Nachweis von Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts bei Patienten durch Strand-spezifische RT-PCR

Zusammenfassung

RNA-Haarnadeln und -schleifen können als Primer für die Reverse-Transkription (RT) in Ermangelung sequenzspezifischer Primer fungieren, was die Untersuchung überlappender Antisense-Transkripte beeinträchtigt. Wir haben eine Technik entwickelt, die in der Lage ist, strangspezifische RNA zu identifizieren, und wir haben sie verwendet, um DAS HIV-1-Antisense-Protein ASP zu untersuchen.

Zusammenfassung

Bei Retroviren wurde die Antisense-Transkription sowohl beim humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) als auch beim humanen T-Lymphotropen Virus 1 (HTLV-1) beschrieben. In HIV-1 befindet sich das Antisense-Protein ASP-Gen auf dem negativen Strang von env, im Leserahmen -2, der die Kreuzung gp120/gp41 überspannt. In der Sinnesorientierung überlappt sich das 3' Ende des offenen ASP-Leserahmens mit den hypervariablen gp120-Bereichen V4 und V5. Die Untersuchung von ASP-RNA wurde durch ein Phänomen vereitelt, das als RT-Selbstgrundierung bekannt ist, wobei RNA-Sekundärstrukturen die Fähigkeit haben, RT in Abwesenheit des spezifischen Primers zu grundieren und unspezifische cDNAs zu erzeugen. Die kombinierte Verwendung einer hohen RNA-Denaturierung mit biotinylierten Reverseprimern in der RT-Reaktion, zusammen mit der Affinitätsreinigung der cDNA auf Streptavidin-beschichtete Magnetperlen, hat es uns ermöglicht, ASP-RNA in CD4+ T-Zellen, die von mit HIV-1 infizierten Personen stammen, selektiv zu verstärken. Unsere Methode ist relativ kostengünstig, einfach durchzuführen, sehr zuverlässig und leicht reproduzierbar. In dieser Hinsicht stellt es ein wirksames Instrument zur Untersuchung der Antisense-Transkription nicht nur bei HIV-1, sondern auch in anderen biologischen Systemen dar.

Einleitung

Das Antisense-Protein (ASP)-Gen ist ein offener Leserahmen (ORF), der sich auf dem negativen Strang des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) Hüllkurve (env) befindet und die Kreuzung gp120/gp41¹überspannt. In den letzten 30 Jahren haben mehrere Berichte gezeigt, dass das HIV-ASP-Gen tatsächlich transkribiert und übersetzt ist^{2,3,4,5,6,7,8,9}. Obwohl ASP Antisense Transkripte in vitrovollständig charakterisiert wurden, fehlten bis vor kurzem Informationen über die tatsächliche Produktion von ASP-RNA bei Patienten noch.

Die Reihenfolge von ASP ist umgekehrt und komplementär zu env. Dies stellt ein großes Hindernis beim Versuch dar, Transkripte für ASP zu erkennen. Standard-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktions-Methoden (RT-PCR) verwenden genspezifische Antisense-Primer, um komplementäre DNAs (cDNAs) der rechten Polarität zu synthetisieren. Dieser Ansatz erlaubt es jedoch nicht, die Ausrichtung (Sinn oder Antisense) der ursprünglichen RNA-Vorlage zu bestimmen, da RNA-Haarnadeln oder -schleifen RT in beide Richtungen ohne Primer¹⁰primieren können, ein Phänomen, das als RT-Selbstgrundierung bekannt ist. Die meisten ASP-Ermittler umgehen das Problem der RT-Selbstansaugung mit Primern, die mit Sequenzen markiert sind, die nichts mit HIV-11^,12zu tun haben. Diese Strategie beseitigt jedoch nicht das Auftreten des Phänomens und kann zu einer möglichen Übertragung unspezifischer cDNAs in die PCR¹¹führen.

Wir haben vor kurzem einen neuartigen strangspezifischen RT-PCR-Assay für die Untersuchung von Antisense-RNA entwickelt und für den ASP-RNA-Nachweis in einer Kohorte von sechs HIV-infizierten Patienten verwendet, wie in Tabelle 1dargestellt. Das unten beschriebene Verfahren wurde bereits von Antonio Mancarella et al.¹³veröffentlicht. In unserem Protokoll vermeiden wir die Produktion von unspezifischen cDNAs durch einen dualen Ansatz. Erstens eliminieren wir RNA-Sekundärstrukturen durch Denaturierung von RNA bei hoher Temperatur (94 °C), und zweitens transkribieren wir ASP-RNA mit einem biotinylierten ASP-spezifischen Primer und affinitätsreinigen die resultierende cDNA. Mit diesem Ansatz sind wir in der Lage, nur unsere Ziel-cDNA zu verstärken, da andere unspezifische RT-Produkte entweder daran gehindert werden, erzeugt zu werden (Hochtemperatur-Denaturierung der RNA) oder vor PCR (Affinitätsreinigung) eliminiert werden.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) genehmigt.

1. Infektion peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) mit HIV-1_HXB2-Stamm

1. Tag 1: PBMCs STIMULATION
   1. Isolieren Sie PBMCs von einem gesunden Spender-Buffy-Mantel.
   2. Zählung und Resuspendierung von PBMCs in einer Konzentration von 1x10⁶/ml im gesamten Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicill In/Streptomycin (R-10), mit Zugabe von 50 U/ml Interleukin-2 (IL-2) und 3 g/ml Phytohämagglutinin (PHA).
   3. Pipetten Sie nach oben und unten und teilen Sie die Zellen in zwei Sechs-Well-Platten (3 ml Zellsuspension/Well).
   4. 3 Tage bei 37 °C und 5%_CO2inkubieren.
2. Tag 3: PBMCs INFECTION
   HINWEIS: Verwenden Sie eine der beiden Platten wie in Schritt 1.1.3 als Negativkontrolle (infizieren Sie diese Zellen nicht).
   VORSICHT: Führen Sie das gesamte Verfahren in einem Labor der Biosicherheitsstufe III (P3) durch.
   1. PBMCs von einer Platte in ein 50 ml Falkenrohr und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bündeln.
   2. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 2,2 ml R-10 wieder aus, die 20 U/ml IL-2 und 2 g/ml Polybren enthalten.
   3. Durchstechflaschen, die das HIV-1_HXB2-Virus enthalten, und 1,8 ml viruselsuspension (0,376 ng/l) zu den Zellen hinzufügen.
   4. Inkubieren Sie die Zellen für 2 h bei 37 °C, sanft wirbeln das Rohr alle 30 min.
   5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min.
   6. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen bei 1x10⁶/ml in R-10, die IL-2 (50 U/ml) enthalten, wieder aus.
   7. Die Zellsuspension in einer Konzentration von 1 ml/Well auf eine 24-Well-Platte übertragen und 5 Tage bei 37 °C und 5%_CO2inkubieren.
   8. Ernte 1 gut jeden Tag und übertragen Sie die Zellen auf 1,5 ml Rohr (mit dem Tag der Infektion gekennzeichnet).
      HINWEIS: Übertragen Sie vor der Zentrifugation 150 l Zellsuspension in ein Durchflusszytometrierohr zur Qualitätskontrolle der PBMCs-Infektion (siehe Schritt 1.3)
   9. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand.
   10. Die Zellpellets bis zur Verwendung bei -80 °C einfrieren.
3. PBMCs-Infektion: Qualitätskontrolle
   1. Sammeln Sie für jeden Infektionstag 150 L infizierte PBMCs und übertragen Sie sie in ein Durchflusszytometrierohr.
   2. 1 ml phosphatgepufferte Saline (PBS) und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min hinzufügen.
   3. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 50 l PBS hinzu, die 1 L Aqua Live/Totfarbstoff enthalten (zuvor 1:10 mit PBS verdünnt).
   4. Bei 4 °C für 15 min inkubieren.
   5. Fügen Sie 1 ml PBS, Zentrifuge bei 400 x g für 5 min, und entsorgen Überstand.
   6. Fügen Sie 250 L Fixierung/Permeabilisationslösung hinzu und brüten Sie 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   7. 1 ml 1x Perm/Waschpuffer (10x Stammlösung mit FBS und Saponin verdünnt 1:10) und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min hinzufügen.
   8. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 50 L PBS, die HIV Gag p24 Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Antikörper enthalten,(verdünnt 1:10) hinzufügen.
   9. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   10. Fügen Sie 1 ml PBS, Zentrifuge bei 400 x g für 5 min, und entsorgen Sie den Überstand.
   11. Fügen Sie 150 l x CellFIX (10x Stammlösung mit 10% Formaldehyd, 3,55% Methanol, 0,93% Natriumazid verdünnt 1:10) hinzu und zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren.

2. Stimulation menschlicher CD4+ T-Zellen mit Anti-CD3/CD28-Antikörpern

1. Isolieren Sie CD4+ T-Zellen aus PBMCs von HIV-1-infizierten Patienten und gesunden Spendern.
2. Bereiten Sie den menschlichen Anti-CD3/CD28-Antikörpermix vor, indem Sie Anti-CD3 (1:100) und Anti-CD28 (1:50) in PBS verdünnen.
3. Beschichten Sie eine 48-Well-Platte, indem Sie 200 l Antikörpermischung pro Brunnen zu einer entsprechenden Anzahl von Bohrungen hinzufügen und bei 37 °C für 2 h brüten.
4. Aspirieren Sie die Antikörperlösung und fügen Sie 1 ml CD4+T-Zellen bei 1x10⁶/ml in die Anti-CD3/CD28-Antikörper-beschichteten Bohrungen ein.
   HINWEIS: Stimulieren Sie CD4+ T-Zellen bis zu 5 Tage.

3. Umgekehrte Transkription

HINWEIS: Um patientenspezifische Primer zu erhalten, wurde provirale DNA, die aus CD4+T-Zellen isoliert wurde, von jedem Patienten mit HIV-1_HXB2 Pan ASP Primern verstärkt. Patientenspezifische Primer wurden mit der proviralen Sequenz intern zu den Pan ASP Primern entwickelt. Alle in dieser Studie verwendeten Primer und Sonden sind in Tabelle 2aufgeführt.

1. Isolierung der gesamten RNA aus Zellen
   1. Quantifizieren Sie die RNA und beseitigen Sie die DNA-Kontamination, indem Sie Proben mit DNase behandeln.
   2. Führen Sie RT-Reaktionen in einem Volumen von 50 l durch. Übertragen Sie 0,1-1 g Gesamt-RNA in eine entsprechende Anzahl von Bohrungen einer 96-Well-PCR-Platte. Bereiten Sie das RNA-Gemisch vor, indem Sie der RNA die folgenden Komponenten hinzufügen:
      5 l biotinylierte ASP-Reverse-Primer (20 m)
      2,5 l Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) (10 mM)
      25 l Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltes destilliertes Wasser (dH₂O).
      Bereiten Sie die endogenen RT-Kontrollen vor, indem Sie anstelle des biotinylierten ASP-Reverseprimers 5 L nukleasefreies Wasser hinzufügen.
   3. Die 96-Gut-PCR-Platte in einen Thermocycler geben und das RNA-Gemisch 5 min auf 94 °C erhitzen.
   4. Die RNA-Mischung in Eiswasser sofort mindestens 1 min abkühlen.
   5. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch vor, indem Sie die folgenden Komponenten zu einem 1,5 ml-Rohr hinzufügen (berechnen Sie die Gesamtzahl der Proben plus 1):
      10 l 5x RT Puffer
      2,5 l von 0,1 M von 1,4-Dithiothreitol (DTT)
      2,5 l RNase-Aus (40 Einheiten/L)
      2,5 l RT-Enzym (200 Einheiten/L)
   6. Übertragen Sie 17,5 l dieses Gemischs auf jede der RNA-haltigen Brunnen. Bereiten Sie die RT-minus-Steuerelemente vor, die die Reverse-Transkriptase durch 2,5 l nukleasefreies Wasser ersetzen.
   7. Mischen Sie die Platte vorsichtig und bebrüten Sie die Platte bei 55 °C für 60 min mit einem Thermocycler.
   8. Inaktivieren Sie die Reaktionen durch Erhitzen bei 70 °C für 15 min.

4. Affinitätsreinigung von ASP-biotinylierter cDNA

HINWEIS: Reinigen Sie die RT-minus-Reaktionen nicht.

1. 1 L 2x Wasch-/Bindungspuffer mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 2 M NaCl vorbereiten. Filtern Sie die Lösung.
   1. Bereiten Sie 50 ml 1x Wasch-/Bindungspuffer mit PCR-Wasser vor.
   2. Verwenden Sie für jede Reaktion 10 l Streptavidin-konjugierte Magnetperlen. Basierend auf der Anzahl der Reaktionen, übertragen Sie ein entsprechendes Volumen von Perlen auf ein 1,5 ml Rohr.
   3. Waschen Sie die Perlen, indem Sie ein gleiches Volumen von 2x Wasch-/Bindungspuffer und Wirbel für 15 s hinzufügen.
   4. Legen Sie das Rohr in ein magnetisches Trennregal und inkubieren Sie für 3 min bei Raumtemperatur.
   5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören, und fügen Sie das gleiche Volumen an Wasch-/Bindungspuffer hinzu wie das ursprüngliche Volumen der Perlen.
   6. Vortex für 30 s und übertragen 10 l der Perlensuspension auf eine entsprechende Anzahl von 1,5 ml Röhren.
   7. Legen Sie die Rohre in ein magnetisches Trennregal und brüten Sie 3 min bei Raumtemperatur.
   8. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 50 l Wasch-/Bindungspuffer hinzu.
   9. Fügen Sie den entsprechenden Röhrchen, die die Perlen enthalten, 50 l biotinylierte cDNA hinzu.
   10. 30 min bei sanft rotierender Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
   11. Trennen Sie die Perlen vom Überstand durch ein Magnettrenngestell für 3 min bei Raumtemperatur.
   12. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 200 l 1x Wasch-/Bindungspuffer hinzufügen. Legen Sie die Rohre 3 min bei Raumtemperatur in ein Magnettrenngestell und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dies zweimal.
   13. Setzen Sie die Perlen in 10 l PCR-Wasser aus.

5. Standard-PCR

HINWEIS: Ziel der Standard-PCR ist es, den gesamten ORF des ASP-Gens zu verstärken. Die Amplifikationsprodukte werden dann in pCR2.1-Plasmid geklont, um Standardkurven für die ASP-RNA-Quantifizierung durch Echtzeit-PCR zu entwickeln (siehe Absatz Real Time PCR).

1. Führen Sie Standard-PCRs in einem Gesamtvolumen von 50 l durch. Bereiten Sie ein entsprechendes Volumen des PCR-Master-Mix vor (Anzahl der Samples plus 1). Fügen Sie für jede Probe die folgenden Komponenten zu einem 1,5 ml-Rohr hinzu:
   1 L von 10 'M ASP-Primern (vorwärts und rückwärts)
   1 L mit 10 mM dNTPs
   Magnesiumchlorid (MgCl₂) (Konzentration hängt von den verwendeten Primern ab)
   dH₂O bis zu einem Endvolumen von 49 l
   1. Gut mischen, Inhalte schnell verdrehen und 49 L/Well des PCR-Master-Mix auf eine 96-Well-PCR-Platte übertragen.
   2. Wirbeln Sie vorsichtig die Rohre, die die Perlen enthalten, die für die ASP cDNA Affinitätsreinigung für 15 s verwendet werden.
   3. Fügen Sie 1 L Perlen in die entsprechenden Bohrungen und führen Sie die PCR mit dem folgenden Programm: 95 °C für 2 min, 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 68 °C für 40 s, dann 68 °C für 7 min.
   4. Trennen Sie die PCR-Produkte auf 1 % Agarose-Gel, schneiden Sie die Bänder und klonen Sie die verstärkten Produkte in pCR2.1-Plasmid.
   5. Sequenzen und Analysieren der Sequenzen jedes Klons.

6. Quantitative PCR in Echtzeit (qPCR)

HINWEIS: Entwickeln Sie patientenspezifische Primer und Sonden nach dem in Schritt 3 "Reverse Transcription" beschriebenen Ansatz. Für qPCR enthalten ASP Plasmid Verdünnungen für Standardkurven. Plasmide, die patientenspezifische Einsätze enthalten, werden wie in der Anmerkung zu Beginn von Schritt 5 "Standard PCR" erwähnt entwickelt.

1. Bereiten Sie die Standardkurve mit 1:10 ASP-Plasmid-Seriellverdünnungen von 3 x 10⁶ Kopien/L bis zu 3 Kopien/L vor.
   1. Erste Runde PCR (Vorverstärker). Durchführen Von Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 25 l. Bereiten Sie ein entsprechendes Volumen des PCR-Master-Mix (Anzahl der Proben plus 1) vor. Fügen Sie für jede Probe die folgenden Komponenten zu einem 1,5 ml-Rohr hinzu:
      0,5 l ASP- oder Env-Primer-Mix (Endkonzentration je 0,2 m) (vorwärts und rückwärts)
      dNTPs-Mix mit 0,5 l (Endkonzentration je 0,2 mM)
      MgCl₂ (Konzentration hängt von den Primerpaaren ab)
      dH₂O bis zu einem Endvolumen von 24 l
   2. Übertragen Sie 24 L PCR-Master-Mix auf eine entsprechende Anzahl von Bohrungen einer 96-Well-PCR-Platte.
   3. Wirbeln Sie die Rohre, die die Perlen enthalten, vorsichtig mit der cDNA für 15 s.
   4. Fügen Sie den entsprechenden Brunnen 1 L Perlen hinzu. Tun Sie dasselbe für Plasmidverdünnungen.
   5. Führen Sie die PCR mit dem folgenden Algorithmus: Denaturierung für 2 min bei 95 °C; 30 s bei 95 °C, 30 s bei 55 °C, 40 s bei 68 °C für 18 Zyklen; Verlängerung bei 68 °C für 7 min.
   6. Verdünnen Sie die ersten Runde PCRs Reaktionen 1:5 mit PCR-Grade Wasser.
   7. Zweite Runde qPCR. Durchführen Von Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 20 l. Bereiten Sie ein entsprechendes Volumen des PCR-Master-Mix (Anzahl der Proben plus 1) vor. Fügen Sie für jede Probe die folgenden Komponenten zu einem 1,5 ml-Rohr hinzu:
      1,8 l 10 M Primer (vorwärts und rückwärts)
      1 L von 5 -M-Sonde
      6,2 l dH₂O
   8. Übertragen Sie 19 l qPCR-Master-Mix in eine entsprechende Anzahl von Bohrungen einer 96-Well-qPCR-Platte und fügen Sie den entsprechenden Bohrern 1 l der verdünnten PCR-Reaktionen der ersten Runde hinzu. Gleiches gilt für die Plasmidverdünnungen.
   9. Führen Sie den qPCR mit folgendem Algorithmus aus: Denaturierung für 10 min bei 95 °C; 15 s bei 95 °C, 1 min bei 60 °C für 40 Zyklen.

Ergebnisse

Hochtemperatur-RNA-Denaturierung gekoppelt mit Affinitätsreinigung von biotinylatierter cDNA verhindert die Amplifikation unspezifischer ASP-Produkte während der PCR in PBMCs, die in vitro infiziert sind, und in CD4+ T-Zellen, die von Patienten isoliert wurden. RT Selbstansaugung hat sich gezeigt, während der umgekehrten Transkription von Antisense RNAs^10,14,15,16,

Diskussion

In diesem Bericht beschreiben wir einen strangspezifischen RT-Assay, der auf den Nachweis von ASP-RNA in CD4+ T-Zellen angewendet wird, die von Personen isoliert wurden, die mit HIV-1 infiziert sind. Das Auftreten einer unspezifischen Grundierung während RT behindert den Nachweis von RNA-Transkripten mit der richtigen Polarität, was zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse führt. Frühere Gruppen haben mehrere Strategien entwickelt, um die grundunabhängige cDNA-Synthese während der RT-Reaktion zu verhindern. Das M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR II	Becton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4337450
dNTP Set (100 mM)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	10297018
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11205D
EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit	Stemcell Technologies	19052
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1010-500
Fixation/Permeabilization Solution Kit	Becton Dickinson	554714
HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC	Beckman Coulter	6604665
Human IL-2	Miltenyi Biotec	130-097-743
Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)	Sigma-Aldrich	61764-1MG
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	L34967
Mouse Anti-Human CD28	Becton Dickinson	55725
Mouse Anti-Human CD3	Becton Dickinson	55329
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies (IDT)
Penicillin-Streptomycin	BioConcept	4-01F00-H
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	11304011
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11875093
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4376600
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	18080044
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4369016
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	K450001
TURBO DNase (2 U/µL)	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	AM2238
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific	4375786