Rilevamento di trascrizioni di RNA di tipo 1 (HIV-1) di proteina antisenso (ASP) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di RT-PCR specifico di Strand

Riepilogo

Le forcine e i loop di RNA possono funzionare come primer per la trascrizione inversa (RT) in assenza di primer specifici della sequenza, interferendo con lo studio delle trascrizioni antisense sovrapposte. Abbiamo sviluppato una tecnica in grado di identificare l'RNA specifico del filamento, e l'abbiamo usata per studiare la proteina antisenso HIV-1 ASP.

Abstract

Nei retrovirus, la trascrizione antisenso è stata descritta sia nel virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) che nel virus T-linfotropico umano 1 (HTLV-1). Nell'HIV-1, il gene ASP della proteina antisenso si trova sul filamento negativo di env, nel fotogramma di lettura -2, che si estende per la giunzione gp120/gp41. Nell'orientamento del senso, l'estremità 3' del frame di lettura ASP aperto si sovrappone alle regioni ipervariabili gp120 V4 e V5. Lo studio dell'RNA ASP è stato ostacolato da un fenomeno noto come RT-self-priming, per cui le strutture secondarie dell'RNA hanno la capacità di innescare RT in assenza del primer specifico, generando cDNA non specifici. L'uso combinato dell'elevata denaturazione dell'RNA con primer inversi biotinylati nella reazione RT, insieme alla purificazione dell'affinità del cDNA su perline magnetiche rivestite di streptavidin, ci ha permesso di amplificare selettivamente l'RNA ASP nelle cellule T CD4, derivate da individui infettati da HIV-1. Il nostro metodo è relativamente a basso costo, semplice da eseguire, altamente affidabile e facilmente riproducibile. A questo proposito, rappresenta un potente strumento per lo studio della trascrizione antisenso non solo in HIV-1 ma anche in altri sistemi biologici.

Introduzione

Il gene della proteina antisenso (ASP) è un telaio di lettura aperto (ORF) situato sul filamento negativo del gene dell'involucro (HIV-1) del virus dell'immunodeficienza umana, che si estende sulla giunzione gp120/gp41¹. Negli ultimi 30 anni, diversi rapporti hanno dimostrato che il gene ASP HIV è effettivamente trascritto e tradotto^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Anche se le trascrizioni antisense ASP sono state completamente caratterizzate in vitro, fino a poco tempo fa mancavano ancora informazioni sulla produzione effettiva di RNA ASP nei pazienti.

La sequenza di ASP è inversa e complementare all'ambiente di env. Questo rappresenta un ostacolo importante quando si tenta di rilevare le trascrizioni per ASP. I metodi standard di reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzano primer antisense specifici genici per sintetizzare DNA complementari (CDA) della polarità destra. Questo approccio, tuttavia, non consente di determinare l'orientamento (senso o antisenso) del modello di RNA iniziale, poiché le forcine o i loop di RNA possono innescare RT in entrambe le direzioni in assenza di primer¹⁰, un fenomeno noto come RT self-priming. La maggior parte degli investigatori ASP elude il problema dell'auto-priming RT utilizzando i primer contrassegnati con sequenze che non sono correlate all'HIV-1^11,12. Questa strategia, tuttavia, non elimina il verificarsi del fenomeno e può portare a potenziali riporti di cDNA non specifici nel PCR¹¹.

Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo saggio RT-PCR specifico del filamento per lo studio dell'RNA antisenso e l'abbiamo utilizzato per il rilevamento dell'RNA ASP in una coorte di sei pazienti affetti da HIV, come mostrato nella tabella 1. La procedura descritta di seguito è stata precedentemente pubblicata da Antonio Mancarella et^al. Nel nostro protocollo, evitiamo la produzione di cDNA non specifici con un duplice approccio. In primo luogo, eliminiamo le strutture secondarie dell'RNA denimentando l'RNA ad alta temperatura (94 gradi centigradi), e in secondo luogo, invertiamo l'RNA ASP utilizzando un primer biotinylato specifico di ASP e purificando l'affinità-purificailo il cDNA risultante. Con questo approccio, siamo in grado di amplificare solo il nostro cDNA target, poiché altri prodotti RT non specifici sono o impedito di essere generati (denaturazione ad alta temperatura di RNA) o eliminati prima della PCR (purificazione dell'affinità).

Protocollo

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).

1. Infezione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) con ceppo HIV-1_HXB2

1. Giorno 1: PBMC STIMULATION
   1. Isola i PBMC da un cappotto sano per i donatori.
   2. Contare e risospendere i PBMC a una concentrazione di 1x10⁶/mL nel roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio completo contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicilli in/streptomicina (R-10), con aggiunta di 50 U/mL di interleuche-2 (IL-2) e 3 fitoaemagglutina g/mL (PHA).
   3. Pipet su e giù e dividere le cellule in due piastre a sei pozzetti (3 mL di sospensione cellulare / bene).
   4. Incubare per 3 giorni a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂.
2. Giorno 3: PMC INFECTION
   NOTA: Utilizzare una delle due piastre come nel passaggio 1.1.3 come controllo negativo (non infettare queste cellule).
   AVVISO: Eseguire l'intera procedura in un laboratorio di biosicurezza di livello III (P3).
   1. Piscina PBMCc da una piastra in un tubo falco 50 mL e centrifugare a 300 x g per 10 min.
   2. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in 2,2 mL di R-10 contenenti 20 U/mL di IL-2 e 2 g/mL di polibrene.
   3. Scongelare le fiale contenenti il virus HIV-1_HXB2 e aggiungere 1,8 mL di sospensione virale (0,376 ng/L) alle cellule.
   4. Incubare le cellule per 2 h a 37 gradi centigradi, ruotando delicatamente il tubo ogni 30 min.
   5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min.
   6. Eliminare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule a 1x10⁶/mL in R-10 contenente IL-2 (50 U/mL).
   7. Trasferire la sospensione cellulare su una piastra di 24 pozze ad una concentrazione di 1 mL/pozzo e incubare per 5 giorni a 37 e 5% CO₂.
   8. Raccogliere 1 bene ogni giorno e trasferire le cellule a tubo da 1,5 mL (etichettato con il giorno dell'infezione).
      NOTA: prima della centrifuga, trasferire 150 l di sospensione cellulare in un tubo di citometria a flusso per il controllo della qualità dell'infezione da PBMCC (vedere il punto 1.3)
   9. Centrifugare i tubi a 400 x g per 10 min e scartare il supernatante.
   10. Congelare i pellet delle cellule a -80 gradi centigradi fino all'uso.
3. Infezione PBMCs: controllo di qualità
   1. Per ogni giorno di infezione, raccogliere 150 l di PBC infetti e trasferirli in un tubo di citometria a flusso.
   2. Aggiungere 1 mL di salina con buffer fosfato (PBS) e centrifugare a 400 x g per 5 min.
   3. Scartare il supernatante e aggiungere 50 L di PBS contenente 1 OL L di Aqua live/dead dye (precedentemente diluito 1:10 con PBS).
   4. Incubare a 4 gradi centigradi per 15 min.
   5. Aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare a 400 x g per 5 min, e scartare supernatante.
   6. Aggiungere 250 -L di soluzione di fissaggio/permeabilizzazione e incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.
   7. Aggiungere 1 mL di 1x Perm/Wash Buffer (10x soluzione di stock contenente sia FBS che saponindi diluito 1:10) e centrifugare a 400 x g per 5 min.
   8. Eliminare il supernatante e aggiungere 50 - L di PBS contenente HIV Gag p24 fluoresceinisonina (FITC) -emigito anticorpo (diluito 1:10).
   9. Incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.
   10. Aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare a 400 x g per 5 min, e scartare il supernatante.
   11. Aggiungere 150 l di x CellFIX (soluzione di stock 10x contenente 10% formaldeide, 3,55% di metanolo, 0,93% acita di sodio diluito 1:10) e analizzare le cellule per citometria di flusso.

2. Stimolazione delle cellule T umane CD4 con anticorpi anti-CD3/CD28

1. Isolare le cellule T CD4 dai PBMC di pazienti affetti da HIV-1 e donatori sani.
2. Preparare il mix di anticorpi anti-CD3/CD28 umani diluindo anti-CD3 (1:100) e anti-CD28 (1:50) in PBS.
3. Coprire una piastra di 48 pozzetti aggiungendo 200 l'una di miscela di anticorpi per bene ad un numero adeguato di pozzi e incubare a 37 gradi centigradi per 2 h.
4. Aspirati la soluzione anticorpale e aggiungete 1 mL di cellule CD4-T a 1x10⁶/mL ai pozzetti anticorpi anti-CD3/CD28.
   NOTA: Stimolare le cellule T CD4 fino a 5 giorni.

3. Trascrizione inversa

NOTA: Per ottenere primer specifici del paziente, il DNA provirale isolato dalle cellule CD4-T di ogni paziente è stato amplificato utilizzando primer_{HIV-1 HXB2} Pan ASP. I primer specifici del paziente sono stati progettati utilizzando la sequenza provirale interna ai primer Pan ASP. Tutti i primer e le sonde utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella 2.

1. Isolamento dell'RNA totale dalle cellule
   1. Quantifica l'RNA ed elimina la contaminazione del DNA trattando i campioni con DNase.
   2. Eseguire reazioni DI RT in un volume di 50 .L. Trasferire 0,1-1 g di RNA totale in un numero appropriato di pozze di una piastra PCR 96-well. Preparare la miscela di RNA aggiungendo i seguenti componenti all'RNA:
      5 - L di primer inverso ASP biotinylato (20 M)
      2,5 l l di trefosdi deoxynucleotide (dNTP) (10 mM)
      25 -L di acqua distillata trattata con dietilpirocarburo (DEPC) (dH₂O).
      Preparare i controlli Endogeni RT aggiungendo 5 - L di acqua priva di nuclesiera al posto dell'innavorino inverso ASP biotinyato.
   3. Mettere la piastra PCR 96 po ' bene in un termociclore e riscaldare la miscela di RNA a 94 gradi centigradi per 5 min.
   4. Raffreddare immediatamente la miscela di RNA in acqua ghiacciata per almeno 1 min.
   5. Preparare la miscela di reazione aggiungendo i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL (calcolare il numero totale di campioni più 1):
      10 L di buffer 5x RT
      2,5 L di 0,1 M di 1,4-dithiothreitol (DTT)
      2,5 ll di RNase fuori (40 unità / l)
      2,5 l di enzima RT (200 unità/L)
   6. Trasferire 17,5 l di questa miscela in ciascuno dei pozzi contenenti RNA. Preparare i controlli RT-minus sostituendo la trascrizione inversa con 2,5 gradi di acqua priva di nuclea.
   7. Mescolare delicatamente e incubare la piastra a 55 gradi centigradi per 60 min utilizzando un termociclore.
   8. Inattivare le reazioni riscaldando a 70 gradi centigradi per 15 minuti.

4. Purificazione dell'affinità del cDNA biotinylato ASP

NOTA: non purificare le reazioni RT-meno.

1. Preparare 1 L di 2x buffer di lavaggio/associazione contenente 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM di acido etilenediaminetraetraacetica (EDTA) e 2 M NaCl. Filtrare la soluzione.
   1. Preparare 50 mL di 1x lavaggio/binding buffer utilizzando acqua di grado PCR.
   2. Per ogni reazione, utilizzare 10 L di perline magnetiche coniugate con streptavidin. In base al numero di reazioni, trasferire un volume appropriato di perline in un tubo da 1,5 mL.
   3. Lavare le perline aggiungendo un volume uguale di 2x lavaggio / rilegatura buffer e vortice per 15 s.
   4. Mettere il tubo in un rack di separazione magnetica e incubare per 3 min a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere con attenzione il supernatante senza disturbare le perline e aggiungere lo stesso volume di lavaggio / rilegatura buffer 2x come volume iniziale di perline.
   6. Vortice per 30 s e trasferire 10 gradi l delle sospensioni perline ad un numero appropriato di tubi da 1,5 mL.
   7. Mettere i tubi in un rack di separazione magnetica e incubare per 3 min a temperatura ambiente.
   8. Eliminare il supernatante e aggiungere 50 l di lavaggio/rilegatura buffer 2x.
   9. Aggiungere 50 -L di cDNA biotinylato ai tubi corrispondenti contenenti le perline.
   10. Incubare per 30 min a temperatura ambiente ruotando delicatamente.
   11. Separare le perline dal supernatante da un rack di separazione magnete per 3 min a temperatura ambiente.
   12. Lavare le perline aggiungendo 200 l un l di 1x lavaggio/ buffer di rilegatura. Mettere i tubi in un rack di separazione magnete per 3 min a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Ripetere due volte.
   13. Risospendere le perline in 10 gradi l di acqua di grado PCR.

5. PCR standard

NOTA: lo scopo della PCR standard è quello di amplificare l'intera ORF del gene ASP. I prodotti di amplificazione vengono poi clonati in pCR2.1 plasmide per sviluppare curve standard per la quantificazione dell'RNA ASP tramite PCR in tempo reale (vedi PCR in tempo reale del paragrafo).

1. Eseguire i PCR standard in un volume totale di 50 .L. Preparare un volume appropriato di mix master PCR (numero di campioni più 1). Per ogni campione, aggiungere i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL:
   1 - L di 10 M - Primer ASP (avanti e indietro)
   1 - L di 10 mm dNTP
   Cloruro di magnesio (MgCl₂₎(la concentrazione dipende dai primer utilizzati)
   dH₂O ad un volume finale di 49
   1. Mescolare bene, girare rapidamente verso il basso il contenuto e trasferire 49 l/poggia del mix master PCR a una piastra PCR 96-well.
   2. Vorticare con attenzione i tubi contenenti le perline utilizzate per la purificazione dell'affinità ASP cDNA per 15 s.
   3. Aggiungete 1 l di perline nei pozze corrispondenti ed eseguite la PCR utilizzando il seguente programma: 95 gradi centigradi per 2 min, 40 cicli di 95 gradi centigradi per 30 s, 55 gradi centigradi per 30 s e 68 gradi per 40 s, quindi 68 gradi centigradi per 7 min.
   4. Separare i prodotti PCR su gel di agarose dell'1%, tagliare le bande e clonare i prodotti amplificati in pCR2.1 plasmide.
   5. Sequenziare e analizzare le sequenze di ogni clone.

6. PCR quantitativo in tempo reale (qPCR)

NOTA: sviluppare primer e sonde specifiche per il paziente utilizzando l'approccio descritto nel passaggio 3 "Trascrizione inversa". Per qPCR includere diluizioni plasmide ASP per curve standard. Plasmidi contenenti inserti specifici per il paziente sono sviluppati come menzionato nella nota all'inizio del passaggio 5 "PCR standard".

1. Preparare la curva standard utilizzando diluizioni seriali plasmidASP 1:10 a partire da 3 x 10⁶ copie/L fino a 3 copie/L.
   1. PCR al primo round (preamplificatore). Eseguire reazioni in un volume totale di 25 . Per ogni campione, aggiungere i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL:
      0,5 l di ASP o env primer mix (concentrazione finale 0,2 m ciascuno) (avanti e indietro)
      0,5 l di miscela di dNTP (concentrazione finale 0,2 mM ciascuno)
      MgCl₂ (la concentrazione dipende dalle coppie di primer)
      dH₂O ad un volume finale di 24
   2. Trasferire 24 l di miscela master PCR su un numero appropriato di pozze di una piastra PCR da 96 pozze.
   3. Vorticare con cura i tubi contenenti le perline con il cDNA per 15 s.
   4. Aggiungere 1 ll di perline ai pozze corrispondenti. Fate lo stesso per le diluizioni plasmide.
   5. Eseguire la PCR utilizzando il seguente algoritmo: denaturazione per 2 min a 95 gradi centigradi; 30 s a 95 gradi centigradi, 30 s a 55 s, 40 s a 68 gradi centigradi per 18 cicli; estensione a 68 gradi centigradi per 7 min.
   6. Diluire i PCR del primo round reazioni 1:5 con acqua di grado PCR.
   7. Secondo round qPCR. Eseguire reazioni in un volume totale di 20 .L. Preparare un volume appropriato di miscela master PCR (numero di campioni più 1). Per ogni campione, aggiungere i seguenti componenti a un tubo da 1,5 mL:
      1,8 -l 10 M primer (avanti e indietro)
      1 l- di 5 sonda M
      6,2 ll di dH₂O
   8. Trasferire 19 l di qPCR master mix in un numero appropriato di pozze di una piastra qPCR 96-po'e aggiungere 1 -L delle reazioni PCR del primo round diluito ai pozzi corrispondenti. Fate lo stesso per le diluizioni del plasmide.
   9. Eseguire il qPCR con il seguente algoritmo: denaturazione per 10 min a 95 gradi centigradi; 15 s a 95 , 1 min a 60 gradi centigradi per 40 cicli.

Risultati

La denaturazione dell'RNA ad alta temperatura accoppiata alla purificazione dell'affinità del cDNA biotinylato previene l'amplificazione di prodotti ASP non specifici durante la PCR nei PBMC infettati in vitro e nelle cellule T CD4 isolate dai pazienti. È stato dimostrato che l'auto-priming RT si verifica durante la trascrizione inversa degli RNA antisenso^10,14,15,16,

Discussione

In questo rapporto viene descritto un saggio RT specifico del filamento applicato al rilevamento dell'RNA ASP nelle cellule T CD4, isolate da individui infettati dall'HIV-1. Il verificarsi di priming non specifico durante RT ostacola la rilevazione di trascrizioni dell'RNA con la polarità destra, portando a un'errata interpretazione dei risultati. I gruppi precedenti hanno sviluppato diverse strategie volte a prevenire la sintesi cDNA indipendente dal primer durante la reazione RT. Contrassegnare l'inversione all'estrem...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR II	Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4337450
dNTP Set (100 mM)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19052
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit	Becton Dickinson	554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC	Beckman Coulter	6604665
Human IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)	Sigma-Aldrich	61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	L34967
Mouse Anti-Human CD28	Becton Dickinson	55725
Mouse Anti-Human CD3	Becton Dickinson	55329
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin	BioConcept	4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	K450001
TURBO DNase (2 U/µL)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	AM2238
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4375786