Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

Resumen

Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.

Resumen

El silenciamiento del ARN es un mecanismo de regulación genética evolutivamente conservado y específico de la secuencia en eucariotas. Varios patógenos vegetales han evolucionado proteínas con la capacidad de inhibir la vía de silenciamiento de ARN de la planta huésped. A diferencia de las proteínas efectoras del virus, sólo varias proteínas efectoras secretas han demostrado la capacidad de suprimir el silenciamiento de ARN en patógenos bacterianos, oomicécetos y fúngicos, y las funciones moleculares de la mayoría de los efectores siguen siendo en gran medida desconocidas. Aquí, describimos en detalle una versión ligeramente modificada del ensayo de coinfiltración que podría servir como un método general para observar el silenciamiento del ARN y para caracterizar las proteínas efectoras secretadas por patógenos vegetales. Los pasos clave del enfoque son elegir las hojas sanas y completamente desarrolladas, ajustar el cultivo de bacterias a la densidad óptica (OD) adecuada a 600 nm, y observar la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) en el momento óptimo en el infiltrado hojas con el fin de evitar la omisión de efectos con una actividad de supresión débil. Este protocolo mejorado contribuirá a un cribado rápido, preciso y extenso de los supresores de silenciamiento de ARN y servirá como un excelente punto de partida para investigar las funciones moleculares de estas proteínas.

Introducción

En las últimas dos décadas, la aceleración en la secuenciación del genoma de microorganismos que causan enfermedades vegetales ha dado lugar a una brecha de conocimiento cada vez mayor entre la información de secuencia y las funciones biológicas de las proteínas codificadas¹. Entre las moléculas reveladas por proyectos de secuenciación se encuentran moléculas efectoras que suprimen la inmunidad innata y facilitan la colonización del huésped; estos factores son secretados por patógenos vegetales destructivos, incluyendo bacterias, nematodos y microbios filamentosos. Para responder a estas amenazas, las plantas anfitrionas han desarrollado nuevos receptores que reconocen a estos efectores, permitiendo la restauración de la respuesta inmune. Por lo tanto, los efectores están sujetos a diversas presiones selectivas, lo que conduce a la diversificación de los repertorios de efectores entre los linajes de patógenos². En los últimos años, se ha demostrado que los efectores putativos de patógenos vegetales de patógenos vegetales interrumpen la inmunidad innata de las plantas al impedir los procesos celulares del huésped para beneficiar a los microbios de diversas maneras, incluyendo la desregulación de las vías de señalización, transcripción, transporte intracelular, estabilidad del citoesqueleto, tráfico de vesículas y silenciamiento de ARN^3,4,5. Sin embargo, la gran mayoría de los efectores patógenos, particularmente los de patógenos filamentosos, han permanecido enigmáticos.

El silenciamiento de ARN es una maquinaria de inactivación genética mediada por homología que se conserva entre los eucariotas. El proceso se desencadena por el ARN de doble cadena (dsRNA) y se dirige al ARN homólogo de una sola cadena (ssRNA) de una manera específica de la secuencia, y manipula una amplia gama de procesos biológicos, incluida la defensa antiviral^6. Para superar las respuestas inmunitarias innatas del huésped, algunos virus han evolucionado para compensar el silenciamiento del ARN, incluida la capacidad de replicarse dentro de compartimentos intracelulares o escapar de la señal reorganizada de silenciamiento. Sin embargo, la estrategia más general mediante la cual los virus protegen sus genomas contra la pérdida dependiente del ARN dependiente del silenciamiento de la función génica es codificar proteínas específicas que suprimen el silenciamiento del ARN^7,8. Se han establecido varios enfoques mecanicistas diferentes para examinar y caracterizar los supresores virales del silenciamiento de ARN (VSR), incluyendo la coinfiltración de cultivos de Agrobacterium tumefaciens, plantas transgénicas que expresan supresores putativos, injertos y cultivo celular^{9,10,11,12,13}.

Cada uno de estos ensayos tiene ventajas y desventajas, e identifica vsR de su propia manera distinta. Uno de los enfoques más comunes se basa en la co-infiltración de cultivos individuales de A. tmuefaciens que albergan la proteína viral potencial y un gen reportero (típicamente proteína fluorescente verde [GFP]) en las plantas de Nicotiana benthamiana 16c que constituyen la expresión de GFP bajo el control del virus de mosaico de coliflor 35S promotor. En ausencia de un supresor de silenciamiento viral activo, GFP es identificado como exógeno por las células huésped y se silencia dentro de los 3 días después de la infiltración (dpi). Por el contrario, si la proteína viral posee actividad de supresión, el nivel de expresión de GFP se mantiene estable más allá de 3 a 9 ppp⁹. Este ensayo de co-infiltración es simple y rápido; sin embargo, no es altamente estable ni sensible. No obstante, el ensayo ha identificado numerosos VSR con diversas secuencias y estructuras proteicas en muchos virus de ARN^7,8.

Recientemente, varias proteínas efectoras que pueden inhibir la actividad de silenciamiento del ARN celular se han caracterizado por patógenos de plantas bacterianas, oomycete y hongos^14,15,16. Estos hallazgos implican que la supresión del silenciamiento del ARN es una estrategia común para facilitar la infección que es utilizada por patógenos en la mayoría de los reinos. En teoría, muchos, si no todos, de los efectores podrían codificar los supresores de silenciamiento de ARN (RSS); hasta la fecha, sin embargo, sólo unos pocos han sido identificados, principalmente debido a la escasez de la estrategia de cribado fiable y general. Además, no se han investigado supresores de silenciamiento de ARN en la gran mayoría de los patógenos vegetales¹⁷.

En este informe, presentamos un protocolo optimizado y general para identificar los efectores de patógenos vegetales que pueden suprimir el silenciamiento de ARN local y sistémico utilizando el ensayo de infiltración agroindustrial. El objetivo principal de este estudio fue enfatizar los aspectos clave del protocolo y describir los pasos en detalle, proporcionando así un ensayo de cribado que es adecuado para casi todos los efectores de patógenos vegetales.

Protocolo

NOTA: Todos los pasos del procedimiento deben realizarse a temperatura ambiente (RT).

ADVERTENCIA: Depositar todos los medios que contengan microbios patógenos, así como las plantas y el tejido vegetal utilizados en el ensayo, en los contenedores de residuos y autoclave apropiados antes de desechar.

1. Preparación de construcciones de plásmidos que contengan efectos putativos

1. Seleccione los efectores secretos putativos que están altamente expresados durante la infección, según lo determinado por la secuenciación de ARN (RNA-Seq), y más por la técnica cuantitativa de PCR en tiempo real (qRT-PCR).
2. Determinar el sitio de escisión del péptido de señal de cada efector utilizando una herramienta de software como SignalP¹⁸.
3. Diseñar imprimaciones y realizar PCR para amplificar el gen que codifica el efector de interés utilizando polimerasa de ADN de alta fidelidad. Realice la electroforesis de gel de agarosa para comprobar el producto PCR, luego clone el amplificador en el vector de entrada Gateway pQBV3 utilizando el kit de clonación libre de ligaduras (Tabla de materiales), y posteriormente en el vector de expresión de destino pEG100 utilizando la reacción de recombinación LR¹⁹.
4. Transformar 3 x 5 l de mezcla de reacción LR en 100 l de células competentes de E. coli (p. ej., TOP10, DH5, esparcir las células bacterianas transformadas en el medio de agar Luria-Bertani (LB) complementado con canamicina de 50 g/ml e incubar a 37 oC durante 16 x 20 h.
   NOTA: Los transformadores positivos pueden ser identificados por la colonia PCR²⁰ y analizados más por mini-preparación y secuenciación plásmidos.
5. Introducir 50 a 100 ng de plásmidos recombinantes que transportan proteína efector en 100 ml de células A. tumefaciens químicamente competentes (p. ej., GV3101 o C58C1), mezclar suavemente y luego congelar en nitrógeno líquido durante 1 min. Descongelar las células en un baño de agua de 37 oC durante 5 min.
6. Añadir 500 éL de caldo lb e incubar a 30 oC durante 4 x 6 h con un suave temblor, y luego transferir y esparcir todas las células agrobacterianas en el medio de agar LB complementado con kanamicina de 50 g/ml y rifampicina de 50 g/ml a 30 oC durante 2 días.
   NOTA: Los clones positivos pueden ser verificados por la PCR de colonia.
7. Utilice una sola colonia transformada para experimentos de agroinfiltración a menos que se indique lo contrario.
   NOTA: En la presente investigación, ninguno de los genes efectores probados contenía intrones predichas; cada uno de los genes se amplificó directamente a partir del ADN genómico de un aislado de Phytophthora sojae. Se recomienda un vector de expresión de planta gateway sin ninguna etiqueta, pero no es necesario.

2. Preparación de plantas de N. benthamiana 16c

1. Preparar mezclas de tierra de maceta que consisten en (por volumen) 50% musgo de turba, 30% perlita, y 20% vermiculita, y autoclave a 120 oC durante 20 min.
2. Remoje las mezclas de suelo autoclavedas con la solución de fertilizante vegetal (1 g/L) y subempaquetelas en macetas más pequeñas (80 mm x 80 mm x 75 mm) almacenadas en una bandeja más grande (540 mm x 285 mm x 60 mm).
3. Sembrar una o dos semillas de N. benthamiana 16c sobre la superficie del suelo de cada maceta. Cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen.
4. Coloque la bandeja bajo cámaras de crecimiento de luz y temperatura controlada con una temperatura de 23 a 25 oC, una humedad relativa del 50 a 60 % y un fotoperiodo de día largo (14 h de luz/10 h de oscuridad, con iluminación de 130 a 150 oC^-2s^-1).
5. Quítese la cúpula de plástico después de que las semillas germinen (3 x 4 días) y permita que las plántulas crezcan en las mismas condiciones utilizadas para el paso de germinación.
6. Añadir una cantidad adecuada de agua, manteniendo el suelo húmedo pero no empapado, cada 2 x 3 días; añadir fertilizante cada 10 días para promover un mayor crecimiento. Mantener las plantas de N. benthamiana 16c en condiciones normales hasta que estén listas para su uso; en esta etapa la planta debe tener al menos cinco hojas verdaderas completamente desarrolladas y no visible axilar o brotes de flores, y las hojas deben tener un aspecto verde saludable).
7. Utilice hojas de 3 a 4 semanas de n. benthamiana 16c para ensayos locales de silenciamiento de ARN, y plantas jóvenes de N. benthamiana 16c (10-14 días de edad) para ensayos sistémicos de silenciamiento de ARN.
   NOTA: Las condiciones e instalaciones de crecimiento de las plantas varían según los laboratorios; elegir hojas sanas, bien desarrolladas y completamente expandidas para la infiltración.

3. Preparación del cultivo de Agrobacterium para la infiltración

1. Escoge una colonia positiva de la placa LB e inocula las células en un tubo de vidrio que contiene 5 ml de medio LB complementado con kanamicina de 50 g/ml y rifampicina de 50 g/ml. Cultivar las células a 30 oC con agitación a 200 rpm durante 24 x 48 h.
2. Transferir 100 l de cultivo a 5 ml de medio de LB suplementado con los mismos antibióticos, 10 mM 2-(N-morpholino) ácido etanosulfónico (MES; pH 5.6) y 20 m acetosyringone (AS). Cultivar bacterias a 30 oC con agitación a 200 rpm durante 16 x 20 h.
3. Células centrífugas a 4.000 x g durante 10 min. Vierta el sobrenadante y resuspenda el pellet en 2 ml de tampón MgCl₂ de 10 mM.
4. Repita el paso 3.3 para asegurar la eliminación completa de antibióticos.
5. Determinar la densidad del cultivo de Agrobacterium midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD_600). Ajustar a un OD₆₀₀ de 1.5 x 2.0 con 10 mM MgCl₂ tampón.
6. Añadir 10 mM MES (pH 5.6) y 150 m AS a los cultivos de suspensión final e incubar las células a RT durante al menos 3 horas sin agitar.
   NOTA: No deje los cultivos de suspensión final durante la noche.

4. Co-infiltración N. hojas de benthamiana

1. Mezclar volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contiene 35S-GFP con un cultivo de Agrobacterium que contiene 35S- supresor de virus de mosaico de pepino 2b (CMV2b), efector putativo, o vector vacío (EV).
2. Infíldese cuidadosamente y lentamente las suspensiones mixtas de agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de N. benthamiana 16c utilizando una jeringa sin aguja de 1 ml.
3. Retire la suspensión bacteriana restante de las hojas con limpiaparabrisas de tejido blando y circule los márgenes de los parches infiltrados con una pluma de fabricante.
4. Deje las plantas infiltradas en la cámara de crecimiento en las mismas condiciones de crecimiento.
   NOTA: Por razones de seguridad y salud, se deben usar gafas protectoras y una máscara durante la infiltración. Para evitar la contaminación cruzada, los guantes deben cambiarse o esterilizarse con etanol entre infiltraciones. Normalmente se necesita al menos 1 ml de suspensiones de agrobacterium por hoja para la infiltración. Para el silenciamiento sistémico, se requerirán al menos dos hojas para la infiltración.

5. Análisis de imágenes GFP

1. Detectar visualmente la fluorescencia GFP en hojas recién cultivadas de plantas enteras 2 semanas después de la infiltración (para el silenciamiento sistémico del ARN) o parches infiltrados de hojas de 3 x 4 ppp utilizando una lámpara ultravioleta de onda larga (UV) sin colección de hojas.
2. Fotografía recogida plantas y / o hojas separadas con una cámara digital equipada con filtros UV y amarillos.
   NOTA: Para los ensayos de supresión de silenciamiento local, investigue parches infiltrados de hojas de N. benthamiana 16c, mientras que para la actividad de supresión de silenciamiento sistémico, investigue las hojas recién cultivadas. La actividad de supresión del silenciamiento del ARN puede variar según los efectores individuales. Por lo tanto, observe los parches o hojas durante unos días a partir de 3 dpi. Utilice CMV2b y EV como controles positivos y negativos, respectivamente.

6. Análisis de la mancha del norte de los niveles de ARNm de la PFP en las hojas infiltradas

1. Aislamiento del ARN total del tejido de la hoja utilizando el reactivo de aislamiento de ARN(Tabla de materiales)
   1. Recoger los tejidos de las hojas de parches infiltrados de N. benthamiana 16c a 4 x 7 dpi, pulverizar en nitrógeno líquido a un polvo fino, y transferir el polvo a un tubo estéril de 2 ml.
   2. Añadir el reactivo de aislamiento de ARN (1 ml/100 mg de tejido) inmediatamente al tubo muestreado en una campana, agitar vigorosamente para homogeneizar e incubar a RT durante 5 min.
   3. Añadir cloroformo (reactivo de aislamiento de ARN de 200 L/1 ml) a cada tubo de una campana, agitar vigorosamente durante 15 s e incubar a RT durante 5 min. Centrifuge el homogeneato a 12.000 x g durante 15 min a 4 oC.
   4. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNase y deseche el pellet. Añadir 0,7 volumen de isopropanol al sobrenadante, invertir suavemente varias veces e incubar la mezcla a RT durante 10 min.
   5. Precipitar el pellet de ARN por centrifugación a 12.000 x g durante 15 min a 4oC.
   6. Deseche el sobrenadante, lave el pellet con 70% de etanol y seque al aire el pellet en una campana. Disolver el ARN en agua tratada con piropenato (DEPC) incubando en un baño de agua de 65 oC durante 10 a 20 min.
2. Análisis de la mancha del norte del nivel de ARNm de la FPG en las hojas infiltradas
   1. Preparar un gel de agarosa desnaturalante de formaldehdehida del 1,2% en 1 búfer de carrera MOPS.
   2. Mezclar el ARN 1:1 con el tinte de carga de ARN y la desnaturalidad por incubación a 65 oC durante 10 min, enfriar inmediatamente las muestras desnaturalizadas sobre hielo durante 1 min.
   3. Cargue las muestras en el gel y electroforrese a 100 V durante 50 minutos hasta que el ARN esté bien separado.
   4. Enjuague el gel en 20x tampón de citrato salino-sódico (SSC) para eliminar el formaldehído y transferir el gel a la membrana de nylon por transferencia capilar en 20x tampón SSC durante la noche. Sumerja la membrana en 2x SSC y fije el ARN a la membrana exponiendo la membrana húmeda a la unión uv..
   5. Añadir la cantidad adecuada de tampón de hibridación (10 ml por membrana de 100 cm^2; Tabla de Materiales) en un tubo de hibridación y agitar a 60 oC en un horno de hibridación.
   6. Poner la membrana en el tubo de hibridación e incubar durante 60 min a 60oC. Diluir una sonda de ADN con etiqueta 5'DIG (concentración final, 50 ng/ml) en la solución de hibridación que contiene un búfer de hibridación precalentado.
   7. Deseche el búfer de prehibridación y sustitúyalo inmediatamente por una solución de hibridación precalentada que contenga la sonda con la etiqueta DIG. Incubar la mancha con sonda a 60oC durante la noche, con una agitación suave.
   8. Después de la hibridación, lavar la membrana dos veces en tampones de creciente rigente a 60 oC durante 20 minutos cada uno. Limpie suavemente la membrana para eliminar el tampón de lavado adicional y añadir los reactivos como se sugiere en el kit de hibridación y detección quimioluminiscente(Tabla de materiales).
   9. Detectar señales hibridadas por reacción quimioluminiscente combinada con el sistema de imágenes.

Resultados

Arriba, describimos el procedimiento paso a paso para un ensayo de cribado mejorado para evaluar la actividad RSS de los efectores De P. sojae RxLR. En total, el experimento toma de 5 a 6 semanas. Posteriormente, los RSS identificados por el ensayo pueden caracterizarse aún más en términos de función y mecanismo molecular. Como ejemplo de nuestro enfoque, utilizamos el supresor Phytophthora de P. sojae RxLR effecto de silenciamiento de ARN 1 (PSR1), que se secreta y ...

Discusión

El silenciamiento de ARN es un mecanismo de defensa clave empleado por las plantas para combatir patógenos virales, bacterianos, oomycete y hongos. A su vez, estos microbios han evolucionado las proteínas supresoras de silenciamiento para contrarrestar el silenciamiento antiviral, y estos RSS interfieren con diferentes pasos de la vía de silenciamiento del ARN^22,23. Se han desarrollado varios ensayos de cribado para identificar los RSS^10.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern