Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo di screening modificato che può essere ampiamente utilizzato per vagliare rapidamente i soppressori del silenziamento dell'RNA negli agenti patogeni delle piante.

Abstract

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di regolazione genica evolutivamente conservato e specifico della sequenza negli eucarioti. Diversi patogeni delle piante hanno sviluppato proteine con la capacità di inibire il percorso di silenziamento dell'RNA vegetale ospite. A differenza delle proteine degli efmarcatori di virus, solo diverse proteine degli effetti secreti hanno mostrato la capacità di sopprimere il silenziamento dell'RNA nei patogeni batterici, oomycete e fungini, e le funzioni molecolari della maggior parte degli effetti rimangono in gran parte sconosciute. Qui, descriviamo in dettaglio una versione leggermente modificata del saggio di co-infiltrazione che potrebbe servire come metodo generale per osservare il silenziamento dell'RNA e per caratterizzare le proteine efsiate secrete dagli agenti patogeni delle piante. I passi chiave dell'approccio sono la scelta delle foglie sane e completamente sviluppate, l'adattamento della coltura batterica alla densità ottica appropriata (OD) a 600 nm e l'osservazione della fluorescenza delle proteine fluorescenti verdi (GFP) al momento ottimale sull'infiltrato per evitare di omettere effettori con debole attività di soppressione. Questo protocollo migliorato contribuirà a uno screening rapido, accurato ed approfondito dei soppressori per il silenziamento dell'RNA e servirà come un ottimo punto di partenza per studiare le funzioni molecolari di queste proteine.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, l'accelerazione nel sequenziamento del genoma dei microrganismi che causano le malattie delle piante ha portato ad un divario di conoscenza sempre crescente tra le informazioni di sequenza e le funzioni biologiche delle proteine codificate¹. Tra le molecole rivelate dai progetti di sequenziamento ci sono molecole echeggianti che sopprimono l'immunità innata e facilitano la colonizzazione dell'ospite; questi fattori sono secreti da patogeni vegetali distruttivi, tra cui batteri, nematodi e microbi filamentosi. Per rispondere a queste minacce, le piante ospiti hanno sviluppato nuovi recettori che riconoscono questi effetti, consentendo il ripristino della risposta immunitaria. Pertanto, gli esetritori sono soggetti a varie pressioni selettive, che portano alla diversificazione dei repertori degli efreattori tra le linee patogene². Negli ultimi anni, gli effetti putativi da agenti patogeni vegetali hanno dimostrato di interrompere l'immunità innata delle piante impedendo i processi cellulari dell'ospite a beneficio dei microbi in una varietà di modi, tra cui la disregolazione delle vie di segnalazione, la trascrizione, il trasporto intracellulare, la stabilità del citoscheletro, il traffico di vescicoli e la messa a tacere dell'RNA^3,4,5. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli effetti patogeni, in particolare quelli provenienti da patogeni filamentosi, sono rimasti enigmatici.

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di inattivazione genica mediato dall'omologia che viene conservato tra gli eucarioti. Il processo è innescato da un lungo RNA a doppio filamento (dsRNA) e si rivolge all'RNA omologato a filamento singolo (ssRNA) in modo specifico della sequenza e manipola un'ampia gamma di processi biologici, compresa la difesa antivirale⁶. Per superare le risposte immunitarie innate dell'ospite, alcuni virus si sono evoluti per compensare il silenziamento dell'RNA, inclusa la capacità di replicarsi all'interno di compartimenti intracellulari o fuggire dal segnale riorganizzato del silenziamento. Tuttavia, la strategia più generale con cui i virus proteggono i loro genomi dalla perdita dipendente dal silenziamento dell'RNA della funzione genica è codificare proteine specifiche che sopprimono il silenziamento dell'RNA^7,8. Diversi approcci meccanicistici sono stati stabiliti per vagliare e caratterizzare i soppressori virali del silenziamento dell'RNA (VSR), tra cui la co-infiltrazione delle colture di Agrobacterium tumefaciens, piante transgeniche che esprimono soppressori putativi, innesto e coltura cellulare^9,10^,11,12,13.

Ognuno di questi saggi ha vantaggi e svantaggi, e identifica VSR in modo proprio. Uno degli approcci più comuni si basa sulla co-infiltrazione delle singole colture A. tmuefaciens che ospitano la potenziale proteina virale e un gene reporter (tipicamente proteina fluorescente verde [GFP]) sulle piante di Nicotiana benthamiana 16c che esprimono costituitamente GFP sotto il controllo del virus del mosaico del caulfiore 35Sr. In assenza di un soppressore attivo del silenziamento virale, la GFP viene identificata come esogena dalle cellule ospiti e viene silenziata entro 3 giorni dopo l'infiltrazione (dpi). Al contrario, se la proteina virale possiede un'attività di soppressione, il livello di espressione della GFP rimane costante oltre i 3,9 dpi⁹. Questo saggio di co-infiltrazione è semplice e veloce; tuttavia, non è né altamente stabile né sensibile. Ciò nonostante, il saggio ha identificato numerosi VSR con diverse sequenze proteiche e strutture in molti virus dell'RNA^7,8.

Recentemente, diverse proteine eftraenti che possono inibire l'attività di silenziamento dell'RNA cellulare sono state caratterizzate da patogeni batterici, oomycete e piante fungine^14,15,16. Questi risultati implicano che la soppressione del silenziamento dell'RNA è una strategia comune per facilitare l'infezione che viene utilizzata dagli agenti patogeni nella maggior parte dei regni. In teoria, molti, se non tutti, degli effetti potrebbero codificare soppressori del silenziamento dell'RNA (RSS); ad oggi, tuttavia, solo alcuni sono stati individuati, principalmente a causa della carenza della strategia di screening affidabile e generale. Inoltre, i soppressori del silenziamento dell'RNA non sono stati studiati nella stragrande maggioranza degli agenti patogeni delle piante¹⁷.

In questa relazione, presentiamo un protocollo ottimizzato e generale per identificare gli effetti patogeni delle piante che possono sopprimere il silenziamento dell'RNA locale e sistemico utilizzando il saggio di agroinfiltrazione. L'obiettivo principale di questo studio era quello di enfatizzare gli aspetti chiave del protocollo e descrivere i passaggi in dettaglio, fornendo così un saggio di screening che è adatto a quasi tutti gli effetti degli agenti patogeni vegetali.

Protocollo

NOTA: Tutte le fasi della procedura devono essere condotte a temperatura ambiente (RT).

AVVISO: Depositare tutti i supporti contenenti microbi patogeni, nonché le piante e i tessuti vegetali utilizzati nel saggio, nei contenitori di rifiuti appropriati e nell'autoclave prima di scartare.

1. Preparazione di costrutti di plasmide contenenti effetti putativi

1. Selezionare gli effettori setomessi secreti che sono altamente espressi durante l'infezione, come determinato dal sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq), e ulteriormente dalla tecnica PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR).
2. Determinare il sito di scissione peptide del segnale di ogni effettore utilizzando uno strumento software come SignalP¹⁸.
3. Progettare primer ed eseguire la PCR per amplificare il gene codificando l'effetto di interesse utilizzando la polimerasi del DNA ad alta fedeltà. Eseguire l'elettroforesi gel agarose per controllare il prodotto PCR, quindi clonare l'amplificatore in gateway entry vector pQBV3 utilizzando il kit di clonazione senza legatura (Table of Materials), e successivamente nella destinazione espressione vettore pEG100 utilizzando la reazione di ricombinazione LR¹⁹.
4. Trasformare 3x5 l di miscela di reazione LR in 100 gradi di cellule competenti di E. coli (ad es., TOP10, DH5), diffondere le cellule batteriche trasformate sul mezzo agar Luria-Bertani (LB) integrato con 50 g/mL di kanamycin, e incubare a 37 gradi centigradi per 16-20 h.
   NOTA: I trasformazioni positivi possono essere identificati dalla colonia PCR²⁰ e ulteriormente analizzati da miniprep e sequenziamento plasmide.
5. Introduci 50-100 ng di plasmidi ricombinanti che trasportano la proteina esecuente in 100 gradi l di cellule A. tumefaciens chimicamente competenti (ad esempio, GV3101 o C58C1), mescola delicatamente, e poi congela l'azoto liquido per 1 min. Scongelare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5 min.
6. Aggiungete 500 ldi di brodo LB e incubate a 30 gradi centigradi per 4/6 h con agitazione delicata, quindi trasferite e sparse tutte le cellule agrobatteriche sul mezzo LB agar integrate con 50 g/mL di kanamycin e 50 g/mL rifampicina a 30 s per 2 giorni.
   NOTA: i cloni positivi possono essere verificati dalla colonia PCR.
7. Usa una singola colonia trasformata per esperimenti di infiltrazione agro-agrose, se non diversamente indicato.
   NOTA: Nella presente ricerca, nessuno dei geni efmortivi testati conteneva introni previsti; ciascuno dei geni è stato direttamente amplificato dal DNA genomico di un isolodio fitofathora. Un vettore di espressione della pianta Gateway senza tag è consigliato, ma non necessario.

2. Preparazione delle piante N. benthamiana 16c

1. Preparare miscele di terreno in vaso costituite da (per volume) muschio di torba, 30% perlite, e 20% vermiculite, e autoclave a 120 gradi centigradi per 20 min.
2. Immergere le miscele di terreno autoclaved con soluzione di fertilizzante vegetale (1 g/L) e sotto-imballarle in vasi più piccoli (80 mm x 80 mm x 75 mm) conservati in un vassoio più grande (540 mm x 285 mm x 60 mm).
3. Semina uno o due semi di N. benthamiana 16c sulla superficie del suolo di ogni vaso. Coprire il vassoio con una cupola di plastica e lasciare germinare i semi.
4. Mettete il vassoio sotto camere di crescita illuminate e a temperatura controllata con una temperatura di 23,25 gradi centigradi, un'umidità relativa del 50-60% e un fotoperiodo di lunga giornata (14 h luce/10 h di buio, con illuminazione a 130,150^s-e-2s^-1).
5. Togliere la cupola di plastica dopo che i semi germinano (3-4 giorni) e lasciare che le piantine crescano nelle stesse condizioni utilizzate per la fase di germinazione.
6. Aggiungere una quantità appropriata di acqua, mantenendo il terreno umido ma non ammollo, ogni 2/3 giorni; aggiungere fertilizzante ogni 10 giorni per promuovere un'ulteriore crescita. Mantenere le piante N. benthamiana 16c in condizioni normali fino a quando non sono pronti per l'uso; in questa fase la pianta dovrebbe avere almeno cinque foglie vere completamente sviluppate e nessun ascellare visibile o boccioli di fiori, e le foglie dovrebbero avere un aspetto verde sano).
7. Usa foglie di N. benthamiana 16c di 3-4 settimane per i saggi locali sul silenziamento dell'RNA e le giovani piante N. benthamiana 16c (10-14 giorni) per i saggi sistemici di silenziamento dell'RNA.
   NOTA: le condizioni di crescita delle piante e le strutture variano da laboratorio a seconda dei laboratori; scegliere foglie sane, ben sviluppate e completamente espanse per l'infiltrazione.

3. Preparazione della coltura dell'agrobacterium per l'infiltrazione

1. Raccogliere una colonia positiva dalla piastra LB e inoculare le cellule in tubo di vetro contenente 5 mL di lB medio integrato con 50 g/mL di kanamycin e 50 rifampicina g/mL. Far crescere le cellule a 30 gradi centigradi agitando a 200 giri/min per 24-48 h.
2. Trasferire 100 l di coltura in 5 mL di LB medio integrato con gli stessi antibiotici, 10 mM 2-(N-morpholino) acido etanofonico (MES; pH 5,6) e 20-M acetosyringone (AS). Coltiva i batteri a 30 gradi centigradi con lo scuotimento a 200 giri/min per 16-20 h.
3. Centrifuga cellule a 4.000 x g per 10 min. Versare il supernatante e rispendere il pellet in 2 mL di 10 mM MgCl₂ tampone.
4. Ripetere il passaggio 3.3 per garantire la rimozione completa degli antibiotici.
5. Determinare la densità della coltura dell'Agrobacterium misurando la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀). Regolare su un buffer OD₆₀₀ di 1,5,2,0 con 10 mM MgCl_2.
6. Aggiungere 10 mM MES (pH 5.6) e 150 M AS alle colture di sospensione finali e incubare le cellule a RT per almeno 3 h senza agitare.
   NOTA: Non lasciare le impostazioni di sospensione finali durante la notte.

4. Co-infiltrazione N. foglie di benthamiana

1. Mescolare volumi uguali di una coltura agrobatterica contenente 35S-GFP con una coltura agrobatterica contenente 35S- cetriolo mosaico soppressore 2b (CMV2b), effetto reputatore, o vettore vuoto (EV).
2. Attentamente e lentamente infiltrarsi le sospensioni miste di agrobacterium sui lati anassiali delle foglie di N. benthamiana 16c utilizzando una siringa senza aghi da 1 mL.
3. Rimuovere la sospensione batterica rimanente dalle foglie con tergicristalli e cerchiare i margini delle patch infiltrate con una penna maker.
4. Lasciare le piante infiltrate nella camera di crescita nelle stesse condizioni di crescita.
   NOTA: Per motivi di sicurezza e salute, occhiali protettivi e una maschera devono essere indossati durante l'infiltrazione. Per evitare la contaminazione incrociata, i guanti devono essere cambiati o sterilizzati con etanolo tra infiltrazioni. Normalmente è necessario almeno 1 mL di sospensioni di agrobacterium per foglia per l'infiltrazione. Per il silenziamento sistemico, saranno necessarie almeno due foglie per l'infiltrazione.

5. Analisi delle immagini GFP

1. Rileva visivamente la fluorescenza GFP nelle foglie appena coltivate di piante intere 2 settimane dopo l'infiltrazione (per il silenziamento sistemico dell'RNA) o patch infiltrate di foglie 3-4 dpi utilizzando una lampada ultravioletta a onde lunghe (UV) senza raccolta foglie.
2. Fotografa piante raccolte e/o foglie staccate con una fotocamera digitale dotata di filtri UV e gialli.
   NOTA: Per i saggi della soppressione del silenziamento locale, indaga sulle macchie infiltrate di foglie di N. benthamiana 16c, mentre per l'attività di soppressione del silenziamento sistemico, studia le foglie appena coltivate. L'attività di soppressione del silenziamento dell'RNA può variare tra i singoli effetti. Pertanto, osservare le patch o le foglie per alcuni giorni a partire da 3 dpi. Utilizzare CMV2b ed EV rispettivamente come controlli positivi e negativi.

6. Analisi del bocche del nord dei livelli di mRNA GFP nelle foglie infiltrate

1. Isolamento dell'RNA totale dal tessuto fogliare utilizzando il reagente di isolamento dell'RNA (Tabella dei materiali)
   1. Raccogliere i tessuti fogliada da patch N. benthamiana 16c infiltrati a 4,7 dpi, polverizzare in azoto liquido in una polvere fine e trasferire la polvere in uno sterile tubo da 2 mL.
   2. Aggiungere il reagente di isolamento dell'RNA (1 mL/100 mg di tessuto) immediatamente al tubo campionato in un cappuccio, agitare vigorosamente per omogeneare e incubare RT per 5 min.
   3. Aggiungere il cloroformio (reagente di isolamento RNA di 200 mL/1 mL) ad ogni tubo in un cappuccio, agitare vigorosamente per 15 s, e incubare a RT per 5 min. Centrifugare l'omogeneità a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
   4. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo privo di RNase e scartare il pellet. Aggiungere 0,7 volume di isopropanolo al supernatante, invertire delicatamente più volte e incubare la miscela a RT per 10 min.
   5. Far precipitare il pellet di RNA per centrifugazione a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
   6. Scartare il supernatante, lavare il pellet con il 70% di etanolo e asciugare all'aria il pellet in un cappuccio. Sciogliere l'RNA nell'acqua trattata in pircarbonato dietil (DEPC) incubando in un bagno d'acqua di 65 gradi centigradi per 10-20 min.
2. Analisi del nord del livello di mRNA GFP nelle foglie infiltrate
   1. Preparare un 1,2% di formaldeide denaturazione gel agarose in 1x tampone da corsa MOPS.
   2. Mescolare l'RNA 1:1 con la tintura per il carico di RNA e la denaturazione per incubazione a 65 gradi centigradi per 10 min, raffreddare immediatamente i campioni denaturati sul ghiaccio per 1 min.
   3. Caricare i campioni sul gel ed elettroforese a 100 V per 50 min fino a quando l'RNA è ben separato.
   4. Risciacquare il gel nel tampone di citrato saline-sodio (SSC) per rimuovere la formaldeide e trasferire il gel nella membrana di nylon mediante trasferimento capillare nel buffer 20x SSC durante la notte. Immergere la membrana in 2x SSC e fissare l'RNA alla membrana esponendo la membrana umida al collegamento uv cross.
   5. Aggiungere la quantità appropriata di buffer di ibridazione (10 mL per 100 cm² membrana; Tabella dei materiali) in un tubo di ibridazione e agitare a 60 gradi centigradi in un forno di ibridazione.
   6. Mettere la membrana nel tubo di ibridazione e incubare per 60 min a 60 gradi centigradi. Diluire una sonda di DNA con etichetta 5'DIG (concentrazione finale, 50 ng/mL) nella soluzione di ibridazione contenente buffer di ibridazione preriscaldato.
   7. Eliminare il buffer di preiibridazione e sostituirlo immediatamente con una soluzione di ibridazione preriscaldata contenente la sonda con etichetta DIG. Incubare la macchia con sonda a 60 gradi durante la notte, con agitazione delicata.
   8. Dopo l'ibridazione, lavare la membrana due volte in tamponi di rigore crescente a 60 gradi centigradi per 20 min ciascuno. Pulire delicatamente la membrana per rimuovere il buffer di lavaggio supplementare e aggiungere reagenti come suggerito nel kit di ibridazione e rilevamento chemiluminescente (Tabella dei materiali).
   9. Rileva i segnali ibridati mediante reazione chemiluminescente combinata con il sistema di imaging.

Risultati

In precedenza, descriviamo la procedura passo-passo per un migliore saggio di screening per valutare l'attività RSS degli efpelletori P. sojae RxLR. Complessivamente, l'esperimento richiede 5-6 settimane. Successivamente, gli RSS identificati dal saggio possono essere ulteriormente caratterizzati in termini di funzione e meccanismo molecolare. Come esempio del nostro approccio, abbiamo usato il P. sojae RxLR effecto Phytorphhsor di silenziamento dell'RNA 1 (PSR1), che v...

Discussione

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di difesa chiave impiegato dalle piante per combattere agenti patogeni virali, batterici, oomycete e fungini. A loro volta, questi microbi hanno sviluppato proteine soppressori silenziamento per contrastare il silenziamento antivirale, e questi RSS interferiscono con diversi passaggi del percorso di silenziamento dell'RNA^22,23. Sono stati sviluppati diversi saggi di screening per identificare gli RSS^10<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern