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요약

RNA 헤어핀 및 루프는 서열 특이적 프라이머가 없는 경우 역전사(RT)를 위한 프라이머로서 기능할 수 있으며, 중첩된 안티센스 전사체의 연구를 방해한다. 우리는 가닥 특정 RNA를 확인할 수 있는 기술을 개발했습니다, 우리는 HIV-1 안티센스 단백질 ASP를 공부하기 위하여 그것을 이용했습니다.

초록

레트로바이러스에서, 안티센스 전사는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 및 인간 T-림프성 바이러스 1(HTLV-1)에서 모두 기재되었다. HIV-1에서, 안티센스 단백질 ASP 유전자는 접합 gp120/gp41에 걸친 독서 프레임 -2에서 env의 부정적인 가닥에 위치한다. 감지 방향에서 ASP 오픈 판독 프레임의 3' 끝은 gp120 초가변 영역 V4 및 V5와 겹칩니다. ASP RNA의 연구는 RT 자기 프라이밍으로 알려진 현상에 의해 좌절되었습니다, 이에 의해 RNA 이차 구조는 특정 프라이머의 부재에서 RT를 프라임 할 수있는 능력을 가지고, 비 특이적 cDNAs를 생성. RT 반응에서 생체 티니화 역 프라이머와 높은 RNA 변성의 결합 된 사용, 함께 스트렙타비딘 코팅 자기 구슬에 cDNA의 친화도 정제와 함께, 우리는 선택적으로 HIV-1에 감염된 개인에서 파생 된 CD4 + T 세포에서 ASP RNA를 증폭 할 수 있습니다. 우리의 방법은 상대적으로 저렴하고, 수행하기 쉽고, 매우 신뢰할 수 있고, 쉽게 재현 할 수 있습니다. 이 점에서, 그것은 뿐만 아니라 HIV-1에서 뿐만 아니라 다른 생물 학적 시스템에서 안티 센스 전사의 연구에 대 한 강력한 도구를 나타냅니다.

서문

안티센스 단백질(ASP) 유전자는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 봉투(env) 유전자의 음성 가닥에 위치한 개방 판독 프레임(ORF)이며, 접합 gp120/gp411에걸쳐 있다. 지난 30 년 동안, 몇몇 보고는 HIV ASP 유전자가 실제로전사되고2,3,4,5,6,7,8,9, 번역된다는것을 보여주었습니다 . ASP 안티센스 전사체는 시험관 내에서완전히 특징지어졌지만, 최근까지 환자에서 ASP RNA의 실제 생산에 대한 정보는 여전히 누락되었다.

ASP의 시퀀스는 반전되고 상호 보완적이다. 이것은 ASP에 대한 성적 증명서를 검출하려고 할 때 주요 장애물을 나타냅니다. 표준 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 방법은 유전자 특이적 안티센스 프라이머를 사용하여 오른쪽 극성의 상보성 DNAs(cDNAs)를 합성합니다. 그러나 이러한 접근법은 초기 RNA 템플릿의 배향(감각 또는 안티센스)을 결정하는 것을 허용하지 않으며, RNA 헤어핀 또는 루프가프라이머(10)가없는 상태에서 양방향으로 RT를 프라임할 수 있기 때문에, RT 자체 프라이밍으로 알려진 현상이다. 대부분의 ASP 조사자들은 HIV-111,12와관련이 없는 시퀀스로 태그가 지정된 프라이머를 사용하여 RT 자체 프라이밍의 문제를 회피한다. 그러나 이러한 전략은 현상의 발생을 제거하지 않으며, 비특이적 cDNA를 PCR11로잠재적으로 이월시킬 수 있다.

우리는 최근에 안티센스 RNA의 연구 를 위한 새로운 가닥 특이적 RT-PCR 분석기를 개발하고 우리는 표 1에도시된 바와 같이 6명의 HIV 감염한 환자의 코호트에서 ASP RNA 검출을 위해 그것을 이용했습니다. 아래에 설명된 절차는 이전에 안토니오 만카렐라 외13에의해 출판되었습니다. 프로토콜에서는 이중 접근 방식으로 비특정 cDNA의 생산을 방지합니다. 첫째, 우리는 고온 (94 °C)에서 RNA를 분해하여 RNA 이차 구조를 제거하고, 둘째, 우리는 생체 별 ASP 특이적 프라이머를 사용하여 ASP RNA를 역전시키고 결과 cDNA를 정화합니다. 이 접근법에 의해, 우리는 다른 비특이적 RT 제품이 생성되는 것을 방지하거나 (RNA의 고온 변성) 또는 PCR (선호도 정제) 이전에 제거되기 때문에 우리의 목표 cDNA만 증폭할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 센터 병원 대학 Vaudois의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다 (CHUV).

1. HIV-1HXB2 균주를 가진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 감염

  1. 1일차: PBMC 자극
    1. 건강한 기증자 버피 코트에서 PBMC를 분리합니다.
    2. 전체 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니크를 포함하는 1640 배지에서 1x106/ mL의 농도로 PBMC를 카운트하고 다시 일시 중단하십시오. illin/연쇄상 구균 (R-10), 인터류핀-2 (IL-2) 및 3 μg/mL 피토헤마글루티닌 (PHA)의 50 U/mL를 첨가합니다.
    3. 양세포를 6웰 플레이트 2개(셀 서스펜션/웰 3mL)로 위아래로 피펫을 분리합니다.
    4. 37°C 및 5%CO2에서3일 동안 배양한다.
  2. 3일차: PBMC 감염
    참고: 1.1.3 단계에서와 같이 두 플레이트 중 하나를 음성 대조군으로 사용하십시오(이 세포를 감염시키지 마십시오).
    주의: 생체 안전 수준 III 실험실(P3)에서 전체 절차를 수행합니다.
    1. 한 접시에서 50 mL 팔콘 튜브와 원심 분리기를 300 x g에서 10 분 동안 풀.
    2. 상급체를 버리고 IL-2 의 20 U / mL 및 2 μg / mL 폴리브렌을 포함하는 R-10의 2.2 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.
    3. HIV-1HXB2 바이러스를 함유하는 바이알을 해동하고 세포에 1.8 mL의 바이러스 성 현탁액 (0.376 ng/μL)을 추가합니다.
    4. 37 °C에서 2 시간 동안 세포를 배양하고 30 분마다 튜브를 부드럽게 소용돌이치십시오.
    5. 세포를 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
    6. 상급체를 버리고 IL-2 (50 U /mL)를 포함하는 R-10에서 1x106/mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
    7. 세포 현탁액을 1 mL/well의 농도로 24웰 플레이트로 옮기고 37°C 및 5%CO2에서5일 동안 배양한다.
    8. 수확 1 잘 매일 과 전지 1.5 mL 튜브에 전송 (감염의 날로 표시).
      참고: 원심분리 전에, PBMC 감염 품질 관리를 위해 150 μL의 세포 현탁액을 유세포 측정 튜브로 옮기십시오(1.3단계 참조)
    9. 튜브를 400 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 상한체를 버립니다.
    10. 사용할 때까지 세포 펠릿을 -80°C에서 동결합니다.
  3. PBMC 감염: 품질 관리
    1. 감염의 매일, 감염된 PBMC의 150 μL를 수집하고 유세포 측정 튜브로 전송합니다.
    2. 인산염 완충 식염수 1mL(PBS)와 원심분리기를 400 x g에서 5분 동안 넣습니다.
    3. 상급물질을 버리고 아쿠아 라이브/죽은 염료 1μL을 함유한 PBS 50 μL을 추가합니다(이전에 는 PBS로 1:10 희석).
    4. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
    5. PBS 1mL, 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가하고 상급을 폐기합니다.
    6. 250 μL의 고정/퍼메아빌화 용액을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
    7. 1mL의 1mL(FBS와 사포닌을 모두 함유한 10x 스톡 용액)과 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가합니다.
    8. 상판액을 버리고 HIV 개그 p24 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC)-공액 항체(희석 1:10)를 함유하는 PBS의 50 μL을 첨가한다.
    9. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
    10. PBS 1mL, 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가하고 상급기를 버립니다.
    11. x CellFIX 150 μL (포름알데히드 10%, 메탄올 3.55%, 아지드 나트륨 희석 0.93% 1:10)를 넣고 유세포분석으로 세포를 분석합니다.

2. 항 CD3/CD28 항체를 가진 인간 CD4+ T 세포의 자극

  1. HIV-1 감염 환자와 건강한 기증자 모두의 PBMC에서 CD4+ T 세포를 분리하십시오.
  2. PBS에서 안티 CD3 (1:100) 및 안티 CD28 (1:50)을 희석하여 인간 항 CD3/CD28 항체 혼합을 준비합니다.
  3. 48-웰 플레이트를 적절한 수의 웰에 웰당 200 μL의 항체 혼합물을 첨가하고 2시간 동안 37°C에서 배양한다.
  4. 항체 용액을 흡인하고 1x10 6/mL에서 CD4+T 세포 1 mL을 항 CD3/CD28 항체 코팅 웰에 추가합니다.
    참고: CD4+ T 세포를 최대 5일까지 자극하십시오.

3. 역 전사

참고: 환자 특이적 프라이머를 얻기 위해, 각 환자로부터 CD4+T 세포로부터 분리된 프로바이러스 DNA를 HIV-1HXB2 팬 ASP 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 환자 특이프라이머는 팬 ASP 프라이머 내부에 프로바이러스 서열을 사용하여 설계되었다. 이 연구에 사용된 모든 프라이머및 프로브는 표 2에나열되어 있습니다.

  1. 세포에서 총 RNA를 분리
    1. RNA를 정량화하고 DNase로 샘플을 처리하여 DNA 오염을 제거합니다.
    2. 50 μL의 부피에서 RT 반응을 수행. 96 웰 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰로 총 RNA의 0.1-1 μg을 전송합니다. RNA에 다음 성분을 추가하여 RNA 혼합물을 준비합니다.
      5 μL의 생체측화 ASP 역프라이머 (20 μM)
      2.5 μL의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPs) (10 mM)
      25 μL의 디에틸피로카보네이트 (DEPC) 처리 된 증류수 (dH2O).
      생체생리화된 ASP 역프라이머 대신에 5 μL의 뉴클레아제 없는 물을 첨가하여 내인성 RT 대조군을 준비한다.
    3. 96웰 PCR 플레이트를 열사이클러에 넣고 RNA 혼합물을 94°C로 5분 동안 가열합니다.
    4. 즉시 적어도 1 분 동안 아이스 워터에서 RNA 혼합물을 식힙니다.
    5. 1.5 mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가하여 반응 혼합물을 준비하십시오 (총 샘플 개수와 1 을 계산하십시오).
      5x RT 버퍼의 10 μL
      2.5 μL 의 0.1 M 의 1,4-디티오트레이톨 (DTT)
      2.5 μL 의 RNase 아웃(40 단위/μL)
      RT 효소 2.5 μL (200 단위/μL)
    6. 이 혼합물의 17.5 μL을 RNA 함유 웰각각에 전달한다. 역전사를 2.5 μL의 뉴클레아제 없는 물로 대체하는 RT-마이너스 대조군을 준비한다.
    7. 부드럽게 혼합하고 열사이클러를 사용하여 60 분 동안 55 °C에서 플레이트를 배양.
    8. 70°C에서 15분 동안 가열하여 반응을 비활성화합니다.

4. ASP 생체 정제 cDNA의 친화력 정제

참고: RT-마이너스 반응을 정화하지 마십시오.

  1. 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 및 2 M NaCl을 포함하는 2x 세척 /결합 완충제 1 L을 준비합니다. 솔루션을 필터링합니다.
    1. PCR 등급의 물을 사용하여 1x 세척/결합 버퍼 50mL를 준비합니다.
    2. 각 반응에 대해 스트렙타비딘 접합자 비드 10 μL을 사용하십시오. 반응 의 수에 따라, 1.5 mL 튜브에 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다.
    3. 15s에 대한 2 x 세척 / 바인딩 버퍼와 소용돌이의 동일한 볼륨을 추가하여 구슬을 씻어.
    4. 튜브를 자기 분리 랙에 넣고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
    5. 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 상류를 제거하고 구슬의 초기 볼륨과 같은 세척 / 바인딩 2x 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    6. 30s에 대한 소용돌이 및 10 μL의 비드 현탁액을 적당한 수의 1.5 mL 튜브로 이송한다.
    7. 튜브를 자기 분리 랙에 놓고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
    8. 상급제는 버리고 세척/결합 2x 완충액 50 μL을 추가합니다.
    9. 비드를 포함하는 해당 튜브에 50 μL의 생체 티니레이트 cDNA를 추가합니다.
    10. 실온에서 30분 동안 배양하여 부드럽게 회전합니다.
    11. 상판에서 비드를 자석 분리 랙으로 실온에서 3분 동안 분리합니다.
    12. 1x 세척/결합 버퍼의 200 μL을 추가하여 구슬을 세척합니다. 튜브를 자석 분리 랙에 실온에서 3분 동안 놓고 상판을 버립니다. 두 번 반복합니다.
    13. PCR 등급의 물 10 μL에서 구슬을 다시 일시 중단합니다.

5. 표준 PCR

참고 : 표준 PCR의 목적은 ASP 유전자의 전체 ORF를 증폭하는 것입니다. 증폭 제품은 pCR2.1 플라스미드로 복제되어 실시간 PCR에 의한 ASP RNA 정량화를 위한 표준 곡선을 개발합니다(단락 실시간 PCR 참조).

  1. 총 부피 50 μL에서 표준 PCR을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다.
    1 μL 10 μM ASP 프라이머(전진 및 후진)
    1μL 의 10 mM dNTP
    염화 마그네슘 (MgCl2)(농도는 사용되는 프라이머에 따라 다름)
    dH2O에서 49 μL의 최종 부피
    1. 잘 혼합하고 신속하게 내용물 스핀다운하고 PCR 마스터 믹스의 49 μL/well을 96웰 PCR 플레이트로 옮김을 더합니다.
    2. ASP cDNA 친화도 정제에 사용되는 비드를 함유하는 튜브를 15초 동안 조심스럽게 소용돌이치게 한다.
    3. 해당 웰에 1 μL의 구슬을 추가하고 다음 프로그램을 사용하여 PCR을 실행합니다: 2분 동안 95°C, 30s의 경우 95°C의 40사이클, 30초의 경우 55°C, 40초의 경우 68°C, 68°C에서 7분 동안 실행합니다.
    4. PCR 제품을 1 % 아가로즈 젤에 분리하고 밴드를 자르고 증폭 된 제품을 pCR2.1 플라스미드로 복제하십시오.
    5. 각 클론의 시퀀스를 시퀀스 및 분석합니다.

6. 실시간 정량적 PCR (qPCR)

참고: 3단계 "역전사"에 기재된 접근법을 사용하여 환자 별 프라이머 및 프로브를 개발한다. qPCR의 경우 표준 곡선에 대한 ASP 플라스미드 희석을 포함합니다. 환자 특이적 인서트를 함유하는 플라스미드는 5단계 "표준 PCR"의 시작 부분에서 노트에 언급된 바와 같이 개발된다.

  1. 1:10 ASP 플라스미드 직렬 희석을 사용하여 표준 곡선을 3 x 106 복사/μL에서 3복사/μL까지 준비합니다.
    1. 첫 번째 라운드 PCR (프리 앰프). 총 부피 25 μL로 반응을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다.
      ASP 또는 env 프라이머 믹스 0.5 μL (최종 농도 0.2 μM 각) (전진 및 후진)
      0.5 μL 의 dNTPs 혼합 (최종 농도 0.2 mM 각)
      MgCl2 (농도는 프라이머 쌍에 따라 다름)
      dH2O에서24 μL의 최종 부피
    2. PCR 마스터 믹스의 24 μL을 96웰 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰로 전송합니다.
    3. 조심스럽게 15 s에 대한 cDNA와 구슬을 포함하는 튜브를 소용돌이.
    4. 해당 웰에 1 μL의 구슬을 추가합니다. 플라스미드 희석에 대해동일한 작업을 수행합니다.
    5. 다음 알고리즘을 사용하여 PCR을 실행 : 95 °C에서 2 분 동안 변성; 95°C에서 30s, 55°C에서 30s, 18사이클동안 68°C에서 40s; 68 °C에서 7 분 동안 연장하십시오.
    6. PCR 등급의 물로 1:5 의 첫 번째 라운드 PCR 반응을 희석합니다.
    7. 두 번째 라운드 qPCR. 총 부피 20 μL로 반응을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다.
      1.8 μL 10 μM 프라이머(전진 및 후진)
      1 μL 의 5 μM 프로브
      6.2 μL 의 dH2O
    8. 19 μL의 qPCR 마스터 믹스를 96웰 qPCR 플레이트의 적당한 수의 웰로 옮기고 희석된 1라운드 PCR 반응의 1 μL을 해당 웰에 첨가한다. 플라스미드 희석에 대해동일한 작업을 수행합니다.
    9. 다음 알고리즘으로 qPCR을 실행: 95°C에서 10분 동안 변성; 95°C에서 15s, 40 사이클동안 60°C에서 1분.

결과

생체 연화 cDNA의 친화도 정제에 결합 된 고온 RNA 변성은 체외 및 환자로부터 분리 된 CD4 + T 세포에서 감염된 PBMC에서 PCR 동안 비 특이적 ASP 제품의 증폭을 방지합니다. RT 셀프 프라이밍은 안티센스 RNAs10,14,15,16,17의역전사 중에 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 현상을...

토론

이 보고에서 우리는 HIV-1에 감염된 개별에게서 격리된 CD4+ T 세포에 있는 ASP RNA의 검출에 적용되는 가닥 특이적인 RT 분석방법을 기술합니다. RT 도중 비특이적인 프라이밍의 발생은 적당한 극성을 가진 RNA 전사체의 탐지를 방해하고, 결과의 오해로 이끌어 냅니다. 이전 그룹은 RT 반응 도중 프라이머 독립적인 cDNA 합성을 방지하기 위한 몇몇 전략을 개발했습니다. HIV와 관련이없는 서열로 3 '끝에서 ?...

공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

우리는 Patrizia Amelio, 알레산드라 노토, 크레이그 펜윅, 그리고 마티유 페로가 우리의 일과 에이즈 면역 요법 연구소의 모든 사람들에게 소중한 기술 지원을 위해 항상 토론할 수 있게 해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 훌륭한 작품에 기여 VSB 어소시에이트 Inc.에서 존과 아론 웨들 감사드립니다. 마지막으로, 이 일이 가능하지 않았을 모든 환자에게 특별한 감사를 드립니다. 이 작품은 어떤 자금 조달 기관에서 특정 보조금을받지 않았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing KitApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Set (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation KitStemcell Technologies19052
Fetal Bovine SerumBiowestS1010-500
Fixation/Permeabilization Solution KitBecton Dickinson554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
Human IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Mouse Anti-Human CD28Becton Dickinson55725
Mouse Anti-Human CD3Becton Dickinson55329
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-StreptomycinBioConcept4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High FidelityInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polybrene Infection / Transfection ReagentSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cellsInvitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase (2 U/µL)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786

참고문헌

  1. Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
  2. Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
  3. Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
  4. Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
  5. Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
  6. Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
  7. Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
  8. Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
  9. Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
  10. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
  11. Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
  12. Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
  13. Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
  14. Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
  15. Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
  16. Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
  17. Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
  18. Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).

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