Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы представляем модифицированный метод скрининга, который может быть широко использован для быстрого скрининга РНК глушителей в растительных патогенных микроорганизмов.
РНК-глушитель является эволюционно сохраненным, последовательность конкретных механизмой регулировки генов в эукариотах. Несколько возбудителей растений развивались белки с возможностью ингибировать хозяина завода РНК глушитель пути. В отличие от белков вирус-эффектора, только несколько выделяемых белков-эффекторов показали способность подавлять заглушения РНК в бактериальных, омицете и грибковых патогенах, а молекулярные функции большинства эффекторов остаются в значительной степени неизвестными. Здесь мы подробно описываем слегка измененную версию соинфинигционного анализа, который может служить общим методом наблюдения заглушинием РНК и для характеристики белков-эффекторов, выделяемых растительными патогенами. Ключевыми шагами подхода являются выбор здоровых и полностью разработанных листьев, адаптация культуры бактерий к соответствующей оптической плотности (OD) на уровне 600 нм, а также наблюдение за флуоресценцией зеленого флуоресцентного белка (GFP) в оптимальное время на проникнув листья, чтобы избежать опущения эффекторов со слабой активностью подавления. Этот улучшенный протокол будет способствовать быстрому, точному и обширному скринингу супрессоров ЗАглушения РНК и служить отличной отправной точкой для исследования молекулярных функций этих белков.
За последние два десятилетия ускорение секвенирования генома микроорганизмов, вызывающих заболевания растений, привело к постоянному увеличению разрыва в знаниях между информацией о последовательности и биологическими функциями закодированных белков1. Среди молекул, выявленных секвенированием проектов являются молекулы-эффекторы, которые подавляют врожденный иммунитет и способствуют колонизации хозяина; эти факторы выделяются разрушительными возбудителями растений, включая бактерии, нематоды и нитевидные микробы. Чтобы ответить на эти угрозы, принимающие растения развили новые рецепторы, которые распознают эти эффекторы, что позволяет восстановить иммунный ответ. Таким образом, эффекторы подвергаются различным селективным давлениям, что приводит к диверсификации репертуаров эффекторов среди патогенных линий2. В последние годы, предполагается, эффекторы из растительных патогенов было показано, нарушить растительный врожденный иммунитет, препятствуя принимающей клеточных процессов в интересах микробов в различных отношениях, в том числе дисрегуляции сигнальных путей, транскрипции, внутриклеточного транспорта, цитоскелет стабильности, везикулы торговли, и РНК улащивания3,4. Однако подавляющее большинство патогенных эффекторов, особенно от нитевидных патогенных микроорганизмов, остаются загадочными.
РНК глушитель является гомология-опосредованного гена инактивации механизма, который сохраняется среди эукариот. Этот процесс срабатывает длинной двухцепочечной РНК (dsRNA) и нацелен на гомологичную одноцепочечную РНК (ssRNA) в последовательности-специфической манере, и он манипулирует широким спектром биологических процессов, включая противовирусную защиту6. Чтобы преодолеть врожденные иммунные реакции хозяина, некоторые вирусы эволюционировали, чтобы компенсировать замалчивание РНК, в том числе способность размножаться внутри внутриклеточных отсеков или вырваться из глушителя реорганизованного сигнала. Тем не менее, наиболее общая стратегия, с помощью которой вирусы защищают свои геномы от РНК глушитель-зависимой потери генной функции является кодирование конкретных белков, которые подавляют РНК глушитель7,8. Несколько механически различных подходов были созданы для скрининга и характеристики вирусных супрессоров РНК глушитель (VSRs), в том числе совместное проникновение агробактерии tumefaciens культур, трансгенных растений, выражающих побудители, прививки и клеточной культуры9,10,11,12,13.
Каждый из этих анализов имеет преимущества и недостатки, и определяет VSRs по-своему. Один из наиболее распространенных подходов основан на совместной инфильтрации отдельных культур A. tmuefaciens укрывательство потенциального вирусного белка и репортер гена (обычно зеленый флуоресцентный белок (GFP) на Nicotiana benthamiana 16c растений, составляющих GFP под контролем мозаичного вируса цветной капусты 35S промоутер. При отсутствии активного вирусного глушителя суитоля, GFP определяется как экзогенный клетками хозяина и заглушается в течение 3 дней после инфильтрации (dpi). В отличие от этого, если вирусный белок обладает активностью подавления, уровень экспрессии GFP остается стабильным за 3'9 dpi9. Это совместное проникновение анализ прост и быстр; однако она не является ни высокой стабильной, ни чувствительной. Тем не менее, анализ выявил многочисленные VSRs с различными последовательностями и структурами белка во многих РНК-вирусах7,8.
В последнее время несколько эффектор белков, которые могут ингибировать клеточной РНК глушитель деятельности были охарактеризованы от бактериальных, oomycete, и грибковых патогенов растений14,15,16. Эти выводы подразумевают, что подавление РНК-заглушения является общей стратегией для облегчения инфекции, которая используется патогенами в большинстве королевств. Теоретически, многие, если не все, из эффекторов могут кодировать РНК глушитель супрессоров (RSSs); однако на сегодняшний день было выявлено лишь несколько из них, главным образом из-за отсутствия надежной и общей стратегии скрининга. Кроме того, супрессоры заглушения РНК не были исследованы в подавляющем большинстве возбудителей растений17.
В этом отчете мы представляем оптимизированный и общий протокол для выявления эффекторов патогенных патогенов растений, которые могут подавлять локальную и системную РНК-глушитель с помощью агроинфильтрационного асссса. Главной целью этого исследования было подчеркнуть ключевые аспекты протокола и подробно описать шаги, тем самым предоставив скрининговый анализ, который подходит почти для всех эффекторов растительных патогенов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы процедуры должны проводиться при комнатной температуре (RT).
ВНИМАНИЕ: Депозит всех средств, содержащих патогенные микробы, а также растений и растительных тканей, используемых в анализе, в соответствующие контейнеры отходов и автоклав перед отказом.
1. Подготовка плазмидных конструкций, содержащих ориентировочные эффекты
2. Подготовка растений Н. Бентамиана 16c
3. Подготовка агробактерии культуры для инфильтрации
4. Со-инфильтрация Н. Бентамиана листья
5. Анализ изображений GFP
6. Северный анализ помот gFP мРНК в проникнутых листьях
Выше мы описываем пошаговую процедуру для улучшения скринингового обследования для оценки активности RSS P. sojae RxLR. В общей сложности эксперимент занимает от 5 до 6 недель. Впоследствии, RSSs определены анализ может быть дополнительно характеризуется с точки зрения фу...
РНК глушитель является ключевым защитным механизмом, используемым растениями для борьбы с вирусными, бактериальными, омицетами и грибковыми патогенами. В свою очередь, эти микробы эволюционировали глушитель белков супрессора для противодействия противовирусным глушителям, и эти RSS в...
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана грантами от "Шугуан программы" Шанхайского фонда развития образования и Шанхайской комиссии муниципального образования, Национальной ключевой программы исследований и разработок Китайской национальной ключевой программы НИОКР Китая ( 2018YFD0201500), Национальный фонд естественных наук Китая (No 31571696 и 31660510), Программа «Тысячи талантов» для молодых специалистов Китая и Комиссия по науке и технике муниципалитета Шанхая (18D-2260500).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
Camera | Nikon | D5100 | Photography |
ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены