Transcrições de RNA do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) em pacientes por RT-PCR específico

Resumo

Grampos de cabelo rna e loops podem funcionar como primers para transcrição reversa (RT) na ausência de primers específicos da seqüência, interferindo com o estudo de transcrições antisense sobrepostas. Desenvolvemos uma técnica capaz de identificar rna específico da cadeia, e nós o usamos para estudar a proteína antisense HIV-1 ASP.

Resumo

Em retrovírus, a transcrição antisense tem sido descrita tanto no vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) quanto no vírus tinfotrópico T humano 1 (HTLV-1). No HIV-1, o gene asp de proteína antisense está localizado na vertente negativa da vv, no quadro de leitura -2, abrangendo a junção gp120/gp41. Na orientação de sentido, o final de 3' do quadro de leitura aberta asp se sobrepõe com gp120 regiões hipervariáveis V4 e V5. O estudo do RNA ASP foi frustrado por um fenômeno conhecido como RT-auto-priming, em que as estruturas secundárias de RNA têm a capacidade de prime RT na ausência da cartilha específica, gerando cDNAs não específicos. O uso combinado de alta desnaturação de RNA com primers reversos biotinylated na reação rt, juntamente com a purificação de afinidade do cDNA em contas magnéticas revestidas de streptavidin, nos permitiu amplificar seletivamente RNA ASP em células T CD4 + derivadas de indivíduos infectados com HIV-1. Nosso método é relativamente de baixo custo, simples de executar, altamente confiável e facilmente reproduzível. A este respeito, representa uma ferramenta poderosa para o estudo da transcrição antisense não só no HIV-1, mas também em outros sistemas biológicos.

Introdução

O gene da proteína antisense (ASP) é um quadro de leitura aberto (ORF) localizado na cadeia negativa do gene do envelope tipo 1 (HIV-1) do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), abrangendo a junção gp120/gp41¹. Nos últimos 30 anos, vários relatos mostraram que o gene HIV ASP é de fato transcrito e traduzido^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Embora as transcrições antisense asp tenham sido totalmente caracterizadas in vitro, até recentemente, as informações sobre a produção real de RNA ASP em pacientes ainda estavam faltando.

A seqüência de ASP é reversa e complementar ao env. Isso representa um grande obstáculo ao tentar detectar transcrições para ASP. Os métodos padrão de reação em cadeia de transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) usam primers antisenso específicos do gene para sintetizar DNAs complementares (CDNAs) da polaridade certa. Esta abordagem, no entanto, não permite determinar a orientação (sentido ou antisenso) do modelo inicial de RNA, uma vez que grampos de cabelo rna ou loops podem prime RT em ambas as direções, na ausência de primers¹⁰, um fenômeno conhecido como RT auto-priming. A maioria dos investigadores ASP contornar o problema da RT auto-priming usando primers marcados com seqüências que não estão relacionadas com o HIV-1^11,12. Esta estratégia, no entanto, não elimina a ocorrência do fenômeno, e pode levar a potencial recarga de cDNAs não específicas para o PCR¹¹.

Recentemente desenvolvemos um novo ensaio RT-PCR específico da vertente para o estudo do RNA antisenso e o usamos para a detecção de RNA da ASP em uma coorte de seis pacientes infectados pelo HIV, como mostrado na Tabela 1. O procedimento descrito abaixo foi publicado anteriormente por Antonio Mancarella et al.¹³. Em nosso protocolo, evitamos a produção de CDNAs não específicos por uma abordagem dupla. Em primeiro lugar, eliminamos as estruturas secundárias de RNA desnatando rna a alta temperatura (94 °C) e, em segundo lugar, transcrevemos o RNA ASP usando uma cartilha específica de ASP biotinylated e purificam aafinidade do cDNA resultante. Por essa abordagem, somos capazes de amplificar apenas nosso cDNA alvo, uma vez que outros produtos RT não específicos são impedidos de serem gerados (desnaturação de alta temperatura de RNA) ou eliminados antes do PCR (purificação de afinidade).

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).

1. Infecção de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) com cepa_{HIV-1 HXB2}

1. Dia 1: ESTIMULAÇÃO PBMCs
   1. Isolar PBMCs de um casaco de buffy doador saudável.
   2. Conde e resuspenda PBMCs auma concentração de 1x10 6/mL em completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penic illilina/estreptomicina (R-10), com adição de 50 U/mL de interleucina-2 (IL-2) e 3 μg/mL fitohaemaglutinin (PHA).
   3. Pipet para cima e para baixo e dividir as células em duas placas de seis poços (3 mL de suspensão celular / bem).
   4. Incubar por 3 dias a 37 °C e 5% CO₂.
2. Dia 3: INFECÇÃO PBMCs
   NOTA: Use uma das duas placas como na etapa 1.1.3 como controle negativo (não infecte essas células).
   CUIDADO: Realize todo o procedimento em um laboratório de nível III de biossegurança (P3).
   1. Pbmcs piscina de uma placa em um tubo de falcão 50 mL e centrífuga em 300 x g para 10 min.
   2. Descarte o supernatant e resuspenda as células em 2,2 mL de R-10 contendo 20 U/mL de IL-2 e 2 μg/mL polibrene.
   3. Descongelar frascos contendo o vírus_{HIV-1 HXB2} e adicionar 1,8 mL de suspensão viral (0,376 ng/μL) para as células.
   4. Incubar as células por 2 h a 37 °C, rodando suavemente o tubo a cada 30 min.
   5. Centrífuga s as células a 300 x g por 10 min.
   6. Descarte o supernatant e resuspenda ascélulas em 1x10 6/mL em R-10 contendo IL-2 (50 U/mL).
   7. Transfira a suspensão celular para uma placa de 24 poços a uma concentração de 1 mL/bem e incubar por 5 dias a 37 °C e 5% DE_{CO 2.}
   8. Colher 1 bem a cada dia e transferir as células para tubo de 1,5 mL (rotulado com o dia da infecção).
      NOTA: Antes da centrifugação, transfira 150 μL de suspensão celular para um tubo de citometria de fluxo para controle de qualidade de infecção de PBMCs (ver passo 1.3)
   9. Centrífuga os tubos em 400 x g por 10 min e descartar o supernatant.
   10. Congele as pelotas celulares a -80 °C até o uso.
3. Infecção por PBMCs: controle de qualidade
   1. Para cada dia de infecção, coletar 150 μL de PBMCs infectados e transferi-los para um tubo de citometria de fluxo.
   2. Adicione 1 mL de sostelo tampão de fosfato (PBS) e centrífuga a 400 x g por 5 min.
   3. Descarte o supernatant e adicione 50 μL de PBS contendo 1 μL de Aqua corante vivo/morto (previamente diluído 1:10 com PBS).
   4. Incubar a 4 °C por 15 min.
   5. Adicione 1 mL de PBS, centrífuga a 400 x g por 5 min, e descartar supernatant.
   6. Adicione 250 μL de solução de fixação/permeabilização e incubapor por 20 min à temperatura ambiente no escuro.
   7. Adicione 1 mL de 1x Perm/Wash Buffer (solução de estoque 10x contendo FBS e saponina diluída 1:10) e centrífuga a 400 x g por 5 min.
   8. Descarte o anticorpo supernatant e adicione 50 μL de PBS contendo HIV Gag p24 fluoesceinisanisocianana (FITC) -anticorpo conjugado (diluído 1:10).
   9. Incubar por 20 min à temperatura ambiente no escuro.
   10. Adicione 1 mL de PBS, centrífuga a 400 x g por 5 min, e descartar o supernatant.
   11. Adicione 150 μL de x CellFIX (solução de estoque 10x contendo formaldeído de 10%, 3,55% metanol, 0,93% de azida de sódio diluído 1:10) e analise as células por citometria de fluxo.

2. Estimulação de células T CD4+ humanas com anticorpos anti-CD3/CD28

1. Isolar as células T CD4+ de PBMCs de pacientes infectados pelo HIV-1 e doadores saudáveis.
2. Prepare a mistura humana do anticorpo anti-CD3/CD28 diluindo o anti-CD3 (1:100) e o anti-CD28 (1:50) em PBS.
3. Cubra uma placa de 48 poços adicionando 200 μL de mistura de anticorpos por poço a um número adequado de poços e incubar a 37 °C por 2 h.
4. Assaa a solução de anticorpos e adicione 1 mLde células CD4+T em 1x10 6/mL aos poços anti-CD3/CD28 revestidos de anticorpos.
   NOTA: Estimule as células T CD4+ até 5 dias.

3. Transcrição reversa

NOTA: Para obter primers específicos do paciente, o DNA proviral isolado das células CD4+T de cada paciente foi amplificado usando primers HIV-1_HXB2 Pan ASP. Primers específicos do paciente foram projetados usando a seqüência proviral interna para os primers Pan ASP. Todas as cartetas e sondas utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 2.

1. Isolando o RNA total das células
   1. Quantifique o RNA e elimine a contaminação do DNA tratando amostras com DNase.
   2. Realize reações de RT em um volume de 50 μL. Transferência de 0,1-1 μg de RNA total para um número apropriado de poços de uma placa PCR de 96 poços. Prepare a mistura de RNA adicionando os seguintes componentes ao RNA:
      5 μL de primer reverso asp biotinylated (20 μM)
      2,5 μL de triphosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs) (10 mM)
      25 μL de água destilada tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) (dH₂O).
      Prepare os controles de RT endógenos adicionando 5 μL de água livre de nuclease no lugar da cartilha reversa asp biotinylated.
   3. Coloque a placa PCR de 96 poços em um termocicloe e aqueça a mistura de RNA a 94 °C por 5 min.
   4. Resfrie imediatamente a mistura de RNA em água gelada por pelo menos 1 min.
   5. Prepare a mistura de reação adicionando os seguintes componentes a um tubo de 1,5 mL (calcule o número total de amostras mais 1):
      10 μL de 5x buffer RT
      2,5 μL de 0,1 M de 1,4-dithiothreitol (DTT)
      2,5 μL de RNase fora (40 unidades/μL)
      2,5 μL de enzima RT (200 unidades/μL)
   6. Transfira 17,5 μL desta mistura para cada um dos poços contendo RNA. Prepare os controles RT-menos substituindo a transcriptase reversa por 2,5 μL de água livre de nuclease.
   7. Misture suavemente e incubar a placa em 55 °C para 60 min usando um termociclor.
   8. Inativar as reações aquecendo a 70 °C por 15 min.

4. Purificação de afinidade de cDNA biotinylado asp

NOTA: Não purifique as reações RT-menos.

1. Prepare 1 L de 2x de lavagem /tampão de ligação contendo 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM etilediásticaácidos (EDTA) e 2 M NaCl. Filtrar a solução.
   1. Prepare 50 mL de lavagem 1x / tampão de ligação usando água de grau PCR.
   2. Para cada reação, use 10 μL de contas magnéticas conjugadas por streptavidin. Com base no número de reações, transfira um volume apropriado de contas para um tubo de 1,5 mL.
   3. Lave as contas, adicionando um volume igual de 2x de lavagem / tampão de ligação e vórtice para 15 s.
   4. Coloque o tubo em um rack de separação magnética e incubar por 3 min à temperatura ambiente.
   5. Retire cuidadosamente o supernatant sem perturbar as contas e adicione o mesmo volume de lavagem / ligação 2x buffer como o volume inicial de contas.
   6. Vortex para 30 s e transferir 10 μL da suspensão de contas para um número adequado de tubos de 1,5 mL.
   7. Coloque os tubos em um rack de separação magnética e incubar por 3 min à temperatura ambiente.
   8. Descarte o supernatant e adicione 50 μL de lavagem / ligação 2x buffer.
   9. Adicione 50 μL de cDNA biotinylated aos tubos correspondentes que contêm os grânulos.
   10. Incubar por 30 min à temperatura ambiente girando suavemente.
   11. Separe os grânulos do supernatant por uma cremalheira da separação do ímã para 3 min na temperatura ambiente.
   12. Lave as contas adicionando 200 μL de 1x de lavagem / tampão de ligação. Coloque os tubos em um rack de separação ímã por 3 min à temperatura ambiente e descartar o supernatant. Repita duas vezes.
   13. Resuspenda as contas em 10 μL de água de grau PCR.

5. PCR padrão

NOTA: O objetivo do PCR padrão é amplificar todo o ORF do gene ASP. Os produtos de amplificação são então clonados em plasmídeo pCR2.1 para desenvolver curvas padrão para quantificação de RNA ASP por PCR em tempo real (ver parágrafo PCR em tempo real).

1. Executar PCRs padrão em um volume total de 50 μL. Prepare um volume apropriado de mix mestre pcr (número de amostras mais 1). Para cada amostra, adicione os seguintes componentes a um tubo de 1,5 mL:
   1 μL de 10 primers ASP μM (frente e inverso)
   1 μL de 10 mM dNTPs
   Cloreto de magnésio (MgCl₂₎(concentração depende das cartilhas utilizadas)
   dH₂O a um volume final de 49 μL
   1. Misture bem, rapidamente girar para baixo o conteúdo e transferir 49 μL / bem da mistura mestre PCR para uma placa PCR 96-bem.
   2. Cuidadosamente vórtice os tubos contendo as contas utilizadas para purificação de afinidade CDNA ASP para 15 s.
   3. Adicione 1 μL de contas nos poços correspondentes e execute o PCR usando o seguinte programa: 95 °C por 2 min, 40 ciclos de 95 °C para 30 s, 55 °C para 30 s e 68 °C para 40 s, em seguida, 68 °C por 7 min.
   4. Separe os produtos PCR em 1% de gel agarose, corte as bandas e clonhe os produtos amplificados em plasmídeos pCR2.1.
   5. Sequenciar e analisar as seqüências de cada clone.

6. Pcr quantitativo em tempo real (qPCR)

NOTA: Desenvolver primers específicos do paciente e sondas usando a abordagem descrita na etapa 3 "Transcrição reversa". Para qPCR incluem diluições plasmid ASP para curvas padrão. Plasms contendo inserções específicas do paciente são desenvolvidos como mencionado na nota no início da etapa 5 "PcR padrão".

1. Prepare a curva padrão usando diluições em série de 1:10 ASP plasmid a partir de 3 x 10⁶ cópias/μL até 3 cópias/μL.
   1. PCR da primeira rodada (pré-amplificador). Realize reações em um volume total de 25 μL. Prepare um volume apropriado de mix mestre de PCR (número de amostras mais 1). Para cada amostra, adicione os seguintes componentes a um tubo de 1,5 mL:
      0,5 μL de ASP ou mix de primer vv (concentração final 0,2 μM cada) (para a frente e para trás)
      0,5 μL de dNTPs mix (concentração final 0,2 mM cada)
      MgCl₂ (concentração depende dos pares primer)
      dH₂O a um volume final de 24 μL
   2. Transfira 24 μL de mix mestre PCR para um número apropriado de poços de uma placa PCR de 96 poços.
   3. Cuidadosamente vórtice os tubos contendo as contas com o cDNA para 15 s.
   4. Adicione 1 μL de contas aos poços correspondentes. Faça o mesmo para diluições plasmídeos.
   5. Executar o PCR usando o seguinte algoritmo: desnaturação por 2 min a 95 °C ; 30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C, 40 s a 68 °C por 18 ciclos; extensão em 68 °C por 7 min.
   6. Diluir as reações pcrs primeira rodada 1:5 com água de grau PCR.
   7. Segunda rodada qPCR. Realize reações em um volume total de 20 μL. Prepare um volume apropriado de mix mestre de PCR (número de amostras mais 1). Para cada amostra, adicione os seguintes componentes a um tubo de 1,5 mL:
      1,8 μL 10 μM primers (frente e inverso)
      1 μL de 5 μM sonda
      6,2 μL de dH₂O
   8. Transfira 19 μL de mix mestre qPCR em um número apropriado de poços de uma placa qPCR de 96 poços e adicione 1 μL das reações diluídas de PCR da primeira rodada aos poços correspondentes. Faça o mesmo para as diluições plasmídeos.
   9. Executar o qPCR com o seguinte algoritmo: desnaturação de 10 min a 95 °C; 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C por 40 ciclos.

Resultados

Desnaturação de RNA de alta temperatura juntamente com a purificação de afinidade de cDNA biotinylated impede a amplificação de produtos ASP não específicos durante PCR em PBMCs infectados in vitro e em células T CD4+ isoladas dos pacientes. Rt auto-priming tem sido mostrado para ocorrer durante a transcrição reversa de RNAs antisense^{10,14,15,16,...}

Discussão

Neste relatório descrevemos um ensaio rt específico da cadeia aplicado à detecção de RNA ASP em células T CD4+ isoladas de indivíduos infectados pelo HIV-1. A ocorrência de escoramento não específico durante a RT dificulta a detecção de transcrições de RNA com a polaridade certa, levando à má interpretação dos resultados. Grupos anteriores desenvolveram várias estratégias destinadas a prevenir a síntese de CDNA independente durante a reação rt. Marcar a cartilha reversa no final do 3' com sequênci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR II	Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4337450
dNTP Set (100 mM)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19052
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit	Becton Dickinson	554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC	Beckman Coulter	6604665
Human IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)	Sigma-Aldrich	61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	L34967
Mouse Anti-Human CD28	Becton Dickinson	55725
Mouse Anti-Human CD3	Becton Dickinson	55329
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin	BioConcept	4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	K450001
TURBO DNase (2 U/µL)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	AM2238
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4375786