Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA'yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP'yi incelemek için kullandık.
Retrovirüslerde antisense transkripsiyon hem insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) hem de insan T-lenfotropik virüs 1 (HTLV-1) olarak tanımlanmıştır. HIV-1'de antisense protein ASP geni env'nin negatif iplikçiküzerinde, -2 okuma çerçevesinde gp120/gp41 kavşaklarını kapsayan bir proteinde bulunur. Asp açık okuma çerçevesinin 3' ucu gp120 hiperdeğişken bölgeler V4 ve V5 ile örtüşmektedir. ASP RNA çalışması RT-self-priming olarak bilinen bir fenomen tarafından engellenmiştir, rna ikincil yapılar belirli astar yokluğunda RT asal yeteneğine sahip, spesifik olmayan CD'ler üreten. RT reaksiyonunda biyotinylated ters astarlar ile yüksek RNA denatürasyonu kombine kullanımı, streptavidin kaplı manyetik boncuküzerine cDNA afinite ile birlikte, bize seçici OLARAK CD4 ASP RNA yükseltmek için izin verdi + T hücreleri HIV-1 ile enfekte bireylerden türetilen. Yöntemimiz nispeten düşük maliyetli, gerçekleştirmek için basit, son derece güvenilir ve kolayca tekrarlanabilir. Bu bağlamda, sadece HIV-1'de değil, diğer biyolojik sistemlerde de antisense transkripsiyon çalışması için güçlü bir araçtır.
Antisense protein (ASP) geni, insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) zarf (env) geninin negatif iplikçik üzerinde bulunan açık okuma çerçevesi (ORF) olup, gp120/gp411kavşağına yayılan bir gendir. Son 30 yıl içinde, çeşitli raporlar HIV ASP geni gerçekten transkripsiyonu ve tercüme olduğunu göstermiştir2,3,4,5,6,7,8,9. ASP antisense transkriptler tamamen in vitrokarakterize olmasına rağmen , yakın zamana kadar hastalarda ASP RNA gerçek üretimi hakkında bilgi hala eksikti.
ASP dizisi ters ve env tamamlayıcıdır. Bu, ASP transkriptlerini algılamaya çalışırken büyük bir engel teşkil eder. Standart ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleri, doğru polaritenin tamamlayıcı NA'larını (cDNA'ları) sentezlemek için genlere özgü antisense astarlar kullanır. Ancak bu yaklaşım, rna saç tokaları veya döngüleri10astar yokluğunda her iki yönde de RT asal olabilir, rt kendini astar olarak bilinen bir fenomen, ilk RNA şablonunun yönünü (anlamda veya antisense) belirlemek için izin vermez. Çoğu ASP araştırmacıları HIV-111,12ile ilgili olmayan dizileri ile etiketlenmiş astarlar kullanarak RT kendini astar sorunu kenara . Ancak bu strateji, fenomenin oluşumunu ortadan kaldırmaz ve PCR11'espesifik olmayan CDNA'ların potansiyel olarak taşınmasına yol açabilir.
Yakın zamanda antisense RNA çalışması için yeni bir iplikçik özgü RT-PCR tayini geliştirdik ve Tablo 1'degösterildiği gibi, altı HIV enfekte hastanın bir kohort ASP RNA tespiti için kullandık. Aşağıda açıklanan prosedür daha önce Antonio Mancarella ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Protokolümüzde, spesifik olmayan CNA'ların çift yaklaşımla üretiminden kaçınıyoruz. İlk olarak, RNA'yı yüksek sıcaklıkta (94 °C) reddederek RNA ikincil yapılarını ortadan kaldırıyoruz ve ikinci olarak, biyotinylated ASP'ye özgü astar kullanarak ASP RNA'yı tersine çeviriyoruz ve elde edilen cDNA'yı arındırıyoruz. Bu yaklaşımla, spesifik olmayan diğer RT ürünlerinin üretilmesi (RNA'nın yüksek sıcaklık denatürasyonu) engellenmesi veya PCR (afinite arınma) öncesinde ortadan kaldırılması önlendiği için, sadece hedef cDNA'mızı yükseltebiliriz.
Bu çalışma, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Hiv-1HXB2 suşu ile periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMCs) enfeksiyonu
2. Anti-CD3/CD28 antikorları ile insan CD4+ T hücrelerinin uyarılması
3. Ters transkripsiyon
NOT: Hastaya özgü astarelde etmek için her hastadan CD4+T hücrelerinden izole edilen proviral DNA HIV-1HXB2 Pan ASP astarları kullanılarak güçlendirilmiştir. Hastaya özgü astarlar Pan ASP astarları için internal proviral dizi kullanılarak tasarlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan tüm astar ve problar Tablo 2'delistelenmiştir.
4. ASP biyotinylated cDNA affinity arıtma
NOT: RT eksi reaksiyonları arındırmayın.
5. Standart PCR
NOT: Standart PCR'nin amacı ASP geninin tüm ORF'sini yükseltmektir. Amplifikasyon ürünleri daha sonra gerçek zamanlı PCR ile ASP RNA nicelleştirme için standart eğriler geliştirmek için pCR2.1 plazmid içine klonlanır (paragraf gerçek zamanlı PCR bakınız).
6. Gerçek zamanlı nicel PCR (qPCR)
NOT: Adım 3 "Ters Transkripsiyon"da açıklanan yaklaşımı kullanarak hastaya özel astarlar ve problar geliştirin. QPCR için standart eğriler için ASP plazmid seyreltmeiçerir. Hastaya özgü kesici ler içeren plazmidler, 5.
Biyotinylated cDNA afinite ile birleştiğinde yüksek sıcaklık RNA denatürasyonu, pcr sırasında non-spesifik ASP ürünlerinin in vitro enfekte PCR ve hastalardan izole CD4 + T hücrelerinde amplifikasyon önler. RT kendini priming antisense RNA10ters transkripsiyon sırasında meydana gösterilmiştir10 ,14,15,16,17. Bu fenomeni önlemek için,...
Bu raporda, HIV-1 ile enfekte olan bireylerden izole cd4+ T hücrelerinde ASP RNA tespitine uygulanan iplikçik spesifik RT tayini açıklanmıştır. RT sırasında spesifik olmayan astar oluşumu, RNA transkriptlerinin doğru polarite ile saptanmasını engelleyerek sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açtı. Önceki gruplar RT reaksiyonu sırasında astar-bağımsız cDNA sentezini önlemeye yönelik çeşitli stratejiler geliştirmişlerdir. HIV ile ilgili olmayan dizileri ile 3 'sonunda ters astar etiketleme i...
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ediyorlar.
Biz Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick ve Matthieu Perreau her zaman bizim çalışma ve AIDS İmmünopatogenez Laboratuvarı'nda tüm insanlar değerli teknik yardım için tartışmak için kullanılabilir olduğu için teşekkür ederiz. Biz de John ve Aaron Weddle VSB Associated Inc kim mükemmel sanat ile katkıda teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, tüm hastalara çok özel teşekkürler, onsuz bu çalışma mümkün olmazdı. Bu çalışma herhangi bir finansman ajansı ndan özel bir hibe almadı.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BD LSR II | Becton Dickinson | ||
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır