JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن لدبابيس الشعر RNA والحلقات تعمل كالاشعال للنسخ العكسي (RT) في غياب الإشعال تسلسل محدده ، تتداخل مع دراسة المستنسخات انتيسنس متداخلة. وقد وضعنا تقنيه قادره علي تحديد الحمض الريبي النيبالي محدده حبلا ، ونحن قد استخدمت لدراسة فيروس نقص المناعة الذاتية-1 البروتين انتيسنس ASP.

Abstract

في الفيروسات الرجعية, وقد وصفت النسخ انتيسنس في كل من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (فيروس العوز المناعي البشري-1) والإنسان T-اللمفاوية الفيروس 1 (HTLV-1). في فيروس نقص المناعة الذاتية-1 ، ويقع الجينات المضادة للتحسس ASP البروتين علي حبلا السلبية من البيئية ، في اطار القراءة-2 ، التي تغطي تقاطع gp120/gp41. في اتجاه المعني ، تتداخل نهاية 3 ' من ASP فتح اطار القراءة مع gp120 المناطق المتغيرة بشكل مفرط V4 و V5. وقد أحبطت دراسة الجيش النيبالي الريبي من قبل ظاهره المعروفة باسم RT-فتيله الذاتي, حيث الهياكل الثانوية RNA لديها القدرة علي رئيس الوزراء RT في غياب التمهيدي محدده, توليد cDNAs غير محدده. الاستخدام المشترك لل RNA عاليه المسخ مع الإشعال العكسي بيوتينيلاتيد في رد فعل RT ، جنبا إلى جنب مع تنقيه تقارب cDNA علي الخرز المغناطيسي المغلفة العقديات ، سمح لنا بشكل انتقائي تضخيم الحمض الريبي النيبالي في الخلايا التائية المشتقة من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة المكتسب-1. طريقتنا هي منخفضه التكلفة نسبيا ، بسيطه لأداء ، موثوق بها للغاية ، ويمكن استنساخها بسهوله. وفي هذا الصدد ، فانه يمثل أداه قويه لدراسة النسخ المضادة للتحسس ليس فقط في فيروس نقص المناعة الطبيعية-1 ولكن أيضا في النظم البيولوجية الأخرى.

Introduction

الجينات البروتين انتيسنس (ASP) هو اطار القراءة المفتوحة (ORF) الموجود علي حبلا السلبية من نوع فيروس نقص المناعة البشرية 1 (الفيروس-1) الظرف (البيئية) الجينات ، التي تغطي تقاطع gp120/gp411. وعلي مدي السنوات الثلاثين الماضية ، أظهرت عده تقارير ان الجينات المصابة بفيروس نقص المناعة الوراثية قد كتبت وترجمت في الواقع2و3و4و5و6و7و8و9. علي الرغم من ان النصوص المضادة للتحسس ASP قد تميزت تماما في المختبر, حتى وقت قريب المعلومات حول الإنتاج الفعلي من الجيش النيبالي الريبي في المرضي كان لا يزال مفقودا.

تسلسل ASP عكس ومكمله إلى البيئية. يمثل هذا عقبه رئيسيه عند محاولة الكشف عن النسخ المستنسخة ل ASP. تستخدم أساليب النسخ العكسي القياسية-تفاعل البلمره المتسلسل (RT-PCR) الإشعال المضاد للتحسس الخاص بالجينات لتوليف DNAs التكميلية (cDNAs) القطبية الصحيحة. هذا النهج ، ومع ذلك ، لا يسمح لتحديد التوجه (الشعور أو انتيسنس) من النموذج الاولي الحمض الريبي النيبالي ، منذ الحمض الريبي النيبالي أو حلقات يمكن رئيس الوزراء RT في كلا الاتجاهين في غياب الإشعال10، وهي ظاهره تعرف باسم rt الذاتي فتيله. معظم المحققين ASP الجانبية مشكله RT الذاتي فتيله باستخدام الإشعال الموسومة مع تسلسل التي لا تتعلق بفيروس نقص المناعة الشخصية-111,12. ومع ذلك ، فان هذه الاستراتيجية لا تقضي علي حدوث هذه الظاهرة ، وقد تؤدي إلى احتمال ترحيل cDNAs غير محدده إلى الطراز PCR11.

وقد قمنا مؤخرا بتطوير رواية RT-PCR الخاصة الجديدة لدراسة الحمض الريبي المضاد للتحسس ، وقد استخدمناه للكشف عن الحمض الريبي النيبالي في فوج من سته مرضي مصابين بفيروس نقص المناعة المناعية ، كما هو مبين في الجدول 1. وقد سبق ان نشر أنطونيو مانكارييلا وآخرون13الاجراء الموصوف أدناه. في بروتوكولنا ، ونحن تجنب إنتاج cDNAs غير محدده بواسطة نهج مزدوج. أولا ، ونحن القضاء علي الهياكل الثانوية الجيش النيبالي الريبي عن طريق التخلص من الجيش النيبالي الريبي في درجه حرارة عاليه (94 درجه مئوية) ، وثانيا ، ونحن عكس نسخ الحمض الريبي النيبالي ASP باستخدام التمهيدي المحددة ASP الحيوية وتقارب-تنقيه cDNA الناتجة. من خلال هذا النهج ، ونحن قادرون علي تضخيم فقط لدينا الهدف cDNA ، لان غيرها من المنتجات RT غير محدده اما منعت من ان تتولد (ارتفاع درجه حرارة المسخ من RNA) أو القضاء عليها قبل PCR (التقارب تنقيه).

Protocol

تمت الموافقة علي هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمركز الجامعي المستشفى فودويس (CHUV).

1-الاصابه بالخلايا أحاديه النواة للدم الطرفية (Pbmcmcmcmcmcmcmcmccm1) مع الفيروسHXB2 سلاله

  1. اليوم الأول: تحفيز البنك
    1. عزل Pbmmmmcmcate من معطف المتبرع صحية بوفي.
    2. العد وأعاده التعليق Pbmmx في تركيز 1x106/مل في كامل معهد روزويل بارك التذكاري (rpmi) 1640 المتوسطة التي تحتوي علي 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (ار-10) و 1 ٪ البنسلين/ستربتوميسين مع أضافه 50 U/ml من انترلوكين-2 (آيل-2) و 3 ميكروغرام/مل فيتوهايماجلوتينين (فا).
    3. Pipet صعودا وهبوطا وتقسيم الخلايا في لوحات 2 6 البئر (3 مل من تعليق الخلية/جيدا).
    4. احتضان لمده 3 أيام في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  2. اليوم الثالث: عدوي الفيروس
    ملاحظه: استخدام أحد لوحات اثنين كما في الخطوة 1-1-3 كعنصر تحكم سالب (لا تصيب هذه الخلايا).
    تنبيه: نفذ الاجراء بأكمله في مختبر مستوي السلامة البيولوجية III (P3).
    1. تجمع PBMCs من لوحه واحده في أنبوب الصقر 50 mL والطرد المركزي في 300 x g لمده 10 دقيقه.
    2. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 2.2 ml من R-10 التي تحتوي علي 20 U/ml من IL-2 و 2 ميكروغرام/مل polybrene.
    3. ذوبان قارورة تحتوي علي فيروس HIV-1HXB2 وأضافه 1.8 مل من تعليق الفيروسية (0.376 Ng/μl) إلى الخلايا.
    4. احتضان الخلايا لمده 2 ح في 37 درجه مئوية ، ويحوم برفق أنبوب كل 30 دقيقه.
    5. الطرد المركزي الخلايا في 300 x g لمده 10 دقيقه.
    6. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 1x106/مل في R-10 التي تحتوي علي IL-2 (50 U/ml).
    7. نقل تعليق الخلية إلى لوحه 24 بئر في تركيز 1 مل/بئر واحتضان لمده 5 أيام في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
    8. حصاد 1 جيدا كل يوم ونقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 mL (المسمي مع يوم العدوى).
      ملاحظه: قبل طرد ، نقل 150 μL من تعليق الخلية إلى أنبوب تدفق الخلوي للسيطرة علي نوعيه العدوى PBMCs (انظر الخطوة 1.3)
    9. الطرد المركزي الأنابيب في 400 x g لمده 10 دقيقه وتجاهل supernatant.
    10. تجميد الكريات الخلية في-80 درجه مئوية حتى الاستخدام.
  3. العدوى بالإيدز: مراقبه الجودة
    1. لكل يوم من العدوى ، وجمع 150 μL من المصابين Pbmcms ونقلها إلى أنبوب تدفق الخلوي.
    2. أضافه 1 مل من الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة (تلفزيوني) وأجهزه الطرد المركزي في 400 x g لمده 5 دقائق.
    3. تجاهل ماده طافي وأضافه 50 μl من التلفزيونية التي تحتوي علي 1 μl من اكوا الحية/الميت صبغ (المخفف سابقا 1:10 مع تلفزيوني).
    4. احتضان في 4 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.
    5. أضافه 1 مل من تلفزيوني ، جهاز الطرد المركزي في 400 x g لمده 5 دقائق ، وتجاهل supernatant.
    6. أضافه 250 μL من الحل التثبيت/بيركابيلايشن واحتضان لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
    7. أضافه 1 مل من 1x بيرم/غسل العازلة (10x حل الأوراق المالية التي تحتوي علي كل من والمخففة صابونين 1:10) والطرد المركزي في 400 x g لمده 5 دقيقه.
    8. تجاهل ماده طافي وأضافه 50 μl من التلفزيونية التي تحتوي علي فيروس نقص المناعة الذاتية الكمامة p24 فلوريسئين ايزوثيسيانات (fitc)-الأجسام المضادة مترافق (المخفف 1:10).
    9. احتضان لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
    10. أضافه 1 مل من تلفزيوني ، جهاز الطرد المركزي في 400 x g لمده 5 دقائق ، وتجاهل supernatant.
    11. أضافه 150 μL من x CellFIX (10x حل الأوراق المالية التي تحتوي علي 10 ٪ الفورمالديهايد ، 3.55 ٪ الميثانول ، 0.93 ٪ الصوديوم أزيد المخفف 1:10) وتحليل الخلايا عن طريق تدفق الخلوي.

2-تحفيز خلايا الإنسان المضادة لCD3/الCD28

  1. عزل الخلايا التائية من الفيروسات المصابة بالإيدز والمتبرعين الأصحاء.
  2. اعداد الإنسان المضادة لCD3/CD28 مزيج الأضداد عن طريق تمييع المضادة لCD3 (1:100) والمضادة لCD28 (1:50) في الاذاعه التلفزيونية.
  3. معطف لوحه 48 البئر عن طريق أضافه 200 μL من مزيج الأجسام المضادة في بئر لعدد مناسب من الآبار واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 2 ساعة.
  4. يستنشق حل الأجسام المضادة وأضافه 1 مل من الخلايا التائية في 1x106/مل إلى الآبار المضادة لCD3/CD28 المغلفة.
    ملاحظه: تحفيز الخلايا التائية + T تصل إلى 5 أيام.

3. عكس النسخ

ملاحظه: للحصول علي الإشعال الخاصة بالمريض ، تم تضخيم الحمض النووي الموفر للخلايا من الخلايا التائية لكل مريض باستخدام فيروس نقص المناعة الذاتية-1HXB2 Pan ASP الإشعال. تم تصميم التمهيدية محدده المريض باستخدام تسلسل proviral الداخلية إلى الإشعال Pan ASP. وترد في الجدول 2جميع الإشعال والمجسات المستخدمة في هذه الدراسة.

  1. عزل [رنا] إجماليه من خلايا
    1. قياس الحمض النووي الريبي والقضاء علي تلوث الدنا عن طريق معالجه عينات مع DNase.
    2. تنفيذ ردود الفعل RT في حجم 50 μL. نقل 0.1-1 ميكروغرام من الحمض الريبي النيبالي الإجمالي إلى عدد مناسب من الآبار من لوحه PCR 96. اعداد خليط الحمض الريبي النيبالي عن طريق أضافه المكونات التالية إلى RNA:
      5 μL من التمهيدي العكسي ASP بيوتينيلاتيد (20 μM)
      2.5 μL من ديكسينوكليوتيد ثلاثي فوسفات (dNTPs) (10 ملم)
      25 μL من ثنائي ايثيلبيروكاربوناتي (DEPC)-معالجه الماء المقطر (dH2س).
      اعداد الضوابط RT الذاتية عن طريق أضافه 5 μL من المياه الخالية من النيوداز بدلا من التمهيدي العكسي ASP بيوتينيلاتيد.
    3. وضع 96 البئر PCR لوحه في ثيرموسيكلير وتسخين خليط الحمض الريبي النيبالي إلى 94 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
    4. علي الفور تهدئه خليط الحمض الريبي النيبالي في الماء المثلج لمده لا تقل عن 1 دقيقه.
    5. اعداد خليط التفاعل عن طريق أضافه المكونات التالية إلى أنبوب 1.5 mL (حساب العدد الإجمالي للعينات بالاضافه إلى 1):
      10 μL من 5x RT المخزن المؤقت
      2.5 μL من 0.1 M من 1, 4-ديثيوثريتول (DTT)
      2.5 μL من RNase خارج (40 وحده/μL)
      2.5 μL من انزيم RT (200 وحده/μL)
    6. نقل 17.5 μL من هذا الخليط إلى كل من الآبار التي تحتوي علي الحمض الريبي النيبالي. اعداد الضوابط RT-ناقص استبدال النسخ العكسي مع 2.5 μL من المياه الخالية من النيوداز.
    7. تخلط برفق واحتضان لوحه في 55 درجه مئوية ل 60 دقيقه باستخدام ثيرموسيكلير.
    8. Inactivate ردود الفعل عن طريق التدفئة في 70 درجه مئوية لمده 15 دقيقه.

4. التقارب تنقيه ASP الحيوية الحيوية

ملاحظه: لا تنقيه ردود الفعل RT-ناقص.

  1. اعداد 1 لتر من 2x الغسيل/ملزمه العازلة التي تحتوي علي 10 ملم تريس-HCl (pH 7.5) ، 1 مم ايثيل الصوديوم حمض (أدتا) و 2 م NaCl. تصفيه الحل.
    1. اعداد 50 مل من 1x الغسيل/العازلة ملزمه باستخدام المياه الصف PCR.
    2. لكل رد فعل ، استخدم 10 μL من الخرز المغناطيسي المترافق مع العقديات. استنادا إلى عدد من ردود الفعل ، نقل حجم مناسب من الخرز إلى أنبوب 1.5 mL.
    3. غسل الخرز عن طريق أضافه حجم متساو من 2x غسل/ملزمه العازلة ودوامه لمده 15 ثانيه.
    4. ضع الأنبوب في رف فصل مغناطيسي وحضن لمده 3 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    5. بعناية أزاله ماده طافي دون إزعاج الخرز وأضافه نفس الحجم من الغسيل/ملزمه 2x العازلة كالحجم الاولي من الخرز.
    6. دوامه ل 30 s ونقل 10 μL من تعليق الخرز إلى عدد مناسب من أنابيب 1.5 mL.
    7. وضع الأنابيب في رف الفصل المغناطيسي واحتضان لمده 3 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    8. تجاهل ماده طافي وأضافه 50 μl من غسل/ملزمه 2x العازلة.
    9. أضافه 50 μL من الحيوية الحيوية للأنابيب المقابلة التي تحتوي علي الخرز.
    10. احتضان لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة الدورية برفق.
    11. فصل الخرز من ماده طافي بواسطة رف فصل المغناطيس لمده 3 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    12. غسل الخرز عن طريق أضافه 200 μL من 1x الغسيل/ملزمه العازلة. وضع الأنابيب في رف فصل المغناطيس لمده 3 دقائق في درجه حرارة الغرفة وتجاهل supernatant. كرر مرتين.
    13. أعاده تعليق الخرز في 10 μL من المياه الصف PCR.

5. PCR القياسية

ملاحظه: الهدف من PCR القياسية هو تضخيم ORF بأكمله من الجينات ASP. ثم يتم استنساخ منتجات التضخيم إلى pcr 2.1 البلازميد لتطوير المنحنيات القياسية ل ASP RNA الكمي بواسطة pcr في الوقت الحقيقي (انظر الفقرة في الوقت الحقيقي pcr).

  1. تنفيذ PCRs القياسية في حجم إجمالي 50 μL. اعداد حجم مناسب من المزيج الرئيسي PCR (عدد العينات بالاضافه إلى 1). لكل عينه ، أضافه المكونات التالية إلى أنبوب 1.5 mL:
    1 μL من 10 μM الإشعال ASP (إلى الامام والخلف)
    1 μL من 10 مم dNTPs
    كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) (تركيز يعتمد علي الإشعال المستخدمة)
    dH2O إلى الحجم النهائي من 49 μl
    1. تخلط جيدا ، وتدور بسرعة أسفل المحتويات ونقل 49 μL/well من المزيج الرئيسي PCR إلى لوحه PCR 96.
    2. دوامه بعناية الأنابيب التي تحتوي علي الخرز المستخدمة لتنقيه التقارب ASP cDNA ل 15 ثانيه.
    3. أضافه 1 μL من الخرز في الآبار المقابلة وتشغيل PCR باستخدام البرنامج التالي: 95 درجه مئوية لمده 2 دقيقه ، 40 دورات من 95 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، 55 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، و 68 درجه مئوية ل 40 s ، ثم 68 درجه مئوية لمده 7 دقائق.
    4. فصل المنتجات PCR علي 1 ٪ هلام اجنشا ، وقطع العصابات واستنساخ المنتجات تضخيمها إلى pCR 2.1 plasmid.
    5. تسلسل وتحليل تسلسل كل استنساخ.

6. الوقت الحقيقي PCR الكمية (qPCR)

ملاحظه: تطوير الإشعال الخاصة بالمريض والتحقيقات باستخدام النهج الموصوف في الخطوة 3 "عكس النسخ". للحصول علي qPCR تشمل المخففات البلازما ASP لمنحنيات القياسية. يتم تطوير البلازميدات التي تحتوي علي ادراج المريض محدده كما هو مذكور في المذكرة في بداية الخطوة 5 "PCR القياسية".

  1. اعداد منحني القياسية باستخدام 1:10 ASP المخففات المتسلسلة البلازما بدءا من 3 × 106 نسخ/μl وصولا إلى 3 نسخ/μl.
    1. الجولة الاولي PCR (ما قبل أمبير). تنفيذ ردود الفعل في حجم إجمالي من 25 μL. اعداد حجم مناسب من المزيج الرئيسي PCR (عدد العينات بالاضافه إلى 1). لكل عينه ، أضافه المكونات التالية إلى أنبوب 1.5 mL:
      0.5 μL من ASP أو مزيج التمهيدي البيئي (التركيز النهائي 0.2 μM لكل منهما) (إلى الامام والخلف)
      0.5 μL من مزيج dNTPs (التركيز النهائي 0.2 mM لكل منهما)
      MgCl2 (تركيز يعتمد علي أزواج التمهيدي)
      dH2O إلى الحجم النهائي من 24 μl
    2. نقل 24 μL من المزيج الرئيسي PCR إلى عدد مناسب من الآبار من لوحه PCR 96 جيدا.
    3. دوامه بعناية الأنابيب التي تحتوي علي الخرز مع cDNA ل 15 ق.
    4. أضافه 1 μL من الخرز إلى الآبار المقابلة. تفعل الشيء نفسه لتخفيف البلازما.
    5. تشغيل PCR باستخدام الخوارزميه التالية: التشبع لمده 2 دقيقه في 95 درجه مئوية ؛ 30 ق في 95 درجه مئوية ، 30 ثانيه في 55 درجه مئوية ، 40 s في 68 درجه مئوية ل 18 دورات ؛ التمديد عند 68 درجه مئوية لمده 7 دقائق.
    6. تمييع الجولة الاولي PCRs ردود الفعل 1:5 مع المياه الصف PCR.
    7. الجولة الثانية qPCR. تنفيذ ردود الفعل في حجم إجمالي من 20 μL. اعداد حجم مناسب من المزيج الرئيسي PCR (عدد العينات بالاضافه إلى 1). لكل عينه ، أضافه المكونات التالية إلى أنبوب 1.5 mL:
      1.8 μL 10 μM الإشعال (إلى الامام والخلف)
      1 μL من 5 μM التحقيق
      6.2 μL من dH2س
    8. نقل 19 μL من qPCR ماستر مزيج في عدد مناسب من الآبار من لوحه qPCR 96 وأضافه 1 μL من ردود الفعل PCR الجولة الاولي المخففة إلى الآبار المقابلة. تفعل الشيء نفسه لتخفيف البلازما.
    9. تشغيل qPCR مع الخوارزميه التالية: التشبع لمده 10 دقيقه في 95 درجه مئوية ؛ 15 ق في 95 درجه مئوية ، 1 دقيقه في 60 درجه مئوية لدورات 40.

النتائج

درجه الحرارة العالية RNA المسخ إلى جانب تنقيه التقارب من الحمض الحيوي الحيوي ويمنع التضخيم من المنتجات غير محدده ASP خلال PCR في PBMCs المصابة في المختبر وفي الخلايا المعزولة من المرضي. وقدثبت الذاتي فتيله ان يحدث اثناء النسخ العكسي لل rnas انتيسنس10،14،

Discussion

في هذا التقرير ونحن وصف الفحص RT حبلا محدده تطبيقها علي الكشف عن الجيش النيبالي الريبي في الخلايا المعزولة من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذاتية-1. حدوث فتيله غير محدده اثناء RT يعوق الكشف عن النسخ الحمض الريبي النيبالي مع القطبية الحق ، مما يؤدي إلى سوء تفسير النتائج. وقد وضعت المج?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ انه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر السيدة باتريزيا إميليو ، وندرا نوتو ، وكريج فينويك ، وماتثيو بيرو لكونها دائما متاحه لمناقشه عملنا وجميع الناس في مختبر الإيدز المناعي لمساعدتهم التقنية الثمينة. نود أيضا ان نشكر جون وهارون Weddle من شركه VSB المرتبطة التي ساهمت مع الاعمال الفنية الممتازة. وأخيرا ، العديد من الشكر الخاص لجميع المرضي ، الذين بدونهم هذا العمل لم يكن ممكنا. ولم يتلق هذا العمل اي منحه محدده من اي وكاله تمويل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing KitApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Set (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation KitStemcell Technologies19052
Fetal Bovine SerumBiowestS1010-500
Fixation/Permeabilization Solution KitBecton Dickinson554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
Human IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Mouse Anti-Human CD28Becton Dickinson55725
Mouse Anti-Human CD3Becton Dickinson55329
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-StreptomycinBioConcept4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High FidelityInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polybrene Infection / Transfection ReagentSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cellsInvitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase (2 U/µL)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786

References

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153 ASP 1 den RT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved