JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

РНК шпильки и петли могут функционировать в качестве праймеров для обратной транскрипции (RT) в отсутствие последовательности конкретных грунтовки, вмешиваясь в изучение перекрывающихся антисмысловых стенограмм. Мы разработали метод, способный выявлять РНК, специфичную для прядей, и мы использовали ее для изучения антисмыслового белка ВИЧ-1 ASP.

Аннотация

В ретровирусах антисмысловая транскрипция была описана как в вирусе иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), так и в Т-лимфотропном вирусе человека 1 (HTLV-1). В ВИЧ-1, антисмыслового белка ASP ген расположен на отрицательной нити env, в кадре чтения -2, охватывающих соединение gp120/gp41. В смысле ориентации, 3' конец ASP открытой рамки чтения перекрывается с gp120 гиперпеременных регионов V4 и V5. Изучение АСП РНК было сорвано явление, известное как RT-само-первичности, в котором РНК вторичных структур имеют возможность премьер RT в отсутствие конкретных грунтовки, генерации неспецифических cDNAs. Комбинированное использование высокой денатурации РНК с биотинизатированными обратными грунтовками в реакции RT, а также очищение кДНК на стрептавидин-покрытие магнитных бусинов, позволило нам селективно усилить АСП РНК в CD4 "T-клеток, полученных от лиц, инфицированных ВИЧ-1. Наш метод относительно недорогой, простой в исполнении, очень надежный и легко воспроизводимый. В этом отношении он представляет собой мощный инструмент для изучения антисмысловой транскрипции не только в ВИЧ-1, но и в других биологических системах.

Введение

Антисмыслового белка (ASP) ген астровая рамка чтения (ORF) расположена на отрицательной нити вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) конверт (env) ген, охватывающий соединение gp120/gp411. За последние 30 лет, несколько докладов показали, что ген ВИЧ ASP действительно транскрибируется и переводится2,3,4,5,6,7,8,9. Хотя ASP антисмысл стенограммы были полностью охарактеризованы в пробирке, до недавнего времени информация о фактическом производстве ASP РНК у пациентов по-прежнему отсутствует.

Последовательность ASP обратная и дополняет env. Это представляет собой серьезное препятствие при попытке обнаружить транскрипты для ASP. Стандартные методы обратной транскрипции-полимеразы цепной реакции (RT-PCR) используют генно-специфические антисмысловые праймеры для синтеза дополнительных ДНС (cDNA) правильной полярности. Этот подход, однако, не позволяет определить ориентацию (чувство или антисмысл) первоначального шаблона РНК, так как РНК шпильки или петли могут премьер RT в обоих направлениях в отсутствие праймеров10, явление, известное как RT само-priming. Большинство следователей ASP обойти проблему RT самопремьера с помощью грунтовки помечены последовательностей, которые не связаны с ВИЧ-111,12. Эта стратегия, однако, не устраняет возникновение этого явления, и может привести к потенциальному переносу неспецифических CDNA в ПЦР11.

Недавно мы разработали новый strand-специфический RT-PCR исследование для изучения антисмысловой РНК, и мы использовали его для обнаружения ASP РНК в когорте из шести ВИЧ-инфицированных пациентов, как показано в таблице 1. Процедура, описанная ниже, была ранее опубликована Антонио Mancarella и др.13. В нашем протоколе мы избегаем производства неспецифических КДНС с помощью двойного подхода. Во-первых, мы устраняем РНК вторичных структур путем денатурации РНК при высокой температуре (94 градусов по Цельсию), а во-вторых, мы вспять транскрибирования АСП РНК с помощью биотиниляции ASP-специфической грунтовки и сродство-очистить результирующую кДНК. При таком подходе мы можем усилить только нашу целевую кДНК, так как другие неспецифические продукты RT либо предотвращаются от генерирования (высокая денатурация РНК), либо устраняются до ПЦР (очистка сродства).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Это исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Центра Госпитальер Университета Vaudois (CHUV).

1. Заражение периферических клеток крови (ПБМК) штаммом ВИЧ-1HXB2

  1. День 1: ПБМЦ СТИМУЛЯЦИЯ
    1. Изолировать PBMCs от здорового донора баффи пальто.
    2. Подсчитайте и resuspend PBMCs наконцентрации 1x10 6/mL в полном Roswell Park Мемориальный институт (RPMI) 1640 среда, содержащая 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллин/стрептомицин (R-10), с добавлением 50 U/mL интерлейкина-2 (IL-2) и 3 мкг/мл фитогемагглютинина (PHA).
    3. Pipet вверх и вниз и разделить клетки в двух шестиколодцных пластин (3 мл клеточной подвески / хорошо).
    4. Инкубировать в течение 3 дней при 37 градусах По цельсии и 5% CO2.
  2. День 3: ПБМЦ ИНФЕКЦИЯ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну из двух пластин, как в шаге 1.1.3 в качестве отрицательного контроля (не заражайте эти клетки).
    ВНИМАНИЕ: Выполните всю процедуру в лаборатории уровня биобезопасности III (P3).
    1. Бассейн PBMCs из одной пластины в 50 мл сокола трубки и центрифуги на 300 х г в течение 10 минут.
    2. Откажитесь от супернатанта и повторно отрепримите клетки в 2,2 мл R-10, содержащий 20 U/mL Ил-2 и 2 мкг/мл полибрена.
    3. Оттепель флаконы, содержащие вирус ВИЧ-1HXB2 и добавить 1,8 мл вирусной суспензии (0,376 нг / Л) в клетках.
    4. Инкубировать клетки в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия, аккуратно закрученного трубки каждые 30 минут.
    5. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 10 мин.
    6. Отбросьте супернатант и повторно отрепретируйте клетки при 1x106/млв R-10, содержащем IL-2 (50 U/mL).
    7. Перенесите суспензию клетки в 24-новартятину в концентрации 1 мл/колодец и инкубировать в течение 5 дней при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
    8. Урожай 1 хорошо каждый день и передать клетки 1,5 мл трубки (помечены с днем заражения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед центрифугией, передача 150 Л клеточной подвески в трубку цитометрии потока для контроля качества инфекции PBMCs (см. шаг 1.3)
    9. Центрифуга труб на 400 х г в течение 10 минут и отбросить супернатант.
    10. Заморозить клеточные гранулы при -80 градусов до использования.
  3. Инфекция ПБМК: контроль качества
    1. Для каждого дня инфекции, собирать 150 л инфицированных ПБМК и передать их в поток цитометрии трубки.
    2. Добавьте 1 мл фосфатно-буферного собела (PBS) и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин.
    3. Откажитесь от супернатанта и добавьте 50 л PBS, содержащего 1 зл и цвет живой/мертвый краситель Aqua (ранее разбавленный 1:10 с PBS).
    4. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
    5. Добавьте 1 мл PBS, центрифугу при 400 х г в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
    6. Добавьте 250 л раствора фиксации/пермяки и инкубацию в течение 20 минут при комнатной температуре в темное время суток.
    7. Добавьте 1 мл 1x Perm/Wash Buffer (10x стоковый раствор, содержащий как FBS, так и сапонин, разбавленный 1:10) и центрифугу на 400 х г в течение 5 мин.
    8. Откажитесь от супернатанта и добавьте 50 кЛ PBS, содержащий Фторесцен изотиокяна (FITC)-спряженные антитела (разбавленные 1:10).
    9. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.
    10. Добавьте 1 мл PBS, центрифугу при 400 х г в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
    11. Добавьте 150 кЛ х CellFIX (10x стоковый раствор, содержащий 10% формальдегид, 3,55% метанола, 0,93% азидеда натрия, разбавленного 1:10) и анализируйте клетки с помощью цитометрии потока.

2. Стимулирование человеческих CD4 'Т-клеток с анти-CD3/CD28 антител

  1. Изолировать CD4 " Т-клетки от ПБМК как ВИЧ-1 инфицированных пациентов и здоровых доноров.
  2. Подготовка человека анти-CD3/CD28 смесь антител путем разбавления анти-CD3 (1:100) и анти-CD28 (1:50) в PBS.
  3. Пальто 48-колодец пластины, добавив 200 л смеси антител на хорошо соответствующее количество скважин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на 2 ч.
  4. Аспирировать раствор антител и добавить 1 мл клеток CD4'T на 1x106/мл в анти-CD3/CD28 антитела покрытием скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулировать CD4 "Т-клетки до 5 дней.

3. Обратная транскрипция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения конкретных для пациентов грунтовки, провирусная ДНК, выделенная из клеток CD4'T от каждого пациента, была усилена с помощью праймеров ВИЧ-1HXB2 Pan ASP. Пациент конкретных грунтовки были разработаны с использованием провирусной последовательности внутренней Pan ASP грунтовки. Все грунтовки и зонды, используемые в этом исследовании, перечислены в таблице 2.

  1. Изолировать общую РНК из клеток
    1. Количественно РНК и устранить загрязнение ДНК путем обработки образцов с DNase.
    2. Выполните реакции RT в объеме 50 Л. Передача 0,1-1 мкг общей РНК в соответствующее количество скважин 96-колодской пластины ПЦР. Подготовка РНК смеси, добавив следующие компоненты в РНК:
      5 зЛ биотинители ASP реверсная грунтовка (20 мкм)
      2,5 л дезоксинуклеотидных трифосфатов (дНТП) (10 мМ)
      25 зл диэтилпирокарбоната (DEPC) обработанной дистиллированной воды (dH2O).
      Подготовьте эндогенные управления RT, добавив 5 кЛ безнужной воды вместо биотиниляции РЕверсивной грунтовки ASP.
    3. Поместите 96 хорошо ПЦР пластины в термоциклор и тепла РНК смеси до 94 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
    4. Немедленно охладить РНК смесь в ледяную воду, по крайней мере 1 мин.
    5. Подготовка реакционной смеси, добавив следующие компоненты в трубку 1,5 мл (вычислить общее количество образцов плюс 1):
      10 злиц 5x буфера RT
      2,5 л 0,1 М из 1,4-дитиотрейтол (DTT)
      2,5 л Из RNase из (40 единиц / Л)
      2,5 л фермента РТ (200 единиц/л)
    6. Перенесите 17,5 л этой смеси на каждую из РНК-содержащих скважин. Подготовьте контроль RT-minus, заменяющий обратную транскриптазу на 2,5 л без нуклеазной воды.
    7. Смешайте аккуратно и инкубировать пластину при 55 градусах По Цельсию в течение 60 минут с помощью термоциклора.
    8. Инактивируйте реакции при нагревании при 70 градусах по Цельсию в течение 15 мин.

4. Очистка аффинити аСП биотинилатированных кДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Не очищайте реакции RT-минус.

  1. Приготовьте 1 l 2x стирального/связывающего буфера, содержащего 10 мм Tris-HCl (pH 7.5), 1 мМ этилендениаминтететацетическая кислота (ЭДТА) и 2 M NaCl. Отфильтровать решение.
    1. Приготовьте 50 мл 1x стирального/связывающего буфера с использованием воды класса ПЦР.
    2. Для каждой реакции используйте 10 л стрептавидино-конъюгированных магнитных бусин. В зависимости от количества реакций, перенесите соответствующий объем бисера на трубку 1,5 мл.
    3. Вымойте бусины, добавив равный объем 2x стиральной / связывающей буфер и вихрь для 15 с.
    4. Поместите трубку в магнитную стойку разделения и инкубировать в течение 3 минут при комнатной температуре.
    5. Тщательно удалите супернатант, не нарушая бисера и добавить тот же объем стирки / связывания 2x буфера, как первоначальный объем бисера.
    6. Вихрь на 30 с и передача 10 л подвески бисера на соответствующее количество 1,5 мл труб.
    7. Поместите трубки в магнитной стойке разделения и инкубировать в течение 3 минут при комнатной температуре.
    8. Откажитесь от супернатанта и добавьте 50 зл стирки/связывающий 2x буфер.
    9. Добавьте 50 зл биотининатированных кДНК в соответствующие трубки, содержащие бусы.
    10. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, вращающейся мягко.
    11. Отделить бусы от супернатанта магнитом сепаратной стойки в течение 3 мин при комнатной температуре.
    12. Вымойте бусины, добавив 200 л 1x стиральной / связывающей буфер. Поместите трубки в стойку разделения магнита в течение 3 минут при комнатной температуре и отбросьте супернатант. Повторите дважды.
    13. Притязание бисера в 10 л воды класса ПЦР.

5. Стандартный ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель стандартного ПЦР состоит в том, чтобы усилить весь ORF гена ASP. Продукты усиления затем клонируются в плазмид pCR2.1 для разработки стандартных кривых для количественной оценки АСП РНК в режиме реального времени PCR (см. пункт в реальном времени PCR).

  1. Выполняйте стандартные ПЦР в общем объеме 50 ЗЛ. Подготовьте соответствующий объем мастер-микса ПЦР (количество образцов плюс 1). Для каждого образца добавьте следующие компоненты в трубку 1,5 мл:
    1 зл от 10 праймеров ASP (вперед и обратно)
    1 кл/л 10 мМ dNTPs
    Хлорид магния (MgCl2)(концентрация зависит от используемых грунтовок)
    dH2O до окончательного тома 49 Зл
    1. Хорошо перемешайте, быстро сверните содержимое и перенесите 49 Л/хорошо мастерской смеси ПЦР на 96-колодую пластину ПЦР.
    2. Тщательно вихрь трубки, содержащие бусы, используемые для ASP cDNA сродство очистки в течение 15 с.
    3. Добавьте в соответствующие скважины 1 градус шарика и запустите ПЦР с помощью следующей программы: 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин, 40 циклов 95 градусов по Цельсию на 30 с, 55 градусов по Цельсию за 30 с и 68 градусов по Цельсию на 40 с, затем 68 градусов по Цельсию в течение 7 мин.
    4. Разделите продукты ПЦР на 1% агарозного геля, разрежьте полосы и клоните усиленные продукты на плазмид pCR2.1.
    5. Секвенируйте и проанализируйте последовательности каждого клона.

6. В реальном времени количественный ПЦР (qPCR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Разработка конкретных для пациентов грунтовок и зондов с использованием подхода, описанного в шаге 3 "Обратная транскрипция". Для qPCR включите asP плазмидные разбавления для стандартных кривых. Плазмиды, содержащие вставки для конкретных пациентов, разрабатываются, как указано в примечании в начале шага 5 "Стандарт ПЦР".

  1. Подготовьте стандартную кривую с помощью 1:10 ASP плазмидных серийных разбавлений, начиная с 3 х 106 копий/КЛ до 3 копий/ЗЛ.
    1. Первый раунд ПЦР (предусилитель). Выполните реакции в общем объеме 25 ЗЛ. Подготовьте соответствующий объем мастер-микса ПЦР (количество образцов плюс 1). Для каждого образца добавьте следующие компоненты в трубку 1,5 мл:
      0,5 зл" смеси ASP или env primer (окончательная концентрация 0,2 мкм каждый) (вперед и наоборот)
      Смесь dNTPs 0,5 л (окончательная концентрация 0,2 мМ каждая)
      MgCl2 (концентрация зависит от пар грунтовки)
      dH2O до окончательного тома 24 Зл
    2. Передача 24 ЗЛ мастерской смеси ПЦР в соответствующее количество скважин 96-колодецной пластины ПЦР.
    3. Тщательно вихрь трубки, содержащие бусы с кДНК для 15 с.
    4. Добавьте в соответствующие скважины 1 л бусинок. Сделайте то же самое для плазмидных разбавлений.
    5. Выполнить ПЦР с помощью следующего алгоритма: денатурация в течение 2 мин при 95 градусах Цельсия; 30 с при 95 градусах Цельсия, 30 с при 55 градусах Цельсия, 40 с при 68 градусах по Цельсию в течение 18 циклов; расширение при 68 градусах по Цельсию в течение 7 мин.
    6. Разбавить реакции первого раунда ПЦП 1:5 водой класса ПЦР.
    7. Второй тур qPCR. Выполните реакции в общем объеме 20 ЗЛ. Подготовьте соответствующий объем мастер-микса ПЦР (количество образцов плюс 1). Для каждого образца добавьте следующие компоненты в трубку 1,5 мл:
      1,8 л 10 мкм праймеров (вперед и обратно)
      1 л из 5 зонда ММ
      6,2 л dH2O
    8. Передача 19 qPCR мастер-миксву в соответствующее количество скважин пластины qPCR 96 скважин и добавьте 1 зл и 1 л разбавленных реакций ПЦР первого раунда к соответствующим скважинам. Сделайте то же самое для плазмидных разбавлений.
    9. Выполнить qPCR со следующим алгоритмом: денатурация в течение 10 мин при 95 градусах Цельсия; 15 с при 95 градусах По кв.м,1 мин при 60 градусах по Цельсию в течение 40 циклов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Высокая температура ДНК-денатурации в сочетании с очищением сродства биотинизатной кДНК предотвращает усиление неспецифических продуктов ASP во время ПЦР в ПБМК, инфицированных в пробирке и в клетках CD4 'T, изолированных от пациентов. Было показано, что самоприящеество RT происходит...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом отчете мы описываем специфический rt-расса, применяемый к обнаружению АСП РНК в клетках CD4', изолированных от людей, инфицированных ВИЧ-1. Появление неспецифических грунтовок во время RT препятствует обнаружению РНК стенограммы с правом полярности, что приводит к неправильной инте?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Мы благодарим Патрицию Амелио, Алессандру Ното, Крейга Фенвика и Матье Перро за то, что они всегда были доступны для обсуждения нашей работы и всех людей в Лаборатории иммунопатогенеза СПИДа за их драгоценную техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить Джона и Аарона Уэддла из VSB Associated Inc., которые внесли свой вклад с отличными произведениями искусства. Наконец, большое спасибо всем пациентам, без которых эта работа была бы невозможна. Эта работа не получила никаких конкретных субсидий от какого-либо финансируемого учреждения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing KitApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Set (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation KitStemcell Technologies19052
Fetal Bovine SerumBiowestS1010-500
Fixation/Permeabilization Solution KitBecton Dickinson554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
Human IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Mouse Anti-Human CD28Becton Dickinson55725
Mouse Anti-Human CD3Becton Dickinson55329
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-StreptomycinBioConcept4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High FidelityInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polybrene Infection / Transfection ReagentSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cellsInvitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase (2 U/µL)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786

Ссылки

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74(2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71(2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38(2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221(2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153ASP1RT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены