הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

Summary

כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.

Abstract

רנ א השתקה הוא שימור אבולוציונית, רצף ספציפי מנגנון רגולציה הגנים ב eukaryotes. פתוגנים צמחים מספר התפתחו חלבונים עם היכולת לעכב את המפעל מארח RNA השתקה המסלול. שלא כמו חלבונים אפקטור וירוס, רק מספר חלבונים אפקטור מופרש הראו את היכולת לדכא RNA השתקה בקטריאלי, o, ופטריות ופתוגנים, ואת הפונקציות המולקולריות של רוב העריקים להישאר ידועים ברובו. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט גרסה שונה מעט של השינוי החדירה שיתוף שיכול לשמש כשיטה כללית להתבוננות RNA השתקה ולאפיון חלבונים אפקטור מופרש על ידי פתוגנים צמחים. השלבים העיקריים של הגישה הם בחירת העלים בריאים ומפותחים באופן מלא, התאמת התרבות חיידקים לדחיסות אופטית המתאימה (OD) ב 600 ננומטר, והתבוננות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) זריחה בזמן האופטימלי על החדר המתאים העלים על מנת למנוע השמטת עריקים בפעילות דיכוי חלשה. פרוטוקול משופר זה יתרום מהירה, מדויקת, הקרנה נרחבת של RNA השתקה דכאי ולשמש נקודת התחלה מצוינת לחקירת פונקציות מולקולריות של חלבונים אלה.

Introduction

במהלך שני העשורים האחרונים, האצת רצף הגנום של מיקרואורגניזמים הגורמות מחלות צמחים הוביל פער ידע הולך וגובר בין מידע רצף ופונקציות ביולוגיות של חלבונים מקודד¹. בין המולקולות שנחשפו על-ידי פרויקטים ברצף הם מולקולות אפקטור לדכא חסינות מולדת ולהקל על הקולוניזציה המארחת; גורמים אלה מופרשים על ידי פתוגנים צמחים הרסניים, כולל חיידקים, nematodes, וחיידקים filamentous. כדי להגיב על איומים אלה, צמחים מארחים התפתחו קולטני הרומן המכירים את העריקים האלה, המאפשרים שחזור של התגובה החיסונית. מכאן, העריקים כפופים ללחצים סלקטיבית שונים, המוביל לגיוון של אפקטור repertoires בקרב הפתוגן שנים². בשנים האחרונות, מנטרל מפתוגנים צמחים הוכחו לשבש הצמח חסינות מולדים על ידי הפרעה תהליכים סלולריים מארח לטובת חיידקים במגוון דרכים, כולל דיסרגולציה של איתות מסלולים, תמלול, הובלה תאיים, יציבות השלד, שלפוחית הסחר, ו RNA השתקה^3,4,5. עם זאת, הרוב המכריע של העריקים הפתוגן, במיוחד אלה של פתוגנים filamentous, נותרו מחוחימים.

רנ א השתקה היא הומולוגיה-בתיווך גן מכונות ההפעלה כי הוא שימור בין eukaryotes. התהליך מופעל על ידי ארוך כפול תקועים RNA (dsRNA) ומטרות RNA הומוולוגי יחיד תקוע (ssRNA) באופן ספציפי רצף, והיא מפעילה מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל הגנה אנטי ויראליות⁶. כדי להתגבר על התגובות החיסונית הטבועה של המארח, וירוסים מסוימים התפתחו לקזז RNA השתקה, כולל היכולת לשכפל בתוך התאים תאיים או לברוח מהאות מאורגן מראש. אף על פי כן, האסטרטגיה הכללית ביותר שבה וירוסים להגן על גנום שלהם נגד rna השתקה תלוי אובדן של הפונקציה gene היא לקודד חלבונים ספציפיים לדכא rna השתקה^7,8. מספר גישות שונות של מכניזיות הוקמו על המסך ואיפיון דכאי ויראלי של RNA השתקה (vsrs), כולל הסתננות של agrobacterium התרבויות tumefaciens , צמחים טרנסגניים להביע דכאי, השתלה ותרבות התא^{9,10,11,12,13}.

לכל אחד מאותם מספר יש יתרונות וחסרונות, ומזהה VSRs באופן ייחודי משלו. אחת הגישות הנפוצות ביותר מבוססת על חדירה משותפת של הפרט A. tמואfaciens תרבויות מחסה את החלבון הנגיפי הפוטנציאלי גן עיתונאי (בדרך כלל חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) על טבק benthamiana 16c צמחים ביטוי המבטא gfp תחת השליטה של וירוס פסיפס כרובית של מקדם 35. בהעדר משתיק קול ויראלי פעיל, GFP מזוהה כאקסוגני על ידי התאים המארחים והוא מושתק בתוך 3 ימים לאחר הסתננות (dpi). לעומת זאת, אם החלבון הנגיפי מחזיק בפעילות הדיכוי, רמת הביטוי של GFP נותרת יציבה מעבר ל -3 עד 9 dpi⁹. שיתוף החדירה המשותף הזה הוא פשוט ומהיר; עם זאת, הוא לא יציב מאוד ולא רגיש. עם זאת, את השיטת זיהה vsrs רבים עם רצפי חלבון מגוונים ומבנים רבים RNA וירוסים^7,8.

לאחרונה, כמה חלבונים אפקטור שיכולים לעכב את הפעילות התאית השתקה הסלולר כבר מאופיין חיידקי, o, ופטריות צמח פתוגנים^14,15,16. ממצאים אלה משתמע כי רנ א השתקה הדיכוי היא אסטרטגיה נפוצה להקלה על זיהום המשמש פתוגנים ברוב הממלכות. בתאוריה, רבים, אם לא כולם, של העריקים עשויים לקודד RNA השתקה דכאי (RSSs); עד כה, לעומת זאת, רק מעטים זוהו, בעיקר בשל המחסור באסטרטגיית ההקרנה האמינה והכללית. יתר על כן, דכאי של RNA השתקה לא נחקרו ברוב המכריע של פתוגנים צמחים¹⁷.

בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב וכללי לזיהוי הפתוגן הגורם למחלה שיכול לדכא RNA מקומי ומערכתי השתקה באמצעות שיטת החדירה אגרו. המטרה הראשונה של מחקר זה הייתה להדגיש את ההיבטים המרכזיים של הפרוטוקול ולתאר את השלבים בפרוטרוט, ובכך לספק מבחן הקרנה המתאים לכמעט כל העריקים של פתוגנים צמחיים.

Protocol

הערה: יש לנהל את כל השלבים של ההליך בטמפרטורת החדר (RT).

התראה: הפקדת כל המדיה המכילה חיידקים פתוגניים, כמו גם את הצמחים ורקמת הצמח המשמשים בתוך המנה, אל מיכלי הפסולת המתאימים והחיטוי לפני השלכת.

1. הכנת מבני פלמנא המכילים מפעריקים

1. בחר מפרשים מופרשים שמבטאים במידה רבה במהלך ההדבקה, כפי שנקבע על-ידי רצפי RNA (RNA-Seq), ועוד בטכניקת ה-PCR (רביעיית-PCR) בזמן אמת כמותי.
2. לקבוע את אתר המחשוף פפטיד האות של כל אפקטור באמצעות כלי תוכנה כגון סיאלפ¹⁸.
3. עיצוב התחל ולבצע PCR כדי להגביר את הקידוד של הסקרנות הריבית באמצעות דנ א בנאמנות גבוהה פולימראז. בצע ביצוע אלקטרופורזה ג'ל כדי לבדוק את מוצר ה-PCR, לאחר מכן לשכפל את אמפליקון לתוך הכניסה וקטור השער pQBV3 באמצעות ערכת השכפול ללא הארכה (טבלה של חומרים), ולאחר מכן לתוך ביטוי היעד וקטור pEG100 באמצעות התגובה של LR שילוב חוזר¹⁹.
4. המרה 3-5 μL של תערובת התגובה LR לתוך 100 μL של תאים המוסמכת של E. coli (למשל, TOP10, DH5α), להפיץ את התאים החיידקיים שהפכו על לוריא-ברטני (LB) אגר בינוני עם 50 Μg/mL kanamycin, ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 16 על 20 h.
   הערה: ניתן לזהות transformants חיובית על-ידי המושבה ה-PCR²⁰ ולאחר מכן נותחו על-ידי מיני-ביניים ורצף.
5. הציגו 50 למעלה מ-100 מרקומביננטי פלמידים שנושאים חלבון לתוך 100 μL של תאים כימיים המוסמכים בתאי tumefaciens (למשל , GV3101 או C58C1), לערבב בעדינות, ולאחר מכן להקפיא בחנקן נוזלי עבור 1 דקות. הפשרת התאים באמבט מים בגודל 37 ° c עבור 5 דקות.
6. הוסף 500 μL של ציר ליברות ו-דגירה ב 30 ° צ' עבור 4 לל6 h עם טלטול עדין, ולאחר מכן להעביר ולהפיץ את כל התאים agrobacteria על LB אגר בינוני עם 50 μg/mL kanamycin ו 50 μg/mL גריסופלובין ב 30 ° צ' עבור 2 ימים.
   הערה: ניתן לאמת שכפולים חיוביים על-ידי המושבה PCR.
7. השתמש מושבה אחת השתנה לניסויים אגרו-הסתננות אלא אם כן ביים אחרת.
   הערה: במחקר הנוכחי, אף אחד מהגנים שנבדקו לא הכיל introns חזוי; כל אחד הגנים הוגדל ישירות מ-DNA גנומית של Phytophthora sojae בודד. וקטור ביטוי של צמח שער ללא תג מומלץ, אך לא נחוץ.

2. הכנת המפעלים של N. benthamiana 16c

1. הכנת תערובות קרקע השתילה המורכב (על ידי נפח) 50% כבול איזוב, 30% perlite, ו 20% ורמיקוליט, ו החיטוי ב 120 ° c עבור 20 דקות.
2. לטבול תערובות קרקע אוטומטית עם פתרון דשן הצמח (1 g/L) ו-sub-חבילה אותם לסירים קטנים יותר (80 מ"מ x 80 mm x 75 מ"מ) מאוחסן מגש גדול יותר (540 mm x 285 mm x 60 מ"מ).
3. זרוע זרעי אחד או שניים של N. benthamiana 16c על פני הקרקע של כל סיר. לכסות את המגש עם כיפת פלסטיק ולאפשר זרעים כדי לנבוט.
4. מניחים את המגש מתחת לתאי הצמיחה בשליטה קלה ובטמפרטורה בטמפרטורה של 23 עד 25 ° c, 50 לחות יחסית של 60%, ו-photoperiod ליום ארוך (14 שעות אור/10 שחור כהה, עם תאורה ב 130-150 μE · m^-2s^-1).
5. הניחו את הכיפה הפלסטית לאחר הזרעים לנבוט (3-4 ימים) ולאפשר לשתילים לצמוח תחת אותם התנאים ששימשו לשלב הנביטה.
6. להוסיף כמות מתאימה של מים, שמירה על הקרקע לחות אך לא לטבילה, כל 2-3 ימים; להוסיף דשן כל 10 ימים כדי לקדם צמיחה נוספת. שמור על N. benthamiana 16c צמחים בתנאים נורמליים עד שהם מוכנים לשימוש; בשלב זה המפעל צריך להיות לפחות חמישה עלים אמיתיים מפותחים לחלוטין לא נראה בבית השחי או ניצנים הפרח, ואת העלים צריך מראה ירוק בריא).
7. השימוש 3 לשבוע 4 עלים של N. benthamiana 16c עבור רנ א המקומי השתקה מספר, וצעירים N. benthamiana 16c צמחים (10 למשך 14 ימים) עבור RNA מערכתית השתקה האומר.
   הערה: תנאי הצמיחה והמתקנים של הצמח משתנים באמצעות מעבדות; לבחור בריא, מפותח ומורחב לחלוטין עלים לחדירה.

3. הכנת תרבות אגרובאכטריום לחדירה

1. בחר מושבה חיובית מן הצלחת ליברות ולאחר התאים לתוך שפופרת זכוכית המכילה 5 מ ל של LB בינונית בתוספת עם 50 μg/mL kanamycin ו 50 μg/mL גריסופלובין. הגדל את התאים במהירות 30 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 24 עד 48 שעות.
2. העברת 100 μL של התרבות לתוך 5 מ ל של ליברות בינונית בתוספת אנטיביוטיקה זהה, 10 מ"מ 2-(N-גווראולנו) חומצה ethanesulfonic (MES; pH 5.6) ו 20 μM acetosyringone (AS). גידול חיידקים ב 30 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 16 לל20 h.
3. בתאי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות. יוצקים את supernatant ולהשעות את הגלולה ב 2 מ מ של 10 מ"מ MgCl₂ מאגר.
4. חזור על שלב 3.3 כדי להבטיח הסרה מלאה של אנטיביוטיקה.
5. לקבוע את הצפיפות של התרבות Agrobacterium על ידי מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD₆₀₀). התאם ל-OD₆₀₀ של 1.5-2.0 עם מאגר 10 מ"מ MgCl₂ .
6. הוסף 10 מ"מ MES (pH 5.6) ו 150 μM באשר לתרבויות ההשעיה הסופית והוא דגירה את התאים ב-RT עבור לפחות 3 שעות מבלי לרעוד.
   הערה: אל תשאירו את התרבות ההשעיה הסופית בלילה.

4. שיתוף הסתננות N. benthamiana עוזב

1. מערבבים כמויות שוות של תרבות Agrobacterium המכילה 35 s-gfp עם תרבות Agrobacterium המכילה 35 s-מלפפון פסיפס וירוס משתיק קול 2b (CMV2b), וקטור, או ריק (EV).
2. בזהירות ובאיטיות לחדור את השרגיום מעורב השעיות על הצדדים הדו של N. benthamiana 16c העלים באמצעות מזרק אחד שזקוק ל-mL.
3. הסר את הבולם החיידקי הנותרים מן העלים עם מנקי רקמות רך להקיף את השוליים של טלאים חדרו עם עט maker.
4. השאירו את הצמחים החדרו בחדר הצמיחה באותו תנאי גדילה.
   הערה: למטרות בטיחות ובריאות, משקפי העין המגן ומסכה יש לענוד במהלך הסתננות. כדי למנוע זיהום, כפפות יש לשנות או לעקר עם אתנול בין חדירות. בדרך כלל לפחות 1 מ ל של agrobacterium שתלים לעלה נדרש הסתננות. עבור השתקה מערכתית, לפחות שני עלים יידרשו לחדירה.

5. ניתוח הדמיה של GFP

1. באופן חזותי לזהות הזריחה GFP בעלים החדשים של צמחים שלמים 2 שבועות לאחר הסתננות (עבור RNA מערכתית השתקה) או כתמי החדרו של עלים 3 על 4 dpi באמצעות אולטרה סגול גל (UV) מנורה ללא העלים אוסף.
2. צילום הצמחים שנאספו ו/או מנותקת עלים עם מצלמה דיגיטלית מצויד הן UV ומסננים צהובים.
   הערה: לצורך השתקה של דיכוי ההשתקה המקומי, יש לחקור כתמים שחדרו לתוך העלים של N. benthamiana 16c, ואילו עבור פעילות לדיכוי מערכתית, לחקור עלים חדשים שגדלו. הפעילות הדחקה של רנ א עשויה להשתנות בהתאם לעריקים בודדים. לכן, התבונן במדבקות או בעלים במשך מספר ימים החל מ-3 dpi. השתמש ב-CMV2b ו-EV כפקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה.

6. בדיקת כתמי הצפון של רמות הטיפול

1. בידוד של RNA כולל מרקמת עלה באמצעות מגיב בידוד RNA (טבלת חומרים)
   1. לאסוף רקמות עלים מתוך N. benthamiana 16c טלאים על 4 לפחות 7 dpi, לרסק בחנקן נוזלי לאבקה משובחת, ולהעביר את האבקה לצינור סטרילי 2 מ ל.
   2. הוסף את מגיב בידוד RNA (1 mL/100 מ ג רקמת) מיד לצינור שנדגמו במכסה המנוע, לנער במרץ כדי הומואכל, ו דגירה ב RT עבור 5 דקות.
   3. הוספת כלורופורם (200 μL/1 מ"ל בידוד RNA) לכל צינור במכסה המנוע, לנער במרץ עבור 15 s, ו-דגירה ב-RT עבור 5 דקות. צנטריפוגה את המגון ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
   4. להעביר את supernatant לתוך צינור חדש RNase-חינם ולמחוק את הגלולה. הוסף 0.7 נפח של איזופנול ל-supernatant, להפוך בעדינות מספר פעמים, ו דגירה את התערובת ב-RT עבור 10 דקות.
   5. מזרז את הגלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
   6. להיפטר supernatant, לשטוף את הגלולה עם 70% אתנול, ולייבש את הגלולה במכסה המנוע. לפזר את ה-RNA ב דיאתיל פירוקרבונט (depc)-מים שטופלו על ידי דגירה ב 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עבור 10-20 דקות.
2. בדיקת כתמי הצפון של רמת הקרקע של GFP בעלי החדרו
   1. להכין 1.2% פורמלדהיד הפעלת ג'ל ב-1x מגבים פועל מאגר.
   2. מערבבים RNA 1:1 עם צבע העמסה של RNA והד, באמצעות הדגירה של 65 ° צ' במשך 10 דקות, מיד לצנן את דגימות denat, על הקרח 1 דקות.
   3. טען את הדגימות על ג'ל ואלקטרופורמית ב 100 V עבור 50 דקות עד RNA הוא מופרד היטב.
   4. לשטוף את הג ב-20x מלוחים-נתרן ציטראט מאגר להסיר פורמלדהיד ולהעביר את ג'ל קרום ניילון על ידי העברת קפילר ב 20x מאגר המטה לילה. להשרות את הקרום ב-2x מהאס. בי. או לתקן את ה-RNA לקרום ידי חשיפת קרום רטוב כדי הקישור לחצות UV.
   5. הוסף את הכמות המתאימה של מאגר הכלאה (10 מ"ל לכל 100 ס מ² קרום; רשימת חומרים) בצינור הכלאה ומתפרעים ב-60 ° c בתנור הכלאה.
   6. הכניסו את הקרום לתוך צינור היברידיזציה ו הדגירה עבור 60 דקות ב 60 ° c. לדלל בדיקה 5 ' לחפור בתווית DNA (הריכוז הסופי, 50 ng/mL) לתוך פתרון הכלאה המכיל מאגר הכלאה מראש.
   7. מחק את המאגר הטרום-הכלאה והחלף מיד עם פתרון הכלאה מראש המכיל את הגשוש בעל תווית החפירה. מיכל האבן החשופה עם לווין ב-60 ° c בלילה, עם עצבנות עדינה.
   8. לאחר הכלאה, רוחצים את הקרום פעמיים במאגרים של הגברת החריפות ב-60 ° c עבור 20 דקות כל אחד. בעדינות לנגב את הקרום כדי להסיר מאגר כביסה נוספת ולהוסיף ריאגנטים כפי שהוצע הכלאה היבריריזציה ואת ערכת האיתור (טבלת חומרים).
   9. לזהות אותות הוכלא על ידי תגובת כימושימינטאת בשילוב עם מערכת הדמיה.

תוצאות

לעיל, אנו מתארים את ההליך צעד אחר צעד עבור שיטת הקרנה משופרת להערכת פעילות ה-RSS של P. sojae rxlr מעריקים. בסך הכל, הניסוי נמשך 5-6 שבועות. לאחר מכן, הRSSs המזוהה על-ידי הבחינה יכולה להיות מאופיינת עוד יותר במונחים של פונקציה ומנגנון מולקולרי. כדוגמה לגישה שלנו, השתמשנו P. sojae ...

Discussion

רנ א השתקה הוא מנגנון הגנה מפתח המועסקים על ידי צמחים להילחם ויראלי, חיידקי, o, ופתוגנים פטרייתי. בתורו, החיידקים האלה התפתחו חלבונים מדכא השתקה כדי לנטרל נגיפים השתקה, ואת אלה RSSs להפריע לשלבים שונים של השביל השתקה RNA^22,23. כמה הקרנת ההקרנה פותחו כדי לזהות RSSs

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern