通过斯特兰德特异性RT-PCR检测患者人类免疫缺陷病毒类型1（HIV-1）反义蛋白（ASP）RNA转录本

摘要

在没有序列特异性引录的情况下，RNA发夹和环可作为逆转录（RT）的引种，干扰重叠反义转录本的研究。我们已经开发出一种能够识别股特异性RNA的技术，并用它来研究HIV-1反义蛋白ASP。

摘要

在逆转录病毒中，在人体免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和人类T-淋巴病毒1（HTLV-1）中都描述了反义转录。在HIV-1中，反义蛋白ASP基因位于env的负链上，在读帧-2中，跨越连接gp120/gp41。在感向上，ASP 开放读取帧的 3' 端与 gp120 超可变区域 V4 和 V5 重叠。ASP RNA的研究因一种称为RT自吸的现象而受阻，即RNA二级结构能够在没有特异性引物的情况下对RT进行质感，从而产生非特异性cDNA。在RT反应中结合高RNA变性与生物素化逆转引物，结合将cDNA亲和纯化到链球菌素涂层磁珠上，使我们能够选择性地扩增从HIV-1感染者中提取的CD4+T细胞中的ASP RNA。我们的方法成本相对较低，操作简单，可靠性高，易于重现。在这方面，它不仅在HIV-1中，而且在其他生物系统中，是研究反义转录的有力工具。

引言

反义蛋白（ASP）基因是一个开放阅读框架（ORF），位于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包络（env）基因的负链上，跨越结gp120/gp41^1。过去30年来，有多份报告显示，HIV ASP基因确实被转录和翻译了2，3，4，5，6，7，8，9。虽然ASP反义转录本在体外已经完全特征化，但直到最近，关于ASPRNA在患者中实际产生的信息仍然缺失。

ASP 的顺序是反向的，并且与 env 互补。这是尝试检测 ASP 脚本时的主要障碍。标准逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法使用基因特异性反义引物合成正确极性的互补DNA（cDNA）。然而，这种方法不允许确定初始RNA模板的方向（感觉或反义），因为RNA发夹或环可以在没有引^源10的情况下在两个方向上对RT进行素脚，这种现象称为RT自吸。大多数ASP调查员回避了RT自吸问题，使用带有与HIV-11、12无关的序列标记的引注。然而，这一战略并没有消除这一现象的发生，并可能导致非特异性cDNA可能^{带入PCR11。}

我们最近开发了一种用于反义RNA研究的新型股特异性RT-PCR测定，并用它来检测6名艾滋病毒感染者的ASPRNA，如表1所示。下面描述的程序以前曾由安东尼奥·曼卡雷拉等人^发表。在我们的协议中，我们避免通过双种方法生产非特定 cDNA。首先，我们在高温（94°C）下变性RNA来消除RNA二次结构;其次，我们使用生物素化ASP特异性底漆逆转转录ASPRNA，并亲和-纯化产生的cDNA。通过这种方法，我们能够仅扩增我们的目标cDNA，因为其他非特异性RT产品要么被阻止生成（RNA的高温变性），要么在PCR（亲和纯化）之前消除。

研究方案

这项研究得到了瓦多瓦大学中心医院机构审查委员会的批准。

1. 外周血单核细胞（PBMC）感染HIV-1_HXB2菌株

1. 第 1 天:PBMC STIMULATION
   1. 将 PBMC 从健康的捐赠者布漆中分离出。
   2. 在完整的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中，以1x10^6/mL的浓度计数和重新悬浮多溴联苯（PBMC），含有10%的胎儿牛血清（FBS）和1%的青霉素/链霉素（R-10），并加入50 U/mL的白素-2（IL-2）和3微克/mL植物海藻胶因（PHA）。
   3. 上下移管，将细胞分成两个六孔板（细胞悬浮液/孔3 mL）。
   4. 在37°C和5%CO₂下孵育3天。
2. 第3天:PBMC感染
   注: 使用步骤 1.1.3 中的两个板之一作为阴性对照（不要感染这些细胞）。
   注意:在生物安全 III 级实验室 （P3） 中执行整个过程。
   1. 将 PBMC 从一个板中放入 50 mL 猎鹰管中，以 300 x g的离心机进行 10 分钟。
   2. 丢弃上清液，在含有20 U/mL的IL-2和2μg/mL多宝醇的R-10中重新悬浮细胞。
   3. 解冻含有HIV-1_HXB2病毒的瓶，向细胞中加入1.8 mL的病毒悬浮液（0.376纳克/μL）。
   4. 在37°C下孵育细胞2小时，每30分钟轻轻旋转一次管。
   5. 使细胞在300 x g下离心10分钟。
   6. 丢弃上清液，在含有 IL-2 （50 U/mL） 的 R-10 中以 1x10⁶/mL 重新悬浮细胞。
   7. 将细胞悬浮液转移到浓度为1mL/孔的24孔板中，并在37°C和5%CO₂下孵育5天。
   8. 每天收获1口井，并将细胞转移到1.5 mL管（与感染当天标记）。
      注:离心前，将150μL细胞悬浮液转移到流式细胞测定管，用于PBMC感染质量控制（参见步骤1.3）
   9. 将管在 400 x g下离心 10 分钟，然后丢弃上清液。
   10. 将细胞颗粒冷冻至-80°C，直至使用。
3. PBMC 感染:质量控制
   1. 对于感染的每一天，收集150 μL的受感染PBMC，并将其转移到流式细胞测定管中。
   2. 加入1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS），在400 x g下离心5分钟。
   3. 丢弃上清液，加入含有1μLAqua活/死染料的PBS50μL（先前用PBS稀释1:10）。
   4. 在4°C孵育15分钟。
   5. 加入1mL的PBS，在400 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
   6. 加入250 μL的固定/渗透溶液，在黑暗中室温下孵育20分钟。
   7. 加入 1 mL 的 1x Perm/Wash 缓冲液（10x 库存溶液，含有 FBS 和皂苷稀释 1:10），并在 400 x g下离心 5 分钟。
   8. 丢弃上清液，加入含有HIV Gag p24氟辛异酸二醇（FITC）的PBS50 μL（稀释1:10）。
   9. 在黑暗中室温下孵育20分钟。
   10. 加入1mL的PBS，在400 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
   11. 加入150 μL的x CellFIX（含有10%甲醛的10倍库存溶液，3.55%甲醇，0.93%阿齐德钠稀释1:10），并通过流动细胞测定分析细胞。

2. 用抗CD3/CD28抗体刺激人类CD4+T细胞

1. 从HIV-1感染患者和健康捐赠者的PBMC中分离CD4+T细胞。
2. 通过稀释PBS中的抗CD3（1:100）和抗CD28（1:50），制备人体抗CD3/CD28抗体混合物。
3. 将每口井的抗体混合物加入适当数量的孔中，在 37°C 下孵育 2 小时，从而覆盖 48 孔板。
4. 在1x10⁶/mL处将1mL的CD4+T细胞吸出抗体溶液，加入抗CD3/CD28抗体涂层井。
   注:刺激CD4+T细胞长达5天。

3. 逆转录

注:为了获得患者特异性引体，使用HIV-1_HXB2泛ASP引体从每个患者的CD4+T细胞中分离出的病毒DNA被扩增。患者特定的引种是使用泛 ASP 引录内部的病毒序列设计的。本研究中使用的所有引注和探针都列在表2中。

1. 从细胞中分离总RNA
   1. 通过用DNase处理样品，量化RNA并消除DNA污染。
   2. 在50μL的体积中执行RT反应，将总RNA的0.1-1 μg转移到96孔PCR板的适当数量孔中。通过在RNA中加入以下成分来制备RNA混合物:
      5 μL 生物素酸酯 ASP 反向底漆 （20 μM）
      2.5 μL 脱氧核苷酸三磷酸盐 （dNTP） （10 mM）
      25 μL 二乙酰二甲酸酯 （DEPC） 处理的蒸馏水 （dH₂O）。
      通过添加5 μL无核酸酶水代替生物素酸酯ASP反向引物，制备内源性RT对照。
   3. 将 96 孔 PCR 板放入热循环器中，将 RNA 混合物加热至 94°C 5 分钟。
   4. 立即在冰水中冷却RNA混合物至少1分钟。
   5. 将以下组件添加到 1.5 mL 管中（计算样本总数加 1），制备反应混合物:
      10 μL 的 5x RT 缓冲器
      2.5 μL 的 0.1 M 的 1，4-二硫二醇 （DTT）
      2.5 μL RNase 出（40 个单位/μL）
      2.5 μL RT酶（200单位/μL）
   6. 将17.5μL的混合物转移到每个含RNA的井中。准备RT-减控制用2.5 μL无核酸酶水取代逆转录酶。
   7. 使用热循环器在 55°C 下轻轻混合并孵育板 60 分钟。
   8. 在70°C加热15分钟，使反应失去活性。

4. ASP生物素化cDNA的亲性纯化

注:请勿纯化RT-减反应。

1. 准备 1 L 的 2x 洗涤/结合缓冲液，包含 10 mM Tris-HCl （pH 7.5）、1 mM 乙烯二甲酸 （EDTA） 和 2 M NaCl。筛选解决方案。
   1. 使用 PCR 级水准备 50 mL 的 1x 洗涤/结合缓冲液。
   2. 对于每种反应，使用10μL的链球菌结合磁珠。根据反应次数，将适当的珠子体积转移到1.5 mL管中。
   3. 通过添加相等体积的 2x 洗涤/结合缓冲液和涡流 15 s 来清洗珠子。
   4. 将管子放入磁性分离架中，在室温下孵育3分钟。
   5. 小心地去除上清液，不要干扰珠子，并添加与珠子初始体积相同的洗涤/装订 2x 缓冲液。
   6. 涡旋30s，并将10μL的珠子悬浮液转移到适当数量的1.5 mL管中。
   7. 将管子放在磁性分离架中，在室温下孵育3分钟。
   8. 丢弃上清液，加入50 μL的洗涤/装订2x缓冲液。
   9. 将50μL的生物素乳酸cDNA加入含有珠子的相应管中。
   10. 在室温下轻轻旋转30分钟。
   11. 在室温下，用磁铁分离架将珠子与上清液分离3分钟。
   12. 通过加入 200 μL 的 1x 洗涤/结合缓冲液来清洗珠子。在室温下将管子放入磁铁分离架中 3 分钟，然后丢弃上清液。重复两次。
   13. 在 PCR 级水中重新悬浮 10 μL 的珠子。

5. 标准 PCR

注:标准PCR的目的是放大ASP基因的整个ORF。然后，将扩增产物克隆到pCR2.1质粒中，通过实时PCR为ASPRNA定量开发标准曲线（参见段落实时PCR）。

1. 在总体积为 50 μL 时执行标准 PCR。准备适当体积的 PCR 主混合物（样本数加 1）。对于每个样品，将以下组件添加到 1.5 mL 管中:
   1 μL 的 10 μM ASP 引漆（正向和反向）
   1 μL 10 mM dNTP
   氯化镁 （MgCl₂） （浓度取决于使用的引物）
   dH₂O 到 49 μL 的最终体积
   1. 混合良好，快速旋转内容物，并将 PCR 主混合物的 49 μL/孔传输到 96 孔 PCR 板。
   2. 小心地涡涡含有用于ASP cDNA亲和纯化的珠子的管子15s。
   3. 将1μL的珠子加入相应的井中，使用以下程序运行PCR:95°C2分钟，40个95°C循环，30秒，55°C30秒，68°C40秒，68°C7分钟。
   4. 将PCR产物分离到1%的甘蔗凝胶上，切割带，并将扩增产物克隆成pCR2.1质粒。
   5. 序列并分析每个克隆的序列。

6. 实时定量PCR（qPCR）

注:使用步骤3"逆转录法"中描述的方法开发患者特定的引信和探针。对于 qPCR，包括用于标准曲线的 ASP 质粒稀释。包含患者专用刀片的质粒，如步骤 5"标准 PCR"开头的说明中所述。

1. 使用 1:10 ASP 质粒序列稀释从 3 x 10⁶份/μL 到 3 个拷贝/μL 准备标准曲线。
   1. 第一轮 PCR（前置放大器）。在总体积为25μL时执行反应。准备适当体积的PCR主混合物（样本数加1）。对于每个样品，将以下组件添加到 1.5 mL 管中:
      0.5 μL ASP 或 env 引体混合物（最终浓度各 0.2 μM）（向前和反向）
      0.5 μL dNTP 混合物（最终浓度各 0.2 mM）
      MgCl_2（浓度取决于引物对）
      dH₂O 到 24 μL 的最终体积
   2. 将 24 μL 的 PCR 主混合物转移到 96 孔 PCR 板的适当数量的孔中。
   3. 小心地用cDNA涡旋含有珠子的管子15s。
   4. 向相应的井中加入 1 μL 的珠子。对质粒稀释也做同样的事。
   5. 使用以下算法运行 PCR:在 95°C 下变性 2 分钟;95°C 时为 30 s，55°C 为 30 s，在 68°C 下为 40 s，18 个周期为 40 s;在 68°C 下延长 7 分钟。
   6. 用 PCR 级水稀释第一轮 PCR 反应 1:5。
   7. 第二轮 qPCR。在总体积为20μL时执行反应。准备适当体积的PCR主混合物（样本数加1）。对于每个样品，将以下组件添加到 1.5 mL 管中:
      1.8 μL 10 μM 底漆（正向和反向）
      1 μL 5 μM 探头
      6.2 μL 的 dH₂O
   8. 将 19 μL 的 qPCR 主混合物转移到 96 孔 qPCR 板的适当数量的孔中，并将稀释的第一轮 PCR 反应的 1 μL 添加到相应的孔中。对质粒稀释也做同样的事。
   9. 使用以下算法运行 qPCR:在 95°C 下变性 10 分钟;95°C 时为 15 秒，在 60°C 下为 1 分钟，用于 40 个循环。

结果

高温RNA变性与生物素化cDNA的亲亲纯化相结合，可防止在体外感染的PBMC和从患者分离的CD4+T细胞中扩增非特异性ASP产物。RT自吸已证明发生在反义RNA10，14，15，16，17的逆转录过程中。为了防止这种现象，我们开发了一种新方法，使用最初由Heist^等人10描...

讨论

在本报告中，我们描述了一种链特异性RT测定，用于检测从HIV-1感染者中分离的CD4+T细胞中的ASPRNA。RT 期间发生非特异性吸注会妨碍具有正确极性的 RNA 转录本的检测，从而导致对结果的误解。以前的研究小组已经制定了几种策略，旨在防止在RT反应期间与引物无关的cDNA合成。在3'末端标记反向引种与与HIV无关的序列已被证明能有效地实现股特异性扩增6，8，9。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR II	Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4337450
dNTP Set (100 mM)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19052
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit	Becton Dickinson	554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC	Beckman Coulter	6604665
Human IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)	Sigma-Aldrich	61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	L34967
Mouse Anti-Human CD28	Becton Dickinson	55725
Mouse Anti-Human CD3	Becton Dickinson	55329
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin	BioConcept	4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	K450001
TURBO DNase (2 U/µL)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	AM2238
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4375786