Detección de transcripciones de ARN de proteína antisentido (VIH-1) de proteína antisentido (VIH-1) en pacientes por RT-PCR específico de Hebra

Resumen

Las horquillas y bucles de ARN pueden funcionar como imprimaciones para la transcripción inversa (RT) en ausencia de imprimaciones específicas de secuencia, interfiriendo con el estudio de transcripciones antisentido superpuestas. Hemos desarrollado una técnica capaz de identificar el ARN específico de las hebras, y lo hemos utilizado para estudiar la proteína antisentido VIH-1 ASP.

Resumen

En retrovirus, la transcripción del antisentido se ha descrito tanto en el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) como en el virus t-linfotrópico humano 1 (HTLV-1). En HIV-1, el gen ASP de proteína antisentido se encuentra en la cadena negativa de env, en el marco de lectura -2, que abarca la unión gp120/gp41. En la orientación del sentido, el extremo de 3' del marco de lectura abierto ASP se superpone con las regiones hipervariables gp120 V4 y V5. El estudio del ARN ASP se ha visto frustrado por un fenómeno conocido como RT-autocebado, por el que las estructuras secundarias de ARN tienen la capacidad de primar RT en ausencia de la imprimación específica, generando cDNAs no específicos. El uso combinado de alta desnaturalización de ARN con imprimaciones inversas biotiniadas en la reacción RT, junto con la purificación de afinidad del ADNc sobre cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina, nos ha permitido amplificar selectivamente el ARN ASP en células T CD4+ derivadas de individuos infectados con VIH-1. Nuestro método es relativamente bajo costo, fácil de realizar, altamente confiable y fácilmente reproducible. En este sentido, representa una poderosa herramienta para el estudio de la transcripción antisentido no sólo en el VIH-1, sino también en otros sistemas biológicos.

Introducción

El gen de la proteína antisentido (ASP) es un marco de lectura abierto (ORF) situado en la cadena negativa del gen de sobre de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), que abarca la unión gp120/gp41¹. En los últimos 30 años, varios informes han demostrado que el gen del VIH ASP es de hecho transcrito y traducido^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Aunque las transcripciones antisentido ASP se han caracterizado completamente in vitro,hasta hace poco faltaba información sobre la producción real de ARN ASP en pacientes.

La secuencia de ASP es inversa y complementaria a env. Esto representa un obstáculo importante al intentar detectar transcripciones para ASP. Los métodos estándar de reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) utilizan imprimaciones antisentidos específicas genéticas para sintetizar los ADN complementarios (CNNAs) de la polaridad derecha. Este enfoque, sin embargo, no permite determinar la orientación (sentido o antisentido) de la plantilla inicial de ARN, ya que las horquillas o bucles de ARN pueden preparar RT en ambas direcciones en ausencia de imprimaciones^10,un fenómeno conocido como autocebado RT. La mayoría de los investigadores de ASP desvían el problema de la autocebación RT utilizando imprimaciones etiquetadas con secuencias que no están relacionadas con HIV-1^11,12. Esta estrategia, sin embargo, no elimina la ocurrencia del fenómeno, y puede conducir a la posible prórroga de los CDNa no específicos en el PCR¹¹.

Recientemente hemos desarrollado un nuevo ensayo RT-PCR específico de hebra para el estudio del ARN antisentido y lo hemos utilizado para la detección de ARN ASP en una cohorte de seis pacientes infectados por el VIH, como se muestra en la Tabla 1. El procedimiento descrito a continuación ha sido publicado previamente por Antonio Mancarella et al.¹³. En nuestro protocolo, evitamos la producción de CDNA no específicos mediante un enfoque dual. En primer lugar, eliminamos las estructuras secundarias de ARN desnaturalizando el ARN a alta temperatura (94 oC) y, en segundo lugar, invertimos el ARN ASP mediante una imprimación biotinilada específica de ASP y purificamos la afinidad del ADNC resultante. Con este enfoque, somos capaces de amplificar sólo nuestro ADNc objetivo, ya que se impide que otros productos RT no específicos se generen (desnaturalización a alta temperatura del ARN) o se eliminen antes de la PCR (purificación de afinidad).

Protocolo

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Hospitalario Universitario Vaudois (CHUV).

1. Infección de células mononucleares de sangre periférica (PPBCM) con cepa_{VIH-1 HXB2}

1. Día 1: ESTIMULACION DE PBMCs
   1. Aísle los PBL de un abrigo buffy de donante saludable.
   2. Contar y resuspender pbMUCs a una concentración de 1x10⁶/ml en el medio completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (R-10), con adición de 50 U/ml de interleucina-2 (IL-2) y 3-g/mL fitohahina(PHAglutin).
   3. Pipet hacia arriba y hacia abajo y divida las células en dos placas de seis pocillos (3 ml de suspensión/pozo de la célula).
   4. Incubar durante 3 días a 37oC y 5% CO₂.
2. Día 3: INFECCIÓN POR PBMCs
   NOTA: Utilice una de las dos placas como en el paso 1.1.3 como control negativo (no infecte estas células).
   ADVERTENCIA: Realizar todo el procedimiento en un laboratorio de nivel III de bioseguridad (P3).
   1. Piscina PBMCs de una placa en un tubo de halcón de 50 ml y centrífuga a 300 x g durante 10 min.
   2. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 2,2 ml de R-10 que contengan 20 U/ml de IL-2 y 2 g/ml de polibreno.
   3. Viales de descongelación que contengan el virus_{VIH-1 HXB2} y añada 1,8 ml de suspensión viral (0,376 ng/L) a las células.
   4. Incubar las células durante 2 h a 37 oC, girando suavemente el tubo cada 30 minutos.
   5. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min.
   6. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células a 1x10⁶/mL en R-10 que contiene IL-2 (50 U/mL).
   7. Transfiera la suspensión celular a una placa de 24 pocillos a una concentración de 1 ml/pozo e incubar durante 5 días a 37oC y 5%_CO2.
   8. Cosecha 1 pozo cada día y transfiere las células al tubo de 1,5 ml (etiquetado con el día de la infección).
      NOTA: Antes de la centrifugación, transfiera 150 ml de suspensión celular a un tubo de citometría de flujo para el control de calidad de la infección por PMAC (ver paso 1.3)
   9. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.
   10. Congele los gránulos celulares a -80 oC hasta su uso.
3. Infección por PBMCs: control de calidad
   1. Para cada día de infección, recoja 150 ml de PHC infectados y transfiéralos a un tubo de citometría de flujo.
   2. Añadir 1 ml de solución salina con fosfato (PBS) y centrífuga a 400 x g durante 5 min.
   3. Deseche el sobrenadante y agregue 50 ml de PBS que contenga 1 l de tinte vivo/muerto Aqua (previamente diluido 1:10 con PBS).
   4. Incubar a 4oC durante 15 min.
   5. Añadir 1 ml de PBS, centrífuga a 400 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante.
   6. Añadir 250 s de solución de fijación/permeabilización e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
   7. Añadir 1 ml de 1x Tampón Perm/Lavado (10x solución en stock que contenga FBS y saponina diluida 1:10) y centrifugar a 400 x g durante 5 min.
   8. Deseche el sobrenadante y agregue 50 l de PBS que contenga el anticuerpo conjugado conistiocianato de fluoresceína (FITC) conoceinato (FITC) conocuente de HIV Gag p24.
   9. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   10. Añadir 1 ml de PBS, centrífuga a 400 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante.
   11. Añadir 150 l de x CellFIX (solución de stock 10x que contiene 10% formaldehído, 3,55% metanol, 0,93% azida sódica diluida 1:10) y analizar las células por citometría de flujo.

2. Estimulación de células T CD4+ humanas con anticuerpos anti-CD3/CD28

1. Aísle los glóbulos T CD4+ de los PPC de pacientes infectados por el VIH-1 y donantes sanos.
2. Preparar la mezcla de anticuerpos humanos anti-CD3/CD28 diluyendo anti-CD3 (1:100) y anti-CD28 (1:50) en PBS.
3. Recubrir una placa de 48 pocillos añadiendo 200 ml de mezcla de anticuerpos por pocto a un número adecuado de pozos e incubar a 37 oC durante 2 horas.
4. Aspirar la solución de anticuerpos y añadir 1 ml de células CD4+T a 1x10⁶/mL a los pozos recubiertos con anticuerpos anti-CD3/CD28.
   NOTA: Estimule las células T CD4+ hasta 5 días.

3. Transcripción inversa

NOTA: Para obtener imprimaciones específicas del paciente, el ADN proviral aislado de las células CD4+T de cada paciente se amplificabó utilizando imprimaciones VIH-1_HXB2 Pan ASP. Las imprimaciones específicas del paciente se diseñaron utilizando la secuencia proviral interna de las imprimaciones Pan ASP. Todas las imprimaciones y sondas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 2.

1. Aislar el ARN total de las células
   1. Cuantifique el ARN y elimine la contaminación del ADN mediante el tratamiento de muestras con DNase.
   2. Realizar reacciones RT en un volumen de 50 l. Transfiera 0,1-1 ág de ARN total a un número apropiado de pozos de una placa PCR de 96 pocillos. Prepare la mezcla de ARN añadiendo los siguientes componentes al ARN:
      5 l de imprimación inversa ASP biotinylatada (20 m)
      2,5 l de trifosfatos de desoxinucleótido (dNTP) (10 mM)
      25 l de agua destilada tratada con dietlpirpirinato (DEPC) (dH₂O).
      Preparar los controles ENDógenos de RT añadiendo 5 l de agua libre de nucleasas en lugar de la imprimación inversa ASP biotinilada.
   3. Coloque la placa PCR de 96 pocillos en un termociclador y caliente la mezcla de ARN a 94 oC durante 5 min.
   4. Enfriar inmediatamente la mezcla de ARN en agua helada durante al menos 1 min.
   5. Prepare la mezcla de reacción añadiendo los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml (calcule el número total de muestras más 1):
      10 l de búfer RT de 5x
      2,5 l de 0,1 M de 1,4 ditiothreitol (TDT)
      2,5 l de RNase (40 unidades/L)
      2,5 l de enzima RT (200 unidades/L)
   6. Transfiera 17,5 l de esta mezcla a cada uno de los pozos que contienen ARN. Prepare los controles RT-menos reemplazando la transcriptasa inversa por 2,5 l de agua libre de nucleasas.
   7. Mezcle suavemente e incubar la placa a 55 oC durante 60 minutos utilizando un termociclador.
   8. Inactivar las reacciones calentando a 70oC durante 15 min.

4. Purificación de afinidad de ADNC biotinilado ASP

NOTA: No purifique las reacciones RT menos.

1. Preparar 1 L de 2tampón de lavado/unión que contenga 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y 2 M NaCl. Filtre la solución.
   1. Prepare 50 ml de 1 búfer de lavado/unión con agua de grado PCR.
   2. Para cada reacción, utilice 10 ml de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina. En función del número de reacciones, transfiera un volumen adecuado de perlas a un tubo de 1,5 ml.
   3. Lave las perlas añadiendo un volumen igual de 2x tampón de lavado/unión y vórtice durante 15 s.
   4. Coloque el tubo en un estante de separación magnética e incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   5. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas y agregue el mismo volumen de lavado/unión 2x tampón que el volumen inicial de cuentas.
   6. Vortex para 30 s y transferir 10 l de la suspensión de perlas a un número adecuado de tubos de 1,5 ml.
   7. Coloque los tubos en un estante de separación magnética e incubar durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   8. Deseche el sobrenadante y agregue 50 s de tampón 2x de lavado/unión.
   9. Añadir 50 l de ADNc biotinilado a los tubos correspondientes que contengan las perlas.
   10. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente girando suavemente.
   11. Separe las perlas del sobrenadante por un estante de separación de imán durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   12. Lave las perlas añadiendo 200 s de 1 tampón de lavado/unión. Coloque los tubos en un estante de separación de imanes durante 3 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Repita dos veces.
   13. Resuspenda las perlas en 10 l de agua de grado PCR.

5. PCR estándar

NOTA: El objetivo de la PCR estándar es amplificar todo el ORF del gen ASP. A continuación, los productos de amplificación se clonan en plásmido pCR2.1 para desarrollar curvas estándar para la cuantificación de ARN ASP mediante PCR en tiempo real (véase el párrafo PCR en tiempo real).

1. Realizar PCR estándar en un volumen total de 50 l. Preparar un volumen apropiado de mezcla maestra de PCR (número de muestras más 1). Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml:
   1 l de imprimaciones ASP de 10 m (adelante y atrás)
   1 L de 10 mM de dNtPs
   Cloruro de magnesio (MgCl₂) (la concentración depende de las imprimaciones utilizadas)
   dH₂O a un volumen final de 49 l
   1. Mezcle bien, gire rápidamente el contenido y transfiera 49 l/bien de la mezcla maestra de PCR a una placa PCR de 96 pocillos.
   2. Vórtice cuidadosamente los tubos que contienen las perlas utilizadas para la purificación de afinidad ASP cDNA para 15 s.
   3. Añadir 1 l de perlas en los pozos correspondientes y ejecutar la PCR utilizando el siguiente programa: 95 oC durante 2 min, 40 ciclos de 95 oC para 30 s, 55 oC para 30 s, y 68 oC para 40 s, luego 68 oC durante 7 min.
   4. Separe los productos pcR en un gel de agarosa del 1 %, corte las bandas y clone los productos amplificados en plásmido pCR2.1.
   5. Secuenciar y analizar las secuencias de cada clon.

6. PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR)

NOTA: Desarrolle imprimaciones y sondas específicas para cada paciente utilizando el enfoque descrito en el paso 3 "Transcripción inversa". Para qPCR incluir diluciones de plásmido ASP para curvas estándar. Los plásmidos que contienen plaquitas específicas para el paciente se desarrollan como se menciona en la nota al comienzo del paso 5 "PCR estándar".

1. Prepare la curva estándar utilizando diluciones seriales de plásmido 1:10 ASP a partir de 3 x 10⁶ copias/ l hasta 3 copias/ L.
   1. PCR de primera ronda (preamplificador). Realizar reacciones en un volumen total de 25 l. Preparar un volumen adecuado de mezcla maestra de PCR (número de muestras más 1). Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml:
      0,5 l de mezcla de imprimación DE ASP o env (concentración final de 0,2 m cada una) (adelante y atrás)
      0,5 l de mezcla de dNTP (concentración final 0,2 mM cada uno)
      MgCl₂ (la concentración depende de los pares de imprimación)
      dH₂O a un volumen final de 24 l
   2. Transfiera 24 l de mezcla maestra de PCR a un número adecuado de pozos de una placa PCR de 96 pocillos.
   3. Reórse cuidadosamente los tubos que contienen las perlas con el ADNc durante 15 s.
   4. Añadir 1 l de perlas a los pozos correspondientes. Haga lo mismo con las diluciones de plásmido.
   5. Ejecute el PCR utilizando el siguiente algoritmo: desnaturalización durante 2 min a 95 oC ; 30 s a 95oC, 30 s a 55oC, 40 s a 68oC para 18 ciclos; extensión a 68 oC durante 7 min.
   6. Diluir las reacciones de los PRIMEROS PCR 1:5 con agua de grado PCR.
   7. Segunda ronda qPCR. Realizar reacciones en un volumen total de 20 l. Preparar un volumen adecuado de mezcla maestra de PCR (número de muestras más 1). Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo de 1,5 ml:
      1.8 imprimaciones de 1,8 M 10 m (adelante y atrás)
      1 l de sonda de 5 m
      6,2 l de dH₂O
   8. Transfiera 19 l de mezcla maestra qPCR a un número apropiado de pozos de una placa qPCR de 96 pocillos y agregue 1 l de las reacciones de PCR de primera ronda diluidas a los pozos correspondientes. Haga lo mismo con las diluciones de plásmido.
   9. Ejecuta el qPCR con el siguiente algoritmo: desnaturalización durante 10 min a 95 oC; 15 s a 95oC, 1 min a 60oC durante 40 ciclos.

Resultados

La desnaturalización del ARN a alta temperatura acoplada a la purificación de afinidad de ADNc biotintilado evita la amplificación de productos ASP no específicos durante la PCR en PPBPc infectados in vitro y en células T CD4+ aisladas de pacientes. Se ha demostrado que el autocebado RT se produce durante la transcripción inversa de los ARN antisentido^10,14,15,16,

Discusión

En este informe describimos un ensayo RT específico de hebra aplicado a la detección de ARN ASP en células T CD4+ aisladas de individuos infectados con VIH-1. La aparición de cebado no específico durante RT dificulta la detección de transcripciones de ARN con la polaridad derecha, lo que lleva a una interpretación errónea de los resultados. Grupos anteriores han desarrollado varias estrategias destinadas a prevenir la síntesis de ADNc independiente de imprimación durante la reacción RT. Etiquetar la imprimaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR II	Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4337450
dNTP Set (100 mM)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19052
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit	Becton Dickinson	554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC	Beckman Coulter	6604665
Human IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)	Sigma-Aldrich	61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	L34967
Mouse Anti-Human CD28	Becton Dickinson	55725
Mouse Anti-Human CD3	Becton Dickinson	55329
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin	BioConcept	4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	K450001
TURBO DNase (2 U/µL)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	AM2238
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4375786