JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم طريقة فحص معدلة يمكن استخدامها على نطاق واسع لفحص مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي بسرعة في مسببات الأمراض النباتية.

Abstract

RNA إسكات هو حفظ تطوريا، آلية تنظيم الجينات تسلسل محددة في eukaryotes. وقد تطورت العديد من مسببات الأمراض النباتية البروتينات مع القدرة على تثبيط مسار إسكات الحمض النووي الريبي النبات المضيف. على عكس بروتينات تأثير الفيروسات ، أظهرت العديد من بروتينات المؤثرات المعسرة القدرة على قمع إسكات الحمض النووي الريبي في مسببات الأمراض البكتيرية والأوميسيتة والفطرية ، ولا تزال الوظائف الجزيئية لمعظم المؤثرات غير معروفة إلى حد كبير. هنا ، نصف بالتفصيل نسخة معدلة قليلا من تحليل التسلل المشترك التي يمكن أن تكون بمثابة طريقة عامة لمراقبة إسكات الحمض النووي الريبي وتوصيف البروتينات المؤثرات التي تفرزها مسببات الأمراض النباتية. الخطوات الرئيسية للنهج هي اختيار أوراق صحية ومكتملة النمو ، وضبط ثقافة البكتيريا إلى الكثافة البصرية المناسبة (OD) في 600 نانومتر ، ومراقبة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الفلورية في الوقت الأمثل على المتسللين يترك من أجل تجنب حذف المؤثرات مع ضعف نشاط القمع. هذا البروتوكول المحسن سيساهم في الفحص السريع والدقيق والمكثف للكتمات الإسكات الجيش الملكي النيبالي وبمثابة نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في الوظائف الجزيئية لهذه البروتينات.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين، أدى التسارع في تسلسل الجينوم من الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب أمراض النباتات إلى فجوة معرفية متزايدة من أي وقت مضى بين المعلومات تسلسل والوظائف البيولوجية للبروتينات المشفرة1. ومن بين الجزيئات التي كشفت عنها مشاريع التسلسل جزيئات المؤثرات التي تقمع المناعة الفطرية وتيسر الاستعمار المضيف؛ تفرز هذه العوامل من قبل مسببات الأمراض النباتية المدمرة، بما في ذلك البكتيريا، والديدان الخيطية، والميكروبات الخيطية. وللاستجابة لهذه التهديدات، طورت النباتات المضيفة مستقبلات جديدة تتعرف على هذه المؤثرات، مما يتيح استعادة الاستجابة المناعية. وبالتالي ، تخضع المؤثرات لضغوط انتقائية مختلفة ، مما يؤدي إلى تنويع ذخيرة التأثير بين الأنساب المسببة للأمراض2. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن المؤثرات المفترضة من مسببات الأمراض النباتية تعطل المناعة الفطرية النباتية عن طريق إعاقة العمليات الخلوية المضيفة لصالح الميكروبات بطرق متنوعة ، بما في ذلك خلل تنظيم مسارات الإشارات ، والنسخ ، والنقل داخل الخلايا ، واستقرار الهيكل الخلوي ، والاتجار بالحويز ، والحمض النووي الريبي إسكات3،4،5. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من مسببات الأمراض ، ولا سيما تلك من مسببات الأمراض الخيطية ، ظلت غامضة.

RNA إسكات هو جهاز تنشيط الجينات بوساطة homology التي يتم حفظها بين eukaryotes. يتم تشغيل هذه العملية من قبل الحمض النووي الريبي طويل تقطعت بهم السبل مزدوجة (dsRNA) ويستهدف الحمض النووي الريبي المتماثل واحد تقطعت بهم السبل (ssRNA) بطريقة تسلسل محددة، وأنه يتلاعب مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك الدفاع المضادة للفيروسات6. للتغلب على الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف ، تطورت بعض الفيروسات لتعويض إسكات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك القدرة على تكرار داخل المقصورات داخل الخلايا أو الهروب من الإشارة المعاد تنظيمها. ومع ذلك ، فإن الاستراتيجية الأكثر عمومية التي تحمي الفيروسات جينومها ضد فقدان الحمض النووي الريبي المعتمد على وظيفة الجينات هو ترميز بروتينات محددة تقمع RNA إسكات7،8. وقد أنشئت عدة نهج مختلفة ميكانيكيا لفحص وتوصيف المكثفات الفيروسية من إسكات الجيش الملكي النيبالي (VSRs)، بما في ذلك التسلل المشترك للثقافات كيتومالونز Agrobacterium، والنباتات المعدلة وراثيا التعبير عن القامع المفترضة، والتطعيم وثقافة الخلية9،10،11،12، 13.

كل من هذه المقالات المحددة لها مزايا وعيوب، وتحدد VSRs بالطريقة الخاصة بها. ويستند أحد النهج الأكثر شيوعا على التسلل المشترك للثقافات A. tmuefaciens الفردية التي تؤوي البروتين الفيروسي المحتمل والجينات مراسل (عادة البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) على النباتات Nicotiana benthamiana 16c تشكل تشكيلGFP تحت سيطرة القرنبيط فسيفساء فيروس 35S المروج. في حالة عدم وجود مثبط إسكات فيروسي نشط ، يتم تحديد GFP على أنه خارجي من قبل الخلايا المضيفة ويتم إسكاته في غضون 3 أيام بعد التسلل (نقطة في البوصة). وعلى النقيض من ذلك، إذا كان البروتين الفيروسي يمتلك نشاط الكبت، فإن مستوى التعبير عن GFP يظل ثابتاً بعد 3−9 نقطة في البوصة9. هذا النسخة المشتركة من عملية التتسلل بسيطة وسريعة. ومع ذلك ، فإنه ليس مستقرا للغاية ولا حساسة. ومع ذلك ، فقد حددت في إجراء العديد من VSRs مع تسلسل البروتين المتنوعة والهياكل في العديد من فيروسات الجيش الملكي النيبالي7،8.

في الآونة الأخيرة ، تم وصف العديد من البروتينات المؤثرات التي يمكن أن تمنع نشاط إسكات الحمض النووي الريبي الخلوي من البكتيريا ، الأوميسيت ، ومسببات الأمراض النباتية الفطرية14،15،16. هذه النتائج تعني أن قمع الجيش الملكي النيبالي هو استراتيجية مشتركة لتسهيل العدوى التي تستخدمها مسببات الأمراض في معظم الممالك. من الناحية النظرية، قد العديد، إن لم يكن كل، من المؤثرات ترميز مثبطات إسكات الجيش الملكي النيبالي (RSSs)؛ غير أنه لم يتم حتى الآن تحديد سوى عدد قليل منها، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص استراتيجية الفرز العامة الموثوقة. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقيق في مثبطات من إسكات الجيش الملكي النيبالي في الغالبية العظمى من مسببات الأمراض النباتية17.

في هذا التقرير، نقدم بروتوكولًا مثاليًا وعامًا لتحديد تأثيرات مسببات الأمراض النباتية التي يمكن أن تقمع إسكات الحمض النووي الريبي المحلي والنظامي باستخدام فحص التسلل الزراعي. وكان الهدف الأول من هذه الدراسة هو التأكيد على الجوانب الرئيسية للبروتوكول ووصف الخطوات بالتفصيل، وبالتالي توفير فحص للفحص يناسب تقريباً جميع تأثيرات مسببات الأمراض النباتية.

Protocol

ملاحظة: يجب إجراء جميع خطوات الإجراء في درجة حرارة الغرفة (RT).

تنبيه: إيداع جميع الوسائط التي تحتوي على الميكروبات المسببة للأمراض، وكذلك النباتات والأنسجة النباتية المستخدمة في العينات، في حاويات النفايات المناسبة والأوتوكلاف قبل التخلص منها.

1. إعداد بلازميد يبني التي تحتوي على تأثيرات المفترضة

  1. حدد المؤثرات المعسرة المفترضة التي يتم التعبير عنها بشكل كبير أثناء العدوى ، كما يحددها تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) ، وكذلك بواسطة تقنية PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).
  2. تحديد موقع انشقاق إشارة الببتيد من كل المؤثرات باستخدام أداة برمجية مثل SignalP18.
  3. تصميم التمهيديات وأداء PCR لتضخيم الجينات ترميز التأثير من الفائدة باستخدام البوليميراز الحمض النووي عالية الدقة. أداء agarose هلام electrophoresis للتحقق من المنتج PCR، ثم استنساخ amplicon في بوابة دخول ناقلات pQBV3 باستخدام مجموعة الاستنساخ خالية من الربط(جدول المواد)،وبعد ذلك في التعبير الوجهة ناقلات pEG100 باستخدام رد فعل إعادة تركيب LR19.
  4. تحويل 3-5 ميكرولتر من خليط تفاعل LR إلى 100 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة (على سبيل المثال، TOP10، DH5α)، ونشر الخلايا البكتيرية المتحولة على Luria-Bertani (LB) أغار المتوسطة المكملة مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
    ملاحظة: يمكن تحديد التحويلات الإيجابية بواسطة PCRمستعمرة 20 وتحليلها من قبل miniprep plasmid والتسلسل.
  5. إدخال 50-100 نانوغرام من البلازميدات المؤتلفة التي تحمل بروتين التأثير إلى 100 ميكرولتر من الخلايا A. tumefaciens المختصة كيميائياً (على سبيل المثال، GV3101 أو C58C1)، وتخلط بلطف، ثم تتجمد في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة.
  6. أضف 500 ميكرولتر من مرق LB واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة 4−6 ساعة مع اهتزاز لطيف، ثم نقل ونشر جميع خلايا البكتيريا الزراعية على LB agar متوسطة مكمّلة بـ 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و50 ميكروغرام/مل ريفامبيسين عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
    ملاحظة: يمكن التحقق من المستنسخات الإيجابية بواسطة PCR مستعمرة.
  7. استخدام مستعمرة واحدة تحولت لتجارب تسلل الزراعية ما لم يتم توجيه خلاف ذلك.
    ملاحظة: في هذا البحث، لم تتضمن أي من جينات المؤثرات التي تم اختبارها الإنترونات المتوقعة؛ تم تضخيم كل من الجينات مباشرة من الحمض النووي الجينومي لعزل ة Phytophthora sojae. يوصى بمتجه تعبير نبات العبارة بدون أي علامة، ولكن ليس ضروريًا.

2. إعداد النباتات N. بنتاميانا 16c

  1. إعداد مزيج التربة بوتينغ تتكون من (من حيث الحجم) 50٪ الطحالب الخث، 30٪ البيرلايت، و 20٪ فيرميكوليت، والأوتوكلاف في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. نقع التربة الأوتوكلاف يمزج مع حل الأسمدة النباتية (1 ز / لتر) وحزمة فرعية لهم في الأواني الصغيرة (80 ملم × 80 ملم × 75 ملم) المخزنة في صينية أكبر (540 ملم × 285 ملم × 60 ملم).
  3. زرع واحد أو اثنين من بذور N. بنتاميانا 16c على سطح التربة من كل وعاء. تغطية صينية مع قبة بلاستيكية والسماح للبذور تنبت.
  4. ضع الدرج تحت الضوء وغرف النمو التي يتم التحكم فيها درجة الحرارة مع درجة حرارة 23-25 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 50−60٪، وفترة ضوء طويلة اليوم (14 ساعة ضوئية /10 ساعة داكنة، مع إضاءة عند 130−150 μE·m-2s-1).
  5. اخلع القبة البلاستيكية بعد أن تنبت البذور (3-4 أيام) واسمح للشتلات بالنمو في نفس الظروف المستخدمة لخطوة الإنبات.
  6. إضافة كمية مناسبة من الماء، والحفاظ على التربة رطبة ولكن ليس نقع، كل 2-3 أيام؛ إضافة الأسمدة كل 10 أيام لتعزيز المزيد من النمو. الحفاظ على النباتات N. benthamiana 16c في ظل الظروف العادية حتى تصبح جاهزة للاستخدام؛ في هذه المرحلة يجب أن يكون للنبات ما لا يقل عن خمسة أوراق حقيقية مطورة بالكامل ولا توجد أبطان مرئية أو براعم زهرة ، ويجب أن يكون للأوراق مظهر أخضر صحي).
  7. استخدم أوراق 3-4 أسابيع من N. benthamiana 16c لمقالات الحمض النووي الريبي المحلية لإسكات، والنباتات N. benthamiana 16c الشباب (10-14 أيام من العمر) لمقالات الحمض النووي الريبي النظامية إسكات.
    ملاحظة: تختلف ظروف ومرافق نمو النباتات عبر المختبرات؛ اختيار أوراق صحية ومتطورة وموسعة بالكامل للتسلل.

3. إعداد ثقافة البكتريا الزراعية للتسلل

  1. اختيار مستعمرة إيجابية من لوحة LB وتلقيح الخلايا في أنبوب زجاجي يحتوي على 5 مل من LB المتوسطة تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل kanamycin و 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين. تنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 24-48 ساعة.
  2. نقل 100 ميكرولتر من الثقافة إلى 5 مل من متوسط LB المكمل بنفس المضادات الحيوية، وحمض الإيثانولين (MES؛ درجة الحموضة 5.6) و20 ميكرومتر من الأسيتوسرينجون (AS). تنمو البكتيريا عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 16−20 ساعة.
  3. خلايا الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة. صب قبالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 2 مل من 10 mM MgCl2 العازلة.
  4. كرر الخطوة 3.3 لضمان الإزالة الكاملة للمضادات الحيوية.
  5. تحديد كثافة ثقافة البكتريا الزراعية من خلال قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600). ضبط إلى OD600 من 1.5−2.0 مع 10 mM MgCl2 المخزن المؤقت.
  6. إضافة 10 mM MES (درجة الحموضة 5.6) و 150 ميكرومتر AS إلى ثقافات التعليق النهائي واحتضان الخلايا في RT لمدة 3 ساعة على الأقل دون اهتزاز.
    ملاحظة: لا تترك ثقافات التعليق النهائي بين عشية وضحاها.

4. التسلل المشترك N. بنتاميانا يترك

  1. مزيج كميات متساوية من ثقافة Agrobacterium التي تحتوي على 35S-GFP مع ثقافة Agrobacterium التي تحتوي على 35S- الخيار فيروس الفسيفساء القامع 2b (CMV2b)، المؤثرات المفترضة، أو ناقلات فارغة (EV).
  2. تتسلل بعناية وببطء إلى تعليق التفطر ة المتعددة على الجوانب اللامحورية لأوراق N. benthamiana 16c باستخدام حقنة بدون إبرة 1 مل.
  3. إزالة التعليق البكتيري المتبقية من الأوراق مع ماسحات الأنسجة الرخوة ودائرة هوامش بقع تسللت مع قلم صانع.
  4. ترك النباتات المتسللة في غرفة النمو في ظل نفس ظروف النمو.
    ملاحظة: لأسباب تتعلق بالسلامة والصحة، يجب ارتداء نظارات واقية للعين وقناع أثناء التسلل. لمنع التلوث المتبادل ، يجب تغيير القفازات أو تعقيمها بالإيثانول بين عمليات التسلل. عادة ما لا يقل عن 1 مل من تعليق agrobacterium لكل ورقة هناك حاجة للتسلل. وللإسكات النظامي، ستكون هناك حاجة إلى ورقتين على الأقل للتسلل.

5. تحليل التصوير GFP

  1. الكشف بصريا ً عن تفلور GFP في الأوراق المزروعة حديثًا من النباتات الكاملة بعد 2 أسابيع بعد التسلل (لإسكات الحمض النووي الريبي النظامي) أو بقع متسللة من الأوراق 3−4 نقطة في البوصة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الموجة (UV) دون جمع الأوراق.
  2. صور النباتات التي تم جمعها و / أو الأوراق المنفصلة مع كاميرا رقمية مزودة بمرشحات الأشعة فوق البنفسجية والصفراء.
    ملاحظة: لمقالات عن قمع إسكات المحلية، والتحقيق في بقع تسللت من أوراق N. بنتاميانا 16c، في حين أن لمنهجي ة إسكات نشاط القمع، والتحقيق في الأوراق نمت حديثا. قد يختلف نشاط قمع إسكات الحمض النووي الريبي عبر المؤثرات الفردية. لذلك ، لاحظ البقع أو الأوراق على مدى بضعة أيام بدءًا من 3 نقطة في البوصة. استخدام CMV2b وEV كعناصر تحكم إيجابية وسلبية، على التوالي.

6. تحليل بقع الشمالية من مستويات GFP مرنا في الأوراق المتسللة

  1. عزل مجموع الحمض النووي الريبي من الأنسجة الورقية باستخدام كاشف العزل ة RNA(جدول المواد)
    1. اجمع الأنسجة الورقية من بقع N. benthamiana 16c المتسللة عند 4−7 نقطة في البوصة، واسحق النيتروجين السائل إلى مسحوق ناعم، ونقل المسحوق إلى أنبوب معقم 2 مل.
    2. إضافة الكاشف عزل الجيش الملكي النيبالي (1 مل / 100 ملغ الأنسجة) على الفور إلى أنبوب عينات في غطاء محرك السيارة، يهز بقوة لتجانس، واحتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
    3. إضافة الكلوروفورم (200 ميكرولتر/1 مل RNA الكاشف العزل) إلى كل أنبوب في غطاء محرك السيارة، يهز بقوة لمدة 15 ق، واحتضان في RT لمدة 5 دقيقة. الطرد المركزي التجانس في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 °C.
    4. نقل supernatant في أنبوب جديد RNase خالية والتخلص من بيليه. إضافة 0.7 حجم من الايزوبروبانول إلى supernatant، عكس بلطف عدة مرات، واحتضان الخليط في RT لمدة 10 دقيقة.
    5. راسب بيليه الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي عند 12,000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    6. تجاهل supernatant، وغسل بيليه مع الإيثانول 70٪، والهواء الجاف بيليه في غطاء محرك السيارة. إذابة الحمض النووي الريبي في الماء المعالج بالديثيل بيروكربونات (DEPC) عن طريق الاحتضان في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 10−20 دقيقة.
  2. تحليل بقع الشمالية من مستوى GFP مرنا في الأوراق المتسللة
    1. إعداد 1.2٪ الفورمالديهايد denaturing هلام أغاروز في 1x MOPS تشغيل العازلة.
    2. مزيج الجيش الملكي النيبالي 1:1 مع الحمض النووي الريبي صبغة التحميل والتشوه عن طريق الحضانة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، والبرد على الفور عينات مشوهة على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    3. تحميل العينات على هلام وelectrophorese في 100 V لمدة 50 دقيقة حتى يتم فصل الحمض النووي الريبي بشكل جيد.
    4. شطف الجل في 20x المالحة الصوديوم سيترات (SSC) عازلة لإزالة الفورمالديهايد ونقل الجل إلى غشاء النايلون عن طريق نقل الشعيرات الدموية في 20x SSC العازلة بين عشية وضحاها. نقع الغشاء في 2x SSC وإصلاح الجيش الملكي النيبالي إلى الغشاء عن طريق تعريض الغشاء الرطب لربط الصليب فوق البنفسجي.
    5. إضافة الكمية المناسبة من المخزن المؤقت التهجين (10 مل لكل 100 سم2 غشاء؛ جدول المواد) في أنبوب التهجين ويهتاج في 60 درجة مئوية في فرن التهجين.
    6. وضع الغشاء في أنبوب التهجين واحتضان لمدة 60 دقيقة في 60 درجة مئوية. تمييع مسبار الحمض النووي المسمى 5'DIG (التركيز النهائي، 50 نانوغرام/مل) في محلول التهجين الذي يحتوي على مخزن هجين مُدفئ مسبقًا.
    7. تجاهل المخزن المؤقت preهجينوجين وفورا استبدال مع حل التهجين الدفء تحتوي على التحقيق المسمى DIG. احتضان وصمة عار مع التحقيق في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها، مع الانفعالات لطيف.
    8. بعد التهجين، وغسل الغشاء مرتين في المخازن المؤقتة من زيادة stringency في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لكل منهما. مسح بلطف الغشاء لإزالة العازلة الغسيل اضافية وإضافة الكواشف على النحو المقترح في التهجين chemiluminescent ومجموعة الكشف(جدول المواد).
    9. الكشف عن الإشارات الهجينة عن طريق رد فعل كيميائي جنبا إلى جنب مع نظام التصوير.

النتائج

أعلاه، نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لفحص فحص محسنة لتقييم نشاط RSS من تأثيرات P. sojae RxLR. وتستغرق التجربة في الإجمال 5-6 أسابيع. وفي وقت لاحق، يمكن أن تتسم RSSs التي تم تحديدها من خلال الفحص بمزيد من التفصيل من حيث الوظيفة والآلية الجزيئية. كمثال على نهجنا، استخدمنا P. sojae Rx...

Discussion

الجيش الملكي النيبالي إسكات هو آلية الدفاع الرئيسية المستخدمة من قبل النباتات لمكافحة الفيروسية والبكتيرية والأوميسيت، ومسببات الأمراض الفطرية. بدورها ، تطورت هذه الميكروبات إسكات البروتينات المكثفة لمواجهة إسكات المضادة للفيروسات ، وهذه RSSs تتداخل مع خطوات مختلفة من مسار إسكات الحمض ?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من "برنامج شوقوانغ" لمؤسسة تطوير التعليم في شنغهاي ولجنة التعليم لبلدية شنغهاي، والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين ( 2018YFD0201500)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31571696 و 31660510)، وبرنامج الألف مواهب للمهنيين الشباب في الصين، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (18DZ2260500).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)Biofroxx1086GR500Buffer
2xTaq Master MixVazyme BiotechP112-AAPCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)Amresco0264C507-1KGMOPS Buffer
Acetosyringone (AS)Sigma-AldrichD134406-5GInduction of Agrobacterium
AgarSigma-AldrichA1296-1KGLB medium
AgaroseBiofroxx1110GR100Electrophoresis
Amersham Hybond -N+GE HealthcareRPN303 BNothern blot
Amersham ImagerGE HealthcareAmersham Imager 600Image
Bacto TryptoneBD Biosciences211705LB medium
Bacto Yeast ExtractionBD Biosciences212750LB medium
CameraNikonD5100Photography
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kitsThermo Fisher Scientific89880Luminescence detection
ChloramphenicolAmresco0230-100GAntibiotics
ClonExpress II One Step Cloning KitVazyme BiotechC112-01Ligation
DIG Easy HybSigma-Aldrich11603558001Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kitTransGen BiotechEM101-02Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction KitTransGen BiotechEG101-02Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrateAmresco/VWR0105-1KGMOPS Buffer
Electrophoresis Power SupplyLiuYiDYY6DNucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRVThermo Fisher ScientificFD0304Vector digestion
Gel Image SystemTanonTanon3500Image
GentamycinAmresco0304-5GAntibiotics
Kanamycin SulfateSigma-AldrichK1914Antibiotics
LR Clonase II enzymeInvitrogen11791020LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45umGE Healthcare10600002Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kitThermo Fisher Scientific17075Biotin labeling
PCR Thermal CyclersBio-RadT100PCR
Peat mossPINDSTRUPDark Gold + clayPlants
Peters Water-Soluble FertilizerICEPeter Professional 20-20-20Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolymeraseVazyme BiotechP505-d1Enzyme
RifampicinMP Biomedicals219549005Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)Thermo Fisher ScientificR0641RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate HydrateAmresco/VWR0530-1KGMOPS Buffer
Sodium ChlorideAmresco0241-10KGLB medium
Tri-Sodium citrateAmresco0101-1KGSSC Buffer
Trizol ReagentInvitrogen15596018RNA isolation reagent
UV lampAnalytik JenaUVP B-100APObservation
UVP Hybrilinker OvenAnalytik JenaOV2000Northern

References

  1. Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
  2. Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
  3. Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
  4. Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
  5. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
  6. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
  7. Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
  8. Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
  9. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
  10. Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
  11. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
  12. Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
  13. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  14. Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
  15. Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
  16. Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
  17. Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
  18. Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
  19. Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
  20. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
  21. Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
  22. Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
  23. Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
  24. Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156 effector Phytophthora sojae RNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved