쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편

요약

식도 재건은 도전적인 절차이며, 식도 점막과 근육의 재생을 가능하게하고 인공 이식으로 이식 할 수있는 조직 공학 식도의 개발이 필요합니다. 여기에서는 스캐폴드 제조, 생물 반응기 재배 및 다양한 수술 기법을 포함한 인공 식도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

원주 식도 재건을 위한 생체 적합성 물질의 사용은 쥐에서 기술적으로 도전적인 작업이며 영양 지원을 지원하는 최적의 임플란트 기술이 필요합니다. 최근에는 식도 조직 공학에 많은 시도가 있었지만 연석의 특별한 환경에서 초기 상피화의 어려움으로 인해 성공률이 제한되었습니다. 여기서, 우리는 2층 관 성 비계, 중간 엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 시스템 및 변형된 바이패스 공급 기술을 통해 식도 점막과 근육 층의 재생을 향상시킬 수 있는 인공 식도를 개발했습니다. 위장관 절제술. 스캐폴드는 외벽을 감싸는 3차원(3D) 인쇄 폴리카프롤락톤 가닥을 가진 원통형 형태의 폴리우레탄(PU) 나노섬유로 이루어진다. 이식에 앞서, 인간 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드의 내루에 파종하고, 세포 반응성을 향상시키기 위해 생물반응기 재배를 수행하였다. 우리는 외과 적 해부학을 적용하고 갑상선 플랩으로 이식 된 보철을 덮고 일시적인 비내구 위절제술 을 통해 이식 생존율을 향상시켰습니다. 이 접목은 조직학 분석에 의해 입증된 바와 같이 이식된 부위 의 주위에 초기 상피화 그리고 근육 재생의 사실 인정을 되풀이할 수 있었습니다. 또한, 엘라스틴 섬유 증가 및 혈관 신생은 이식편 주변에서 관찰되었다. 따라서,이 모델은 원주 식도 재건을위한 잠재적 인 새로운 기술을 제시한다.

서문

선천성 기형 및 식도 암과 같은 식도 장애의 치료는 식도의 구조적 세그먼트 손실로 이어질 수 있습니다. 대부분의 경우, 위 풀업 도관 또는 결장 간과 같은 자가 대체 이식편이^1,2로수행되었습니다. 그러나, 이러한 식도 교체는 다양한 외과적 합병증 및 재수술 위험이^3. 따라서, 네이티브 식도를 모방한 조직 공학식도 비계의 사용은 궁극적으로 손실된 조직을 재생하기 위한 유망한 대안 전략이 될 수 있다^4,5,6.

조직 공학식도 잠재적으로 식도 결함의 현재 치료에 대 한 대안을 제공 하지만, 그것의 생체 내 응용 프로그램에 대 한 중요 한 장벽이 있다. 이식된 식도 비계의 수술 후 해부학 적 누설 및 괴사는 필연적으로 매질^7과같은 주변 무균 공간의 치명적인 감염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 상처 및 비위 관의 음식이나 타액 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 위장관 절제술 또는 정맥 영양은 1 차적인 상처 치유가 완료될 때까지 고려되어야 합니다. 현재까지, 식도 조직 공학은 큰 동물이 스캐폴드^8의이식 후 2-4 주 동안 정맥 과충에 의해서만 공급될 수 있기 때문에 큰 동물 모델에서 수행되었다. 그러나, 이러한 비oral 공급 모델은 작은 동물에서 식도 이식 후 조기 생존을 위해 확립되지 않았다. 이것은 동물이 매우 활동적이고 통제 할 수 없었기 때문에 장기간 동안 수유 튜브를 위장에 보관 할 수 없었기 때문입니다. 이러한 이유로, 작은 동물에 성공적인 식도 이식의 몇 가지 경우가 되었습니다.

식도 조직 공학의 상황을 고려하여, 우리는 전기 스펀 나노 섬유 (내부 층)로 구성된 2 층 관 형 스캐폴드를 설계했습니다. 도 1A)및 3D 프린팅 가닥(외부 층; 도 1B)변형된 위절제술 기법을 포함한다. 내부 나노 섬유는 분해되지 않는 폴리머 인 PU로 만들어졌으며 음식과 타액의 누출을 방지합니다. 외부 3D 프린팅 가닥은 기계적 유연성을 제공하고 연동 운동에 적응할 수 있는 생분해성 폴리카프로롤락톤(PCL)으로 만들어집니다. 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(hAD-MSCs)는 스캐폴드의 내부 층에 씨를 뿌리고 상피화를 촉진하였다. 나노섬유 구조는 세포 이동을 위한 구조적 세포외 매트릭스(ECM) 환경을 제공함으로써 초기 점막 재생을 용이하게 할 수 있다.

우리는 또한 생물 반응기 재배를 통해 접종 된 세포의 생존율과 생체 활성을 증가시켰습니다. 이식된 스캐폴드는 식도 점막과 근육 층의 보다 안정적인 재생을 가능하게 하기 위해 갑상선 플랩으로 덮여 있었다. 이 보고서에서는 스캐폴드 제조, 중간엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 재배, 변형 된 위절제술을 사용한 우회 공급 기술 및 수정 된 수술을 포함한 식도 조직 공학 기술에 대한 프로토콜을 설명합니다. 쥐 모형에 있는 원주 식도 재건을 위한 해부학 기술.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 서울대학교병원의 기관동물관리및사용위원회(IACUC No. 17-0164-S1A0)의 승인을 받았습니다.

1. 비계 제조

참고 : 2 층 식도 스캐폴드는 전기 방사 및 3D 프린팅을 결합하여 제조됩니다. 관형 스캐폴드의 내부 멤브레인은 컬렉터로서 회전하는 스테인리스 스틸 만드렐로전기방사 폴리우레탄(PU)에 의해 제조되었다.

1. 관형 PU 나노 섬유의 제조를 위해, 실온에서 8 시간 동안 N,N-디메틸 포름 아미드 (DMF)에서 교반하여 PU 폴리머의 20 % (w / v) 용액을 준비하십시오.
2. PU 용액을 무딘 금속 바늘(22G)으로 주사기 에 놓고, 바늘 끝과 회전 수집기 사이의 30cm 거리에서 회전스테인리스 맨드릴(직경 = 2 mm)에 전기 스핀을 놓습니다.
   참고: 전원 공급 장치는 15kV 전위가 되는 고전압 직전류로 설정됩니다. 용액의 공급 속도는 주사기 펌프를 사용하여 0.5 mL/h로 고정됩니다.
3. 3.14 m/s에서 회전 하는 맨드렐의 표면에 관 형 나노 섬유 층을 확인 합니다.
4. PU 나노섬유를 진공 오븐에서 40°C에서 하룻밤 동안 건조하여 잔류 용매를 완전히 제거합니다.
   참고: 식도 스캐폴드의 3D 프린팅 외벽은 신속한 프로토타이핑 시스템을 사용하여 제조됩니다. 3D 프린팅 장비는 디스펜서, 노즐, 압축/열 컨트롤러, 3축 변환 단계 및 소프트웨어 시스템으로 구성됩니다.
5. PCL 펠릿은 가열 실린더에서 100°C에서 용해된 다음 바이오플로팅 시스템의 제어 하에 고압(7 bar)에서 나노섬유의 표면에 인쇄됩니다. 노즐 크기는 300 μm이고 가닥 거리는 700 μm입니다.
6. 맨드렐에서 2층 스캐폴드를 제거한 후, 자외선 하에서 70% 에탄올을 담가 살균하였다.
   참고 : 스캐폴드의 더 자세한 특성은 이전 연구에서 보고되었습니다^10.

2. 이식편 및 생물반응기 재배에 대한 세포 파종

참고: 회사에서 구입한 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(hMSCs)를 수정 없이 사용하였다.

1. 세포 이식에 앞서 자외선 아래에서 1 시간 동안 3D 인쇄 식도 스캐폴드를 살균하고 에탄올로 10 분 동안 적시고 인산완충 식염수 (PBS)로 3 x 씻어 내다.
2. 배양 및 성장 매체에서 hMSC를 확장 (기초 매체/성장 보충). 2층 관형 스캐폴드는 비부착24웰 조직 배양판으로 옮겼다.
3. 스캐폴드의 내부 표면에 세포를 부착하려면 성장 배지를 포함하는 지하 막 매트릭스에서 1 x 10⁶ 셀/mL의 밀도로 hMSC 현탁액을 부드럽게 추가합니다.
4. 2층 관형 스캐폴드의 내부 표면에 지하 멤브레인 매트릭스 현탁액을 균일하게 증착한다.
5. hMSC-시드 관형 스캐폴드를 맥동유동 생물반응기 시스템을 이용하여 생물반응기의 배양챔버 내아크릴 홀더에 단단히 고정한다.
   참고: 맞춤형 바이오리액터 시스템은 펌프, 버블 트랩, 유량 챔버, 압력 게이지, 제어 밸브 및 중간 저수지로 구성됩니다. 배양실에서 전단 응력 적용시, 1-2분^11의휴식 시간을 허용한다.
6. 배양 챔버에 성장 배지를 추가하고 5%_CO2^10을포함하는 가습 된 분위기 하에서 0.1 dyne /^cm2 유동 유도 전단 응력적용.
   참고: 유동 유도 전단 응력의 값은 이전 연구^{10으로부터}인체로부터 유래된 식도 조직의 연동동을 시뮬레이션하여 계산되었다.
7. 제조업체의 지침에 따라 LIVE/DEAD 생존 율 분석 키트를 사용하여 5일 후에 생물 반응기 재배없이 2층 관 형 스캐폴드의 내부 표면에 세포 반응을 결정합니다. Z 스택 도구를 사용하여 공초점 현미경을 통해 이미지를 가져옵니다.
8. 셋째 날에는 주사 전자 현미경 (SEM)을 통해 hMSC 시드 관 비계의 표면 형태를 관찰하십시오.
   1. hMSC로 배양된 스캐폴드를 2.5% 글루타랄데히드 및 OsO4로 24시간 동안 고정하고 에탄올로 탈수합니다.
   2. 아르곤 대기 조건에서 스퍼터 코터를 사용하여 고정 된 hMSC를 백금으로 코팅하고 25 kV의 가속 전압에서 SEM 이미지를 얻습니다.

3. 동물 수술을위한 외과 준비

참고 : 외과 준비는 위절제술과 식도 이식 전에 적용됩니다.

1. 멸균 수술 기구 설정: 메스 블레이드, Weitlaner 리트랙터, 마이크로니들 홀더, 미세수압 집게, 마이크로조직 집게, 마이크로사이저, 마요-헤거 니들 홀더, 작동 가위, 홍채 가위, 드레싱 집게, 조직 집게, 스플린터 집게, 홍채 집게, 5 mL 주사기 (21 G 바늘), 10 mL 주사기 (22 G 바늘), 9-0 폴리 아미드 봉합사, 4-0 폴리 글락틴 봉합사.
2. 타일타민/졸라제팜(50 mg/g 용량)과 2% 자일라진 염산염(2 mg/kg 용량)의 근육 내 주사로 동물을 마취시다.
   참고: 398-420 g의 성인 스프라그-Dawley(SD) 랫트는 식도 이식에 사용하였다.
3. 외과 용 커튼으로 옮기기 전에 꼬리를 집게로 꼬집어 동물의 적절한 마취 상태를 확인하십시오.
4. 동물을 멸균 드레이프 위에 놓고 클리퍼를 사용하여 목에서 머리카락을 제거하십시오 (식도 이식용) 또는 복부 (위장관 절제술). 그런 다음 베타딘과 70 % 에탄올로 수술 부위를 문지하십시오.
5. 절개 전에, 피하 통증 완화를 위해 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)와 같은 진통을 주입하십시오.

4. 쥐에 있는 T 관을 사용하여 위장 절제술

참고: 수정된 위장관 절제술은 모든 실험 동물에서 일시적으로 비경구 관 공급을 허용하도록 수행하였다(n=5).

1. 수술 전날 쥐를 빨리 지내게 하십시오. 섹션 3에서와 같이 수술을 준비하십시오.
2. 마취 된 쥐의 피부와 복부 근육의 중간 절개를 통해 위를 노출하십시오.
3. 메스 블레이드로 전방 위벽에 3mm 오리피스를 만듭니다.
4. 실리콘 T-튜브의 팁을 결함 부위에 삽입하여 위벽에 고정시십시오.
5. T-튜브가 위 벽에서 분리되지 않도록 제대로 봉합사.
6. 이식된 T-튜브의 말단을 피하 터널을 통해 목 뒤쪽으로 빼냅니다.
7. 헤파린 캡을 T-튜브 끝에 삽입하여 위 내용물이 뒤로 흐르는 것을 방지합니다.
   참고: 협심증을 사용하여 T-튜브의 끝을 헤파린 캡과 연결합니다.
8. 4-0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 복벽과 피부의 모든 층을 봉합하십시오.
9. 위절제술이 완료된 후 모든 실험 쥐를 대사 케이지에 분리하십시오.

5. 식도 이식

참고: 2층 관 성 스캐폴드의 식도 이식은 위장관 절제술 후 1 주일 후에 수행됩니다 (n = 5). 이식에 앞서, hMSCs(세포 밀도: 지하 막 매트릭스에서 1 x 10⁶ 세포/mL)를 각 스캐폴드의 내벽에 접종하고 생물 반응기 시스템에서 3 일 동안 배양합니다. 외과 적 절차는 다음과 같습니다.

1. 모형 동물의 목털을 제거하고 무균 수술을 위한 수술 부위의 표준 드레이프를 수행한다.
   참고: 동물에 대한 수술을 유지하기 위해 큰 면도 부위를 만드는 것이 좋습니다.
2. 목의 전방 중앙 절개 후, 스트랩 근육을 분리하고 기관식도 구조를 노출.
3. 세그먼트를 절제하기 전에 식도에서 미주 신경을 무뚝뚝하게 해부하면 동물의 호흡이 손상됩니다.
4. 배율하에서 식도의 왼쪽을 기관에서 분리하고 갑상선에서 상부를 조심스럽게 분리합니다.
5. 외과 용 가위를 사용하여 식도의 모든 층을 포함하는 5mm 길이의 전체 둘레 결함을 만듭니다.
   참고 : 식도 이식 전에 수술 용 가위를 사용하여 준비된 스캐폴드를 이식 부위의 길이와 일치시킵니다.
6. 현미경으로, 9-0 봉합사 를 사용하여 말단 식도 결함의 양 단부에서 미세 아나스토모시스를 수행합니다. 상부 식도 잔재와 비계의 오른쪽 후추 마진 사이에 첫 번째 봉합사를 놓습니다. 상부 식도 잔해와 비계 사이에 오른쪽에서 왼쪽으로 봉합을 계속합니다. 하부 식도 잔재의 상부 마진과 동일한 방식으로 스캐폴드를 아나스토모제.
   참고 : 식도 이식에 대한 임상 수술에 사용되는 미세 혈관 안합을 수행합니다. 임플란트 부위의 정밀하고 방수 봉합을 위해 현미경으로 작업하십시오.
7. 그 후, 이식 부위에 주변 갑상선 플랩을 놓고 이식 부위에 혈관 공급을 안정적으로 유지관리하십시오.
8. 이식 후 피하 근육과 피부 조직을 4-0 비릴 봉합사로 바느질하십시오.
9. 모든 실험 쥐를 신진 대사 케이지에 개별적으로 보관하십시오.

6. 수술 후 절차

참고 : 수술 후 절차는 위절제술과 식도 이식 후 수행됩니다.

1. 복부 상처의 폐쇄 후, 개별 대사 케이지에 쥐를 넣고 저체온증을 방지하기 위해 적외선 온난화 장치에 케이지를 배치합니다.
2. 동물들이 흉골 의식을 달성하고 유지할 때까지 동물을 모니터링하십시오 (즉, 가슴에 똑바로 누워 있음).
3. 수술 부위의 염증을 최소화하려면 항생제 젠타미신(20 mg/kg)을 쥐에게 매일 투여하십시오.
4. 연구의 끝점까지 세 번째 수술 후 날에 경구 액체 공급을 시작합니다. 전체 영양 포뮬러(20.6 g/100 ml [g%] 탄수화물, 3.8 g% 단백질, 0.2 g% 지방)을 수술 후 하루 3배의 헤파린 캡을 통해 공급하십시오.
5. 매일 동물의 외모와 체중을 확인하십시오. 자기 해의 절개 부위 또는 튜브 섭취에 대한 저항, 다양한 수술 합병증과 같은 행동을 관리하십시오. 쥐 모델의 체중이 20% 이상 급격히 감소하면_CO2 흡입에 의해 안락사를 수행합니다.

7. 반학과 면역화학

참고 : 조직 학적 분석을 위해 안락사 된 동물의 모든 식도 조직은 외과 용 가위를 사용하여 추출됩니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 마슨의 삼색 염색은 표준 조직학적 기법을 사용하여 수행되었다. 면역성화학은 다음 프로토콜에 따라 수행되었다.

1. 이식 부위를 포함하는 전체 식도를 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하십시오. 파라핀 블록을 만들고 4 μm 두께의 단면을 잘라냅니다.
2. 조직 단면을 분리하고 에탄올 시리즈에서 탈수시. 티슈 슬라이드를 구연산완충에 담그고 전자레인지에서 10분간 가열합니다. 차가운 PBS로 세포를 20 분 동안 식히고 3 % 과산화수소에 6 분 동안 담그고 PBS로 10 분 동안 씻으십시오.
3. 3% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 배양 1 시간 동안 실온에서 조직 섹션의 비특이적 반응을 차단합니다.
4. 5 분 동안 PBS로 3x를 씻으십시오. Desmin에 대한 기본 항체로 인큐베이션 (1 :200으로 희석), 각질 13 (1 : 100으로 희석), 폰 윌레브란트 인자 (vWF; 1 :100로 희석) 4 °C에서 밤새.
5. 15 분 동안 PBS로 3x를 씻습니다. 실온에서 Desmin 및 Keratin 13에 대해 1:500의 농도로 적절한 이차 항체로 인큐베이션합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 10 분 동안 두 번 씻습니다.
   참고: vWF용 티슈 섹션은 고추냉이 과산화아제-컨쥬게이션 키트(재료 표참조)를 사용하여 배양한 다음 3,3'-다미노벤지딘(DAB)을 사용하여 시각화하였다.
6. 유리 커버 슬립 및 4',6-디아미디노-2-페놀린돌레(DAPI)를 사용하여 장착 매체를 포함합니다.

결과

도 1은 PU-PCL 2층 관형 스캐폴드의 제조 공정에 대한 개략적 도표를 나타낸다. 상기 PU 용액은 두께 200 μm의 원통형 내부 구조를 만들기 위해 18 G 바늘로부터 전기스펀을 하였다. 이어서, 용융된 PCL을 PU 나노섬유의 외벽에 일정한 간격으로 인쇄하였다. 완성된 관성 스캐폴드의 내벽및 외벽의 표면 형태는 주사 전자 현미경 이미지에서 볼 수 있다.

토론

인공 식도에 기존 동물 연구는 여전히 몇 가지 중요 한 요인에 의해 제한. 이상적인 인공 식도 스캐폴드는 생체 적합성이어야하며 우수한 물리적 특성을 가져야합니다. 그것은 해부학 누설을 방지하기 위해 초기 수술 후 기간에 점막 상피를 재생할 수 있어야합니다. 내측 원형 및 외측 세로 근육층의 재생은 기능연동동동사^12,13에도중요하다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014