Dépistage et identification des suppresseurs de silençage de l'ARN des agents d'effets sécrétés des pathogènes végétaux

Résumé

Ici, nous présentons une méthode de criblage modifiée qui peut être employée intensivement pour examiner rapidement des suppresseurs de silençage d'ARN dans les agents pathogènes de plante.

Résumé

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de régulation génétique spécifique à la séquence conservé par évolution chez les eucaryotes. Plusieurs pathogènes végétaux ont développé des protéines avec la capacité d'inhiber la voie de silençage de l'ARN de la plante hôte. À la différence des protéines d'effecteur de virus, seulement plusieurs protéines d'effectrice sécrétées ont montré la capacité de supprimer le silençage d'ARN dans les agents pathogènes bactériens, de oomycète, et de fongique, et les fonctions moléculaires de la plupart des effecteurs restent largement inconnues. Ici, nous décrivons en détail une version légèrement modifiée de l'assay de co-infiltration qui pourrait servir de méthode générale pour observer le silençage d'ARN et pour caractériser des protéines effectorssées par des pathogènes végétaux. Les étapes clés de l'approche sont le choix des feuilles saines et entièrement développées, l'ajustement de la culture bactérienne à la densité optique appropriée (OD) à 600 nm, et l'observation de la fluorescence des protéines fluorescentes vertes (GFP) au moment optimal sur l'infiltré pour éviter d'omettre les effecteurs ayant une faible activité de suppression. Ce protocole amélioré contribuera à un dépistage rapide, précis et étendu des suppresseurs de silençage de l'ARN et servira d'excellent point de départ pour étudier les fonctions moléculaires de ces protéines.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, l'accélération du séquençage du génome des micro-organismes qui causent les maladies des plantes a conduit à un écart de connaissances de plus en plus important entre l'information sur la séquence et les fonctions biologiques des protéines codées¹. Parmi les molécules révélées par les projets de séquençage sont des molécules effectrices qui suppriment l'immunité innée et facilitent la colonisation de l'hôte; ces facteurs sont sécrétés par des agents pathogènes végétaux destructeurs, y compris les bactéries, les nématodes et les microbes filamenteux. Pour répondre à ces menaces, les plantes hôtes ont développé de nouveaux récepteurs qui reconnaissent ces effecteurs, permettant la restauration de la réponse immunitaire. Par conséquent, les effecteurs sont soumis à diverses pressions sélectives, ce qui conduit à la diversification des répertoires effecteurs parmi les lignées pathogènes². Ces dernières années, il a été démontré que les effecteurs putatifs des pathogènes végétaux perturbent l'immunité innée des plantes en empêchant les processus cellulaires de l'hôte de bénéficier aux microbes de diverses façons, y compris la dysrégulation des voies de signalisation, la transcription, le transport intracellulaire, la stabilité du cytosquelette, le trafic de vésicules et le silençage de l'ARN^3,4,5. Cependant, la grande majorité des effecteurs pathogènes, en particulier ceux des agents pathogènes filamenteux, sont restés énigmatiques.

Le silençage de l'ARN est une machinerie d'inactivation génique médiée par l'homologie qui est conservée chez les eucaryotes. Le processus est déclenché par de longs ARN à double brin (dsRNA) et cible l'ARN homologue à brin unique (ARS) d'une manière spécifique à la séquence, et il manipule un large éventail de processus biologiques, y compris la défense antivirale⁶. Pour surmonter les réponses immunitaires innées de l'hôte, certains virus ont évolué pour compenser le silençage de l'ARN, y compris la capacité de se répliquer à l'intérieur des compartiments intracellulaires ou de s'échapper du signal réorganisé au silençage. Néanmoins, la stratégie la plus générale par laquelle les virus protègent leurs génomes contre la perte dépendante du silençage de l'ARN de la fonction génique est d'encoder des protéines spécifiques qui suppriment le silençage de l'ARN^7,8. Plusieurs approches mécanistes différentes ont été établies pour dépister et caractériser les suppresseurs viraux du silençage de l'ARN (RsS), y compris la co-infiltration des cultures tumefaciens Agrobacterium, les plantes transgéniques exprimant les suppresseurs putatifs, la greffe et la culture cellulaire^{9,10,11,12,13}.

Chacun de ces essais présente des avantages et des inconvénients et identifie les RsV de façon distincte. L'une des approches les plus courantes est basée sur la co-infiltration de cultures individuelles A. tmuefaciens hébergeant la protéine virale potentielle et un gène reporter (protéine fluorescente typiquement verte [GFP]) sur les plantes Nicotiana benthamiana 16c exprimant constitutivement GFP sous le contrôle du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S promoteur. En l'absence d'un suppresseur de silençage viral actif, le GFP est identifié comme exogène par les cellules hôtes et est réduit au silence dans les 3 jours suivant l'infiltration (dpi). En revanche, si la protéine virale possède une activité de suppression, le niveau d'expression du GFP reste stable au-delà de 3 à 9 dpi⁹. Ce test de co-infiltration est simple et rapide; cependant, il n'est ni très stable ni sensible. Néanmoins, l'assay a identifié de nombreux RsV avec diverses séquences et structures de protéines dans de nombreux virus de l'ARN^7,8.

Récemment, plusieurs protéines effectrices qui peuvent inhiber l'activité de silençage de l'ARN cellulaire ont été caractérisées par des pathogènes bactériens, oomycètes et plantes fongiques^14,15,16. Ces résultats impliquent que la suppression de silençage d'ARN est une stratégie commune pour faciliter l'infection qui est employée par des agents pathogènes dans la plupart des royaumes. En théorie, beaucoup, sinon tous, des effecteurs pourraient encoder suppresseurs de silençage d'ARN (RSSs); à ce jour, cependant, seuls quelques-uns ont été identifiés, principalement en raison de la pénurie de la stratégie de dépistage fiable et générale. En outre, les suppresseurs du silençage d'ARN n'ont pas été étudiés dans la grande majorité des pathogènes végétaux¹⁷.

Dans ce rapport, nous présentons un protocole optimisé et général pour identifier les effecteurs d'agents pathogènes végétaux qui peuvent supprimer le silençage local et systémique d'ARN utilisant l'analyse d'agro-infiltration. L'objectif principal de cette étude était de mettre l'accent sur les aspects clés du protocole et de décrire les étapes en détail, fournissant ainsi un test de dépistage qui convient à presque tous les effecteurs d'agents pathogènes végétaux.

Protocole

REMARQUE : Toutes les étapes de la procédure doivent être effectuées à température ambiante (RT).

CAUTION: Déposer tous les supports contenant des microbes pathogènes, ainsi que les plantes et les tissus végétaux utilisés dans l'analyse, dans les conteneurs de déchets appropriés et autoclave avant de jeter.

1. Préparation de constructions plasmides contenant des effecteurs putatifs

1. Sélectionnez les effecteurs sécrétés putatifs qui sont fortement exprimés pendant l'infection, tel que déterminé par le séquençage d'ARN (ARN-Seq), et plus loin par la technique quantitative de PCR en temps réel (qRT-PCR).
2. Déterminer le site de clivage peptide de signal de chaque effecteur à l'aide d'un outil logiciel tel que SignalP¹⁸.
3. Concevoir des amorces et effectuer PCR pour amplifier le gène codant l'effecteur d'intérêt à l'aide de polymérase d'ADN haute fidélité. Effectuer l'électrophorèse gel agarose pour vérifier le produit PCR, puis cloner l'amplicon dans Gateway entrée vector pQBV3 en utilisant le kit de clonage sans ligature (Tableau des matériaux), et par la suite dans le vecteur d'expression de destination pEG100 en utilisant la réaction de recombinaison LR¹⁹.
4. Transformez le mélange de réaction LR en 100 oL de cellules E. coli compétentes (p. ex. TOP10, DH5MD), répandez les cellules bactériennes transformées sur le milieu d'agar Luria-Bertani (LB) complété par une kanamycine de 50 g/mL, et incubez à 37 oC pendant 16 à 20 h.
   REMARQUE : Les transformateurs positifs peuvent être identifiés par la colonie PCR²⁰ et analysés plus en détail par minipréparation et séquençage plasmides.
5. Introduire 50 à 100 ng de plasmides recombinants transportant des protéines effectrices dans 100 l de cellules A. tumefaciens chimiquement compétentes (p. ex. GV3101 ou C58C1), mélanger délicatement, puis congeler dans de l'azote liquide pendant 1 min. Dégeler les cellules dans un bain d'eau de 37 oC pendant 5 min.
6. Ajouter 500 lde de bouillon LB et incuber à 30 oC pendant 4 à 6 h avec des secousses douces, puis transférer et étendre toutes les cellules d'agrobactéries sur le milieu de l'agar LB complétée s'ajouter à 50 g/mL de kanamycine et 50 g/mL de rifampicin à 30 oC pendant 2 jours.
   REMARQUE : Les clones positifs peuvent être vérifiés par la colonie PCR.
7. Utilisez une seule colonie transformée pour des expériences d'agro-infiltration, sauf indication contraire.
   REMARQUE : Dans la présente recherche, aucun des gènes effecteurs testés ne contenait d'introns prédits; chacun des gènes a été directement amplifié à partir de l'ADN génomique d'un isolat phytophthora sojae. Un vecteur d'expression de plante Gateway sans aucune étiquette est recommandé, mais pas nécessaire.

2. Préparation des plantes N. benthamiana 16c

1. Préparer des mélanges de sol en pot composés de (en volume) 50% de mousse de tourbe, 30% de perlite, et 20% de vermiculite, et autoclave à 120 oC pendant 20 min.
2. Tremper les mélanges de sol autoclave avec la solution d'engrais végétaux (1 g/L) et les sous-emballer dans des pots plus petits (80 mm x 80 mm x 75 mm) stockés dans un plateau plus grand (540 mm x 285 mm x 60 mm).
3. Semez une ou deux graines de N. benthamiana 16c sur la surface du sol de chaque pot. Couvrir le plateau d'un dôme en plastique et laisser germer les graines.
4. Placer le plateau sous des chambres de croissance légères et à température contrôlée avec une température de 23 à 25 oC, une humidité relative de 50 à 60 % et une photopériode longue journée (14 h de lumière/10 h d'obscurité, avec un éclairage à 130 à 150 degrés^{E -2}s^-1).
5. Enlevez le dôme en plastique après la germination des graines (3 à 4 jours) et laissez les semis pousser dans les mêmes conditions que pour l'étape de germination.
6. Ajouter une quantité appropriée d'eau, en gardant le sol humide, mais sans trempage, tous les deux à trois jours; ajouter de l'engrais tous les 10 jours pour favoriser la croissance. Maintenir les plantes N. benthamiana 16c dans des conditions normales jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi; à ce stade, la plante devrait avoir au moins cinq feuilles vraies entièrement développées et aucun bourgeon axillaire ou floral visible, et les feuilles devraient avoir un aspect vert sain).
7. Utilisez des feuilles de N. benthamiana 16c pour les analyses de silençage de l'ARN locales et de jeunes plantes N. benthamiana 16c (10 à 14 jours) pour les analyses de silençage de l'ARN systémique.
   REMARQUE : Les conditions de croissance des installations et les installations varient d'un laboratoire à l'autre; choisir des feuilles saines, bien développées et entièrement élargies pour l'infiltration.

3. Préparation de la culture Agrobacterium pour l'infiltration

1. Choisissez une colonie positive de la plaque LB et inoculez les cellules dans un tube de verre contenant 5 ml de lb-moyen complété par une kanamycine de 50 g/mL et une rifampicine de 50 g/mL. Cultivez les cellules à 30 oC en secouant à 200 tr/min pendant 24 à 48 h.
2. Transférer 100 l de culture dans 5 ml de lb-moyen complété par les mêmes antibiotiques, 10 mM 2-(N-morpholino) d'acide éthanesulfonique (MES; pH 5,6) et 20 'M acetosyringone (AS). Cultivez des bactéries à 30 oC en secouant à 200 tr/min pendant 16 à 20 h.
3. Centrifugeuses cellules à 4 000 x g pendant 10 min. Verser le supernatant et resuspendre la pastille dans 2 ml de 10 mM MgCl₂ tampon.
4. Répétez l'étape 3.3 pour assurer l'élimination complète des antibiotiques.
5. Déterminer la densité de la culture Agrobacterium en mesurant la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀). Ajuster à un OD₆₀₀ de 1,5 à 2,0 avec 10 mM de tampon MgCl_2.
6. Ajouter 10 mM MES (pH 5.6) et 150 'M AS aux cultures de suspension finale et incuber les cellules à RT pendant au moins 3 h sans trembler.
   REMARQUE: Ne laissez pas les cultures de suspension finale du jour au lendemain.

4. Co-infiltration N. benthamiana feuilles

1. Mélanger des volumes égaux d'une culture Agrobacterium contenant 35S-GFP avec une culture Agrobacterium contenant 35S- concombre mosaïque virus suppresseur 2b (CMV2b), effecteur putatif, ou vecteur vide (EV).
2. Infiltrer soigneusement et lentement les suspensions d'agrobacterium mixtes sur les côtés abaxiaux des feuilles de N. benthamiana 16c à l'aide d'une seringue sans aiguille de 1 ml.
3. Retirez la suspension bactérienne restante des feuilles avec des essuie-glaces mous et encerclez les marges des patchs infiltrés avec un stylo de fabricant.
4. Laissez les plantes infiltrées dans la chambre de croissance dans les mêmes conditions de croissance.
   REMARQUE : Pour des raisons de sécurité et de santé, des lunettes de protection et un masque doivent être portés pendant l'infiltration. Pour prévenir la contamination croisée, les gants doivent être changés ou stérilisés avec de l'éthanol entre les infiltrations. Normalement, au moins 1 ml de suspensions d'agrobacterium par feuille est nécessaire pour l'infiltration. Pour le silence systémique, au moins deux feuilles seront nécessaires pour l'infiltration.

5. Analyse d'imagerie GFP

1. Détecter visuellement la fluorescence du GFP dans les feuilles nouvellement cultivées de plantes entières 2 semaines après l'infiltration (pour le silençage systémique de l'ARN) ou des plaques infiltrées de feuilles 3-4 dpi à l'aide d'une lampe ultraviolette à ondes longues (UV) sans prélèvement de feuilles.
2. Photographie de plantes et/ou de feuilles détachées avec un appareil photo numérique équipé de filtres UV et jaunes.
   REMARQUE : Pour les essais de suppression locale de silence, enquêter sur les taches infiltrées des feuilles de N. benthamiana 16c, tandis que pour l'activité systémique de suppression de silence, enquêter sur les feuilles nouvellement cultivées. L'activité de suppression de silençage d'ARN peut varier selon les effecteurs individuels. Par conséquent, observez les taches ou les feuilles sur quelques jours à partir de 3 dpi. Utilisez cMV2b et EV comme contrôles positifs et négatifs, respectivement.

6. Analyse de tache nordique des niveaux d'ARNm de GFP dans les feuilles infiltrées

1. Isolement de l'ARN total du tissu foliaire à l'aide du réactif d'isolement de l'ARN (Tableau des matériaux)
   1. Recueillir les tissus foliaires des patchs Infiltrés de N. benthamiana 16c à 4 x 7 dpi, pulvériser dans l'azote liquide en poudre fine, et transférer la poudre dans un tube stérile de 2 ml.
   2. Ajouter le réactif d'isolement de l'ARN (1 mL/100 mg de tissu) immédiatement au tube échantillonné dans une hotte, secouer vigoureusement pour homogénéner, et couver à RT pendant 5 min.
   3. Ajouter le chloroforme (200 l/1 mL de réagent d'isolement de l'ARN) à chaque tube d'un capot, secouer vigoureusement pendant 15 s et couver à RT pendant 5 min. Centrifuger l'homogénéisation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
   4. Transférer le supernatant dans un nouveau tube sans RNase et jeter la pastille. Ajouter 0,7 volume d'isopropanol au supernatant, inverser doucement plusieurs fois, et incuber le mélange à RT pendant 10 min.
   5. Précipiter le granule d'ARN par centrifugation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
   6. Jeter le supernatant, laver le granule avec 70% d'éthanol et sécher à l'air le granule dans une hotte. Dissoudre l'ARN dans l'eau traitée au pyrocarbonate de diethyl (DEPC) en coucubissant dans un bain d'eau de 65 oC pendant 10 à 20 min.
2. Analyse de tache nordique du niveau d'ARNm de GFP dans les feuilles infiltrées
   1. Préparer un gel agarose dénaturant le formaldéhyde de 1,2 % dans un tampon de fonctionnement MOPS 1x.
   2. Mélanger l'ARN 1:1 avec le colorant de chargement d'ARN et la dénature par incubation à 65 oC pendant 10 min, refroidir immédiatement les échantillons dénaturés sur la glace pendant 1 min.
   3. Chargez les échantillons sur le gel et l'électrophorese à 100 V pendant 50 min jusqu'à ce que l'ARN soit bien séparé.
   4. Rincez le gel dans un tampon 20x de citrate saline-sodium (SSC) pour enlever le formaldéhyde et transférez le gel à la membrane de nylon par transfert capillaire dans le tampon 20x SSC pendant la nuit. Tremper la membrane dans 2x SSC et fixer l'ARN à la membrane en exposant la membrane humide à la liaison transversale UV.
   5. Ajouter la quantité appropriée de tampon d'hybridation (10 ml par 100 cm² membrane; Tableau des matériaux) dans un tube d'hybridation et agiter à 60 oC dans un four d'hybridation.
   6. Mettre la membrane dans le tube d'hybridation et couver pendant 60 min à 60 oC. Diluer une sonde d'ADN étiquetée 5'DIG (concentration finale, 50 ng/mL) dans la solution d'hybridation contenant un tampon d'hybridation préchauffé.
   7. Jetez le tampon de préhybridation et remplacez immédiatement par une solution d'hybridation préchauffée contenant la sonde étiquetée DIG. Incuber la tache avec la sonde à 60 oC pendant la nuit, avec une douce agitation.
   8. Après l'hybridation, laver la membrane deux fois en tampons de la rigueur croissante à 60 oC pendant 20 min chacun. Essuyer doucement la membrane pour enlever le tampon de lavage supplémentaire et ajouter des réactifs comme suggéré dans le kit d'hybridation et de détection chemiluminescente (Tableau des matériaux).
   9. Détecter les signaux hybrides par réaction chemiluminescente combinée avec le système d'imagerie.

Résultats

Ci-dessus, nous décrivons la procédure étape par étape pour un test de dépistage amélioré pour évaluer l'activité RSS des effecteurs P. sojae RxLR. Au total, l'expérience dure de 5 à 6 semaines. Par la suite, les RSS identifiés par l'analyse peuvent être caractérisés en termes de fonction et de mécanisme moléculaire. Comme exemple de notre approche, nous avons utilisé le P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppresseur du silençage 1 (PSR1), qui est séc...

Discussion

Le silençage de l'ARN est un mécanisme de défense clé utilisé par les plantes pour lutter contre les agents pathogènes viraux, bactériens, oomycètes et fongiques. À leur tour, ces microbes ont évolué des protéines suppressrices de silençage pour contrecarrer le silençage antiviral, et ces RSS interfèrent avec différentes étapes de la voie de silençage de l'ARN^22,23. Plusieurs tests de dépistage ont été élaborés pour identifier les RSS

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern