Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

Resumen

La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.

Resumen

El uso de materiales biocompatibles para la reconstrucción esofágica circunferencial es una tarea técnicamente difícil en ratas y requiere una técnica de implante óptima con apoyo nutricional. Recientemente, ha habido muchos intentos de ingeniería de tejido esofágico, pero la tasa de éxito ha sido limitada debido a la dificultad en la epitelización temprana en el entorno especial de la peristalsis. Aquí, desarrollamos un esófago artificial que puede mejorar la regeneración de la mucosa esofágica y las capas musculares a través de un andamio tubular de dos capas, un sistema de biorreactor a base de células madre mesenquimales, y una técnica de alimentación de bypass con Gastrostomy. El andamio está hecho de nanofibras de poliuretano (PU) en forma cilíndrica con una hebra de policaprolactona impresa tridimensional (3D) envuelta alrededor de la pared exterior. Antes del trasplante, las células madre mesenquimales derivadas del ser humano se sembraban en el lumen del andamio, y se realizaba el cultivo del biorreactor para mejorar la reactividad celular. Mejoramos la tasa de supervivencia del injerto aplicando anastomosis quirúrgica y cubriendo la prótesis implantada con un colgajo de la glándula tiroides, seguido de la alimentación temporal de la gastrostomía no oral. Estos injertos fueron capaces de recapitular los hallazgos de epitelización inicial y regeneración muscular alrededor de los sitios implantados, como lo demuestra el análisis histológico. Además, se observaron un aumento de las fibras de elastina y la neovascularización en la periferia del injerto. Por lo tanto, este modelo presenta una nueva técnica potencial para la reconstrucción esofágica circunferencial.

Introducción

El tratamiento de los trastornos esofágicos, como las malformaciones congénitas y los carcinomas esofágicos, puede conducir a la pérdida del segmento estructural del esófago. En la mayoría de los casos, se han realizado injertos de reemplazo autólogos, como conductos de extracción gástricos o interposiciones de colon,^1,2. Sin embargo, estos reemplazos esofágistas tienen una variedad de complicaciones quirúrgicas y riesgos de reoperación³. Por lo tanto, el uso de andamios de esófago con ingeniería de tejido imitando el esófago nativo puede ser una estrategia alternativa prometedora para regenerar finalmente los tejidos perdidos^4,5,6.

Aunque un esófago con ingeniería de tejido potencialmente ofrece una alternativa a los tratamientos actuales de defectos esofágicos, existen barreras significativas para su aplicación in vivo. La fuga anastomótica postoperatoria y la necrosis del andamio esofágico implantado conducen inevitablemente a una infección letal del espacio aséptico circundante, como el mediastinum^7. Por lo tanto, es extremadamente importante prevenir la contaminación de alimentos o saliva en la herida y el tubo nasogástrico. Se debe considerar la gastrostomía o la nutrición intravenosa hasta que se complete la cicatrización de la herida primaria. Hasta la fecha, la ingeniería de tejido esofágico se ha realizado en grandes modelos animales porque los animales grandes sólo pueden ser alimentados por hiperalimentación intravenosa durante 2-4 semanas después de la implantación del andamio⁸. Sin embargo, no se ha establecido tal modelo de alimentación no oral para la supervivencia temprana después del trasplante de esófago en animales pequeños. Esto se debe a que los animales eran extremadamente activos e incontrolables, por lo que no podían mantener el tubo de alimentación en sus estómagos durante un largo período de tiempo. Por esta razón, ha habido pocos casos de trasplante de esófago exitoso en animales pequeños.

En vista de las circunstancias de la ingeniería del tejido esofágico, diseñamos un andamio tubular de dos capas que consiste en nanofibras electrospun (capa interna; Figura 1A) y una hebra impresa en 3D (capa exterior; Figura 1B) incluyendo una técnica de gastrostomía modificada. La nanofibra interna está hecha de PU, un polímero no degradable, y evita la fuga de alimentos y saliva. Las hebras externas impresas en 3D están hechas de policaprolactona biodegradable (PCL), que puede proporcionar flexibilidad mecánica y adaptarse al movimiento peristáltico. Las células madre mesenquimales derivadas de los adiposos humanos (hAD-MSC) fueron sembradas en la capa interna del andamio para promover la reepitelización. La estructura de nanofibra puede facilitar la regeneración inicial de la mucosa proporcionando un entorno de matriz extracelular estructural (ECM) para la migración celular.

También hemos aumentado la tasa de supervivencia y la bioactividad de las células inoculadas a través del cultivo del biorreactor. El andamio implantado estaba cubierto con un colgajo de la glándula tiroides para permitir una regeneración más estable de la mucosa esofágica y la capa muscular. En este informe, describimos protocolos para técnicas de ingeniería de tejido esofágico, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores a base de células madre mesenquimales, una técnica de alimentación de bypass con gastrostomía modificada y una técnica de anastomosis para la reconstrucción esofágica circunferencial en un modelo de rata.

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC No 17-0164-S1A0) del Hospital Universitario Nacional de Seúl.

1. Fabricación de andamios

NOTA: Los andamios esofágicos de dos capas se fabrican combinando electrospinning e impresión 3D. La membrana interna del andamio tubular fue fabricada por poliuretano electrospinning (PU) con mandriles giratorios de acero inoxidable como los colectores^9.

1. Para la preparación de nanofibras tubulares de PU, prepare una solución de polímero de PU al 20% (p/v) agitando en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 8 h a temperatura ambiente.
2. Coloque la solución de PU en la jeringa con una aguja de metal contundente (22 G) y electrospin en mandriles giratorios de acero inoxidable (diámetro de 2 mm) a una distancia de 30 cm entre la punta de la aguja y el colector giratorio.
   NOTA: La fuente de alimentación se establece en una corriente directa de alta tensión de 15 kV potencial. La velocidad de alimentación de la solución se fija a 0,5 ml/h utilizando una bomba de jeringa.
3. Hacer una capa tubular de nanofibra en la superficie del mandril girando a 3,14 m/s.
4. Seque la nanofibra de PU en un horno al vacío a 40 oC durante la noche para eliminar por completo el disolvente residual.
   NOTA: La pared exterior impresa en 3D del andamio esofágico se prepara utilizando un sistema de prototipado rápido. El equipo de impresión 3D consta de un dispensador, boquilla, controlador de compresión/calor, etapa de conversión de 3 ejes y sistema de software.
5. Los pellets PCL se disuelven a 100 oC en un cilindro de calentamiento y luego se imprimen en la superficie de las nanofibras a alta presión (7 bar) bajo el control de un sistema de biotrazado. El tamaño de la boquilla es de 300 m y la distancia de la hebra es de 700 m.
6. Después de retirar el andamio de dos capas del mandril, esteriliza dope en 70% de etanol bajo luz ultravioleta.
   NOTA: En estudios anteriores¹⁰se han notificado características más detalladas del andamio.

2. Sembrado celular en los injertos y cultivo del biorreactor

NOTA: Las células madre mesenquimales derivadas de adiposos humanos (hCM) compradas a una empresa se utilizaron sin modificaciones.

1. Antes del trasplante de células, esterilizar el andamio esófago impreso en 3D durante 1 h bajo luz ultravioleta, mojarlo durante 10 minutos con etanol y lavarlo 3 veces con solución salina con fosfato (PBS).
2. Cultivar y ampliar los hMSCs en medio de crecimiento (suplemento basal medio/crecimiento). Los andamios tubulares de dos capas se transfirieron a 24 placas de cultivo de tejido de pozos no adherentes.
3. Para unir las células a la superficie interna del andamio, agregue suavemente la suspensión hMSC a una densidad de 1 x 10⁶ células/ml en la matriz de membrana del sótano que contenga el medio de crecimiento.
4. Deposite uniformemente la suspensión de la matriz de membrana del sótano en la superficie interna del andamio tubular de dos capas.
5. Fije firmemente el andamio tubular con sede sin hMSC al soporte de acrílico en la cámara de cultivo del biorreactor utilizando un sistema de biorreactor de flujo pulsátil.
   NOTA: El sistema de biorreactor diseñado a medida consta de una bomba, trampa de burbujas, cámara de flujo, manómetro, válvula controlable y depósito medio. Al aplicar tensión de cizallamiento en la cámara de cultivo, permita un tiempo de descanso de 1-2 min¹¹.
6. Añada un medio de crecimiento a la cámara de cultivo y aplique una tensión de cizallamiento inducida por flujo de 0,1 dyne/cm² bajo una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO₂^10.
   NOTA: El valor de la tensión cortante inducida por el flujo se calculó simulando la peristalsis del tejido esofágico derivado del cuerpo humano de estudios anteriores¹⁰.
7. Determinar las respuestas celulares en las superficies internas de los andamios tubulares de dos capas sin cultivo de biorreactor después de 5 días utilizando un kit de ensayo de viabilidad LIVE/DEAD de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Obtenga imágenes mediante microscopía confocal utilizando la herramienta Z-stack.
8. Al tercer día, observe la morfología superficial del andamio tubular con semillas de hMSC a través de un microscopio electrónico de barrido (SEM).
   1. Fijar el andamio que fue incubado con hMSC con 2.5% glutaraldehído y OsO4 durante 24 h y deshidratar con etanol.
   2. Recubrir los hMSC fijos con platino utilizando una capa de esputo en condiciones atmosféricas de argón y obtener imágenes SEM a una tensión de aceleración de 25 kV.

3. Preparación quirúrgica para cirugía animal

NOTA: Las preparaciones quirúrgicas se aplican antes de la gastrostomía y el trasplante de esófago.

1. Configurar los instrumentos quirúrgicos estériles: cuchilla de escalpelo, retractor Weitlaner, soporte de microaguja, fórceps de microsutura, fórceps de microtejido, microtijeras, porta agujas Mayo-Hegar, tijeras de operación, tijeras de iris, fórceps de vendaje, fórceps de tejido, Fórceps de astilla, fórceps de iris, jeringa de 5 ml (aguja de 21 G), jeringa de 10 ml (aguja de 22 G), sutura de poliamida 9-0, sutura de 4-0 poliglactina.
2. Anestesiar al animal con una inyección intramuscular de tetiamina/zolazepam (dosis de 50 mg/g) y 2% de clorhidrato de xilazina (2 mg/kg de dosis).
   NOTA: Las ratas adultas Sprague-Dawley (SD) que pesan 398-420 g se utilizaron para el trasplante de esófago.
3. Antes de transferirse a la cortina quirúrgica, compruebe la condición anestésica adecuada del animal pellizcando la cola con los fórceps.
4. Coloque al animal en posición supina sobre la cortina estéril y use cortadoras para extraer el cabello del cuello (para trasplante de esófago) o abdomen (para gastrostomía). A continuación, frote el sitio quirúrgico con betadina y 70% de etanol.
5. Antes de la incisión, inyectar por vía subcutánea un analgésico como la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) para aliviar el dolor.

4. Cirugía de gastrostomía utilizando un tubo T en ratas

NOTA: Se realizó una gastrostomía modificada en todos los animales experimentales para permitir la alimentación temporal del tubo no oral de derivación (n.o 5).

1. Pida a las ratas que ayunan el día antes de la cirugía. Preparar la cirugía como en la sección 3.
2. Exponga el estómago a través de una incisión de línea media de la piel y los músculos abdominales de las ratas anestesiadas.
3. Cree un orificio de 3 mm en la pared gástrica anterior con una cuchilla de bisturí.
4. Inserte la punta del tubo T de silicona en el lugar del defecto para fijarlo a la pared del estómago.
5. Suturar correctamente para que el tubo T no se desprenda de la pared gástrica.
6. Saque el extremo distal del tubo T implantado a través del túnel subcutáneo en la parte posterior del cuello.
7. Inserte la tapa de heparina en el extremo del tubo T para evitar que el contenido del estómago fluya hacia atrás.
   NOTA: Utilice un angiocatéter para conectar el extremo del tubo T con la tapa de heparina.
8. Sutura todas las capas de la pared abdominal y la piel usando 4-0 suturas de poliglactina.
9. Mantenga todas las ratas experimentales separadas en una jaula metabólica después de que se haya completado la gastrostomía.

5. Trasplante esofágico

NOTA: El trasplante esofágico del andamio tubular de dos capas se realiza 1 semana después de la gastrostomía (n.o 5). Antes del trasplante, inocular hMSC (densidad celular: 1 x 10⁶ células/ml en la matriz de membrana del sótano) en la pared interna de cada andamio e incubar durante 3 días en el sistema de biorreactor. El procedimiento quirúrgico es el siguiente.

1. Retire el vello del cuello de los animales modelo y realice el drenaje estándar del sitio quirúrgico para la cirugía aséptica.
   NOTA: Se recomienda crear un área de afeitado grande para mantener la cirugía asceptica en el animal.
2. Después de la incisión mediana anterior del cuello, separe los músculos de la correa y exponga la estructura traqueoesofágica.
3. Diseccionar con rodeos el nervio vago del esófago antes de volver a sellar el segmento, de lo contrario la respiración del animal se vea comprometida.
4. Bajo aumento, aísle el lado izquierdo del esófago de la tráquea y separe cuidadosamente la parte superior de la glándula tiroides.
5. Crear un defecto circunferencial completo de 5 mm de largo que contenga todas las capas del esófago utilizando tijeras quirúrgicas.
   NOTA: Antes del trasplante de esófago, corte los andamios preparados con tijeras quirúrgicas para que coincidan con la longitud del sitio del trasplante.
6. Bajo un microscopio, realice microanastomosis en ambos extremos del defecto esofágico distal utilizando un hilo de sutura 9-0. Coloque la primera sutura entre el margen inferoposterior derecho del remanente del esófago superior y el andamio. Continúe suturando de derecha a izquierda entre el remanente del esófago superior y el andamio. Anastomosa del andamio de la misma manera que el margen superior del remanente del esófago inferior.
   NOTA: Realizar anastomosis microvascular como se utiliza en la cirugía clínica para el trasplante de esófago. Trabaje con un microscopio para una sutura precisa y estanca del sitio del implante.
7. Después, poner el colgajo de la glándula tiroides circundante sobre el sitio trasplantado para asegurar el mantenimiento estable y el suministro vascular a los injertos.
8. Después del trasplante, coser el músculo subcutáneo y el tejido de la piel con una sutura de 4-0 vicryl.
9. Mantener todas las ratas experimentales individualmente en jaulas metabólicas.

6. Procedimientos postoperatorios

NOTA: Los procedimientos postoperatorios se realizan después de la gastrostomía y el trasplante de esófago.

1. Después del cierre de la herida abdominal, coloque las ratas en jaulas metabólicas individuales y coloque las jaulas en dispositivos de calentamiento infrarrojo para evitar la hipotermia.
2. Monitoree a los animales hasta que logren y mantengan la recumbencia esternal (es decir, acostado sin corazón sobre el pecho).
3. Para minimizar la inflamación en el sitio quirúrgico, administre diariamente el antibiótico gentamicina (20 mg/kg) a las ratas.
4. Comience la alimentación líquida oral en el tercer día postoperatorio hasta la variable del estudio. Suministrar toda la fórmula nutricional (20,6 g/100 ml [g%] carbohidratos, 3,8 g% de proteína, 0,2 g% de grasa) a través de la tapa de heparina 3 veces al día a partir del día después de la cirugía.
5. Compruebe la apariencia de los animales y el peso corporal diariamente. Compruebe el comportamiento, como el sitio de incisión autolesionante o la resistencia a la ingesta de tubos, así como varias complicaciones quirúrgicas. Cuando el peso corporal de los modelos de ratas disminuya rápidamente en un 20% o más, realice la eutanasia por inhalación de_CO2.

7. Histología e inmunohistoquímica

NOTA: Para el análisis histológico, todo el tejido esofágico de los animales eutanasiados se extrae mediante tijeras quirúrgicas. La tinción de hematoxilina y eosina y la tinción tricroma de Masson se realizaron utilizando técnicas histológicas estándar. La inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo.

1. Fije todo el esófago que contiene los sitios trasplantados en un 4% de paraformaldehído. Crea un bloque de parafina y corta secciones de 4 m de espesor.
2. Desparaffinizar las secciones tisulares y deshidratarlas en una serie de etanol. Sumerja los portaobjetos en el tampón de citrato y caliente durante 10 minutos en el microondas. Enfríe las células con PBS frío durante 20 min. Sumergir en 3% peróxido de hidrógeno durante 6 min, y lavar con PBS durante 10 min.
3. Incubar en albúmina sérica bovina (BSA) al 3% durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear reacciones inespecíficas de las secciones de tejido.
4. Lavar 3x con PBS durante 5 min. Incubar con anticuerpos primarios contra Desmin (diluido a 1:200), queratina 13 (diluido a 1:100) y factor von Willebrand (vWF; diluido a 1:100) durante la noche a 4oC.
5. Lavar 3x con PBS durante 15 min. Incubar con el anticuerpo secundario adecuado a una concentración de 1:500 para Desmin y Queratina 13 a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos.
   NOTA: Las secciones de tejido para vWF se incuban utilizando un kit conjugado con peroxidasa de rábano picante (ver Tabla de Materiales)y luego se visualizaron con 3,3'-diaminobenzidina (DAB).
6. Montar con un cubrevidrio y 4',6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) que contiene medio de montaje.

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Resultados

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del proceso de fabricación del andamio tubular de dos capas PU-PCL. La solución de PU fue electrospun de una aguja de 18 G para hacer una estructura interna cilíndrica con un espesor de 200 m. Luego, el PCL fundido se imprimió en la pared exterior de la nanofibra de la PU a intervalos regulares. La morfología superficial de las paredes internas y externas del andamio tubular completado se puede ver en las imá...

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Discusión

Los estudios en animales existentes sobre esofagia artificial siguen estando limitados por varios factores críticos. El andamio esofágico artificial ideal debe ser biocompatible y tener excelentes propiedades físicas. Debe ser capaz de regenerar el epitelio de la mucosa en el período postoperatorio temprano para evitar fugas anastomóticas. La regeneración de las capas musculares longitudinales circulares y externas internas también es importante para la peristalsis funcional^12,

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic cage	TEUNGDO BIO & PLANT	JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose)	Virbac	1000000188
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
1 mL Syringe	BD	309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun)	Byely	Q-0615-035
4% paraformaldehyde	BIOSOLUTION	BP031
4-0 Vicryl	ETHICON	W9443
9-0 Vicryl	ETHICON	W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal).	Septopal	0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X	Sigma	C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT	VECTOR	SK4100
Desmin	Santa Cruz	sc-23879
Elastic stain kit	ScyTeK	ETS-1
Ethanol	Merck	100983
Ethanol	Merck	64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS)	Gibco	16000-044
Glutaraldehyde	Sigma	354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11001
Heparin cap	Hyupsung Medical	HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM)	Invitrogen	R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain)	VECTOR	PK7800
Hydrogen peroxide	JUNSEI	7722-84-1
Keratin13	Novus	NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit	Molecular Probes	L3224
Matrigel	Corning	354262
N,N-dimethylformamide (DMF)	Sigma	227056
Nonadherent 24-well tissue culture plates.	Corning	3738
OsO4	Sigma	O5500
Petri dish	Eppendorf	3072115
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X	BIOSOLUTION	BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer	Sigma	440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer	Lubrizol	2363-80AE
Power Supply	NanoNC	HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931
Rumpun	Bayer	Q-0615-035
Silicone T-tube	Sewoon Medical	2206-005
Terramycin Eye Ointment	Pfizer Pharmaceutical Korea	W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil)	Virbac Laboratories	Q-0042-058
Trichrome stain kit	ScyTeK	TRM-1
von Willebrand Factor (vWF)	Santa Cruz	sc 14014