования. Поставка всей формулы питания (20,6 г/100 мл углеводов, 3,8 г белка, 0,2 г% жира) через гепарин крышка 3x в день, начиная день после операции.
5. Ежедневно проверяйте внешний вид животных и массу тела. Проверьте, чтобы управлять поведением, таким как самоповреждение места разреза или сопротивление потребление межени трубки, а также различные хирургические осложнения. Когда масса тела крыс модели быстро уменьшается на 20% или более, выполнять эвтаназии co₂ ингаляции.

7. Гистология и иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для гистологического анализа, все пищевеливая ткань эвтаназии животных извлекается с помощью хирургических ножниц. Гематоксилин и эозиновые окрашивания и трихромное окрашивание Массона были выполнены с использованием стандартных гистологических методов. Иммуногистохимия проводилась по следующему протоколу.

1. Исправить весь пищевод, содержащий пересаженные участки в 4% параформальдегида. Создайте парафин блок и вырезать 4 мкм толщиной разделов.
2. Депараффинизуите участки тканей и обезвожжают их в серии этанола. Погрузите ткань слайды в цитрат буфера и тепла в течение 10 минут в микроволновой печи. Охладите клетки холодными PBS в течение 20 мин. Погрузите в перекись водорода 3% в течение 6 мин, и промойте PBS в течение 10 мин.
3. Инкубировать в 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч при комнатной температуре, чтобы блокировать неспецифические реакции тканевых секций.
4. Вымойте 3x с PBS в течение 5 мин. Инкубировать с первичными антителами против Desmin (разбавленный до 1:200), кератин 13 (разбавленный до 1:100), и фон Willebrand фактор (vWF; разбавленный до 1:100) ночь при 4 градусах по Цельсию.
5. Вымойте 3x с PBS в течение 15 мин. Инкубировать с соответствующимвторичным антителом в концентрации 1:500 для Desmin и Кератин 13 при комнатной температуре. Затем дважды промойте горки PBS в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань разделы для vWF были инкубированы с использованием хрена peroxidase-конъюгированный комплект (см. Таблица материалов), а затем визуализированы с помощью 3,3'-диаминобензидин (DAB).
6. Гора с использованием стеклянного покрывала и 4',6-диамидино-2-фенолиндоль (DAPI), содержащий монтаж среды.

Результаты

На рисунке 1 показана схематическая схема производственного процесса двухслойной трубчатой эшафота ПУ-ПКЛ. Раствор PU был электроспуном из 18 G иглы, чтобы сделать цилиндрическую внутреннюю структуру толщиной 200 мкм. Затем расплавленный PCL регулярно печ?...

Обсуждение

Существующие исследования на животных искусственных эзофаги по-прежнему ограничены несколькими критическими факторами. Идеальная искусственная эшафот пищевода должна быть биосовместимой и иметь отличные физические свойства. Он должен быть в состоянии регенерировать слизистой эпи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014