Triagem e Identificação de Supressores de Silenciamento de RNA de agentes secretos de patógenos vegetais

Resumo

Aqui, apresentamos um método de triagem modificado que pode ser amplamente usado para triagem rapidamente de supressores de RNA em patógenos vegetais.

Resumo

O silenciamento de RNA é um mecanismo evolutivamente conservado e específico de regulação genética em eucalinos. Vários patógenos vegetais desenvolveram proteínas com a capacidade de inibir o caminho de silenciamento de RNA da planta hospedeira. Ao contrário das proteínas causadoras de vírus, apenas várias proteínas de efeito ou de efeito secreto mostraram a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em patógenos bacterianos, oomycete e fúngicos, e as funções moleculares da maioria dos efetivadores permanecem em grande parte desconhecidas. Aqui, descrevemos em detalhes uma versão ligeiramente modificada do ensaio de co-infiltração que poderia servir como um método geral para observar o silenciamento de RNA e para caracterizar proteínas ou fetos ou fetos segregados por patógenos vegetais. Os principais passos da abordagem são escolher as folhas saudáveis e totalmente desenvolvidas, ajustar a cultura das bactérias à densidade óptica apropriada (OD) a 600 nm, e observar a fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP) no momento ideal no infiltrado sai para evitar omitir efetores com fraca atividade de supressão. Este protocolo melhorado contribuirá para uma triagem rápida, precisa e extensiva de supressores de silenciamento de RNA e servirá como um excelente ponto de partida para investigar as funções moleculares dessas proteínas.

Introdução

Nas últimas duas décadas, a aceleração no sequenciamento de genomas de microrganismos que causam doenças vegetais levou a uma lacuna de conhecimento cada vez maior entre informações de sequência e as funções biológicas de proteínas codificadas¹. Entre as moléculas reveladas por projetos de sequenciamento estão moléculas que suprimem imunidade inata e facilitam a colonização do hospedeiro; esses fatores são secretados por patógenos vegetais destrutivos, incluindo bactérias, nematoides e micróbios feudos. Para responder a essas ameaças, as plantas hospedeiras desenvolveram novos receptores que reconhecem esses efeitos, permitindo a restauração da resposta imune. Assim, os efetivadores estão sujeitos a diversas pressões seletivas, levando à diversificação de processos ou repertórios entre as linhagens patógenas². Nos últimos anos, os agentes putativos de patógenos vegetais têm mostrado interromper a imunidade inata da planta, impedindo processos celulares hospedeiros para beneficiar os micróbios de várias maneiras, incluindo a disregulação de caminhos de sinalização, transcrição, transporte intracelular, estabilidade do citoesqueleto, tráfico de vesículos e silenciamento de RNA^3,4,5. No entanto, a grande maioria dos patógenos, particularmente os de patógenos filamentous, permaneceram enigmáticos.

O silenciamento de RNA é uma máquina de inativação genética mediada por homologia que é conservada entre eupedia. O processo é desencadeado por longoR de dupla cadeia (dsRNA) e tem como alvo o RNA homônimo de uma única cadeia (ssRNA) de forma específica de sequência, e manipula uma ampla gama de processos biológicos, incluindo a defesa antiviral⁶. Para superar as respostas imunes inatas do hospedeiro, alguns vírus evoluíram para compensar o silenciamento de RNA, incluindo a capacidade de se replicar dentro de compartimentos intracelulares ou escapar do sinal reorganizado silenciante. No entanto, a estratégia mais geral pela qual os vírus protegem seus genomas contra a perda dependente de RNA da função genética é codificar proteínas específicas que suprimem o RNA silenciando^7,8. Várias abordagens mecanicamente diferentes foram estabelecidas para tela e caracterizam supressores virais de silenciamento de RNA (VSRs), incluindo a co-infiltração de culturas de tumefaciens Agrobacterium, plantas transgênicas expressando supressores putativos, enxerto e cultura celular^{9,10,11,12,13}.

Cada um desses ensaios tem vantagens e desvantagens, e identifica VSRs de sua maneira distinta. Uma das abordagens mais comuns baseia-se na co-infiltração de culturas individuais a. tmuefaciens que abrigam a proteína viral potencial e um gene repórter (tipicamente proteína fluorescente verde [GFP]) nas plantas nicotiana benthamiana 16c constitutivamente expressando GFP o controle do vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor. Na ausência de um supressor viral ativo, o GFP é identificado como exógeno pelas células hospedeiras e é silenciado dentro de 3 dias após a infiltração (dpi). Em contrapartida, se a proteína viral possui atividade de supressão, o nível de expressão do GFP permanece estável além de 3-9 dpi⁹. Este ensaio de co-infiltração é simples e rápido; no entanto, não é altamente estável nem sensível. No entanto, o ensaio identificou inúmeros VSRs com diversas sequências e estruturas proteicas em muitos vírus RNA^7,8.

Recentemente, várias proteínas effectoras que podem inibir a atividade de silenciamento de RNA celular foram caracterizadas a partir de patógenos vegetais bacterianos, oomycete e fúngicos^14,15,16. Esses achados implicam que a silenciamento de RNA é uma estratégia comum para facilitar a infecção que é usada por patógenos na maioria dos reinos. Em teoria, muitos, se não todos, dos efetivadores podem codificar supressores de rna silenciando (RSSs); até o momento, porém, apenas alguns foram identificados, principalmente devido à escassez da estratégia de triagem confiável e geral. Além disso, supressores de silenciamento de RNA não foram investigados na grande maioria dos patógenos vegetais¹⁷.

Neste relatório, apresentamos um protocolo otimizado e geral para identificar os efeitos de patógenos vegetais que podem suprimir o silenciamento de RNA local e sistêmico usando o ensaio de agroinfiltração. O principal objetivo deste estudo foi enfatizar os aspectos-chave do protocolo e descrever as etapas detalhadas, fornecendo assim um ensaio de triagem adequado para quase todos os efeitos dos patógenos vegetais.

Protocolo

NOTA: Todas as etapas do procedimento devem ser realizadas à temperatura ambiente (TR).

ATENÇÃO: Deposite todos os meios de comunicação contendo micróbios patogênicos, bem como as plantas e tecidos vegetais utilizados no ensaio, nos recipientes de resíduos apropriados e autoclave antes de descartar.

1. Preparação de construções plasmáticas contendo efeitos putativos

1. Selecione efeitos secretos putativos que são altamente expressos durante a infecção, conforme determinado pelo sequenciamento de RNA (RNA-Seq), e ainda pela técnica quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR).
2. Determine o site do decote do peptídeo de sinal de cada effector usando uma ferramenta de software como o SignalP¹⁸.
3. Projete primers e execute PCR para amplificar o gene codificando o efeito de interesse usando polimerase de DNA de alta fidelidade. Execute a eletroforese de gel de agarose para verificar o produto PCR e, em seguida, clonar o amplicon no vetor de entrada gateway pQBV3 usando o kit de clonagem sem ligação(Tabela de Materiais),e posteriormente no vetor de expressão de destino pEG100 usando a reação de recombinação LR¹⁹.
4. Transforme 3-5 μL de mistura de reação LR em 100 μL de células E. coli competentes (por exemplo, TOP10, DH5α), espalhe as células bacterianas transformadas em Meio agar Luria-Bertani (LB) complementada com 50 μg/mL kanamicina, e incubar a 37 °C por 16-20 h.
   NOTA: Os transformantes positivos podem ser identificados pela colônia PCR²⁰ e analisados por miniprep e sequenciamento plasmáticos.
5. Introduza 50-100 ng de plasmídeos recombinantes transportando proteína sucroável em 100 μL de células A. tumefaciens quimicamente competentes (por exemplo, GV3101 ou C58C1), misture suavemente e, em seguida, congele em nitrogênio líquido por 1 min. Descongele as células em um banho de água de 37 °C por 5 min.
6. Adicione 500 μL de caldo LB e incuba a 30 °C para 4-6 h com agitação suave, e depois transfira e espalhe todas as células de agrobactérias em meio LB agar complementado com 50 μg/mL kanamycin e 50 μg/mL rifampicina a 30 °C por 2 dias.
   NOTA: Clones positivos podem ser verificados pela colônia PCR.
7. Use uma única colônia transformada para experimentos de agroinfiltração, a menos que seja dirigido de outra forma.
   NOTA: Na presente pesquisa, nenhum dos genes realizadores testados continha intronas previstas; cada um dos genes foi diretamente amplificado a partir de DNA genômico de um isolado fitophthora sojae. Recomenda-se um vetor de expressão de planta Gateway sem qualquer etiqueta, mas não necessário.

2. Preparação de plantas N. benthamiana 16c

1. Prepare misturas de solo de vasos constituídas por (por volume) 50% de musgo de turfa, 30% perlite e 20% vermiculite, e autoclave a 120 °C por 20 min.
2. Misture o solo autoclavo com solução de fertilizante vegetal (1 g/L) e subembaem em potes menores (80 mm x 80 mm x 75 mm) armazenados em uma bandeja maior (540 mm x 285 mm x 60 mm).
3. Semea uma ou duas sementes de N. benthamiana 16c na superfície do solo de cada panela. Cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e deixe as sementes germinarem.
4. Coloque a bandeja câmaras de crescimento leves e controladas pela temperatura com temperatura de 23-25 °C, 50-60% umidade relativa e um período de fotoperiod de longo dia (14h claro/10h escuro, com iluminação de 130-150 μE·m^-2s^-1).
5. Tire a cúpula de plástico após o germinar as sementes (3-4 dias) e permita que as mudas cresçam as mesmas condições utilizadas para a etapa de germinação.
6. Adicione uma quantidade adequada de água, mantendo o solo úmido, mas não encharcado, a cada 2-3 dias; adicionar fertilizante a cada 10 dias para promover um crescimento adicional. Mantenha as plantas N. benthamiana 16c em condições normais até estarem prontas para uso; nesta fase, a planta deve ter pelo menos cinco folhas verdadeiras totalmente desenvolvidas e nenhum axillário visível ou brotos de flores, e as folhas devem ter uma aparência verde saudável).
7. Use folhas de 3 a 4 semanas de N. benthamiana 16c para ensaios locais de silenciamento de RNA, e as plantas jovens N. benthamiana 16c (10-14 dias de idade) para ensaios sistêmicos de silenciamento de RNA.
   NOTA: As condições e instalações de crescimento das plantas variam entre laboratórios; escolher folhas saudáveis, bem desenvolvidas e totalmente expandidas para infiltração.

3. Preparação da cultura Agrobacterium para infiltração

1. Escolha uma colônia positiva da placa LB e inocule as células em tubo de vidro contendo 5 mL de meio LB complementado com 50 μg/mL kanamicina e 50 μg/mL rifampicina. Cresça as células a 30 °C com tremor a 200 rpm por 24-48 h.
2. Transfira 100 μL de cultura para 5 mL de meio LB complementado com mesmos antibióticos, 10 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES; pH 5.6) e 20 μM acetosyringononona (AS). Cresça bactérias a 30 °C com tremor a 200 rpm por 16-20 h.
3. Células centrífugas a 4.000 x g por 10 min. Despeje o supernatante e resuspenda a pelota em 2 mL de 10 mM MgCl₂ tampão.
4. Repita o passo 3.3 para garantir a remoção completa dos antibióticos.
5. Determine a densidade da cultura Agrobacterium medindo a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀). Ajuste-se a um OD₆₀₀ de 1,5-2.0 com tampão MgCl₂ de 10 mM.
6. Adicione 10 mM MES (pH 5.6) e 150 μM AS às culturas finais de suspensão e incuba as células na RT por pelo menos 3 h sem tremer.
   NOTA: Não deixe as culturas finais de suspensão durante a noite.

4. Co-infiltração N. benthamiana folhas

1. Misture volumes iguais de uma cultura Agrobacterium contendo 35S-GFP com uma cultura Agrobacterium contendo 35S- supressor de vírus de mosaico de pepino 2b (CMV2b), efeito putativo ou vetor vazio (EV).
2. Cuidadosamente e lentamente, infiltrar-se nas suspensões mistas de agrobacterium nos lados abaxiais das folhas n. benthamiana 16c usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
3. Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com limpadores de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com uma caneta fabricante.
4. Deixe as plantas infiltradas na câmara de crescimento as mesmas condições de crescimento.
   NOTA: Por razões de segurança e saúde, óculos de proteção e uma máscara devem ser usados durante a infiltração. Para evitar a contaminação cruzada, as luvas devem ser trocadas ou esterilizadas com etanol entre infiltrações. Normalmente, pelo menos 1 mL de suspensões de agrobacterium por folha é necessário para infiltração. Para silenciamento sistêmico, pelo menos duas folhas serão necessárias para infiltração.

5. Análise de imagem gfp

1. Detecte visualmente fluorescência gfp em folhas recém-cultivadas de plantas inteiras 2 semanas após a infiltração (para silenciamento sistêmico de RNA) ou manchas infiltradas de folhas 3-4 dpi usando uma lâmpada ultravioleta de ondas longas (UV) sem a coleta de folhas.
2. Fotografe plantas coletadas e/ou folhas separadas com uma câmera digital equipada com filtros UV e amarelo.
   NOTA: Para ensaios de silenciamento local, investigue remendos infiltrados de folhas n. benthamiana 16c, enquanto para atividade sistêmica de silenciamento, investigue folhas recém-cultivadas. A atividade de supressão de silenciamento de RNA pode variar entre os efeitos individuais. Portanto, observe as manchas ou folhas ao longo de alguns dias a partir de 3 dpi. Use CMV2b e EV como controles positivos e negativos, respectivamente.

6. Análise de manchas norte dos níveis de GFP mRNA em folhas infiltradas

1. Isolamento do RNA total do tecido folha usando o reagente de isolamento rna (Tabela de Materiais)
   1. Colete tecidos de folhas de manchas infiltradas n. benthamiana 16c a 4-7 dpi, pulverizar em nitrogênio líquido para um pó fino e transferir o pó para um tubo estéril de 2 mL.
   2. Adicione o reagente de isolamento rna (1 mL/100 mg tecidual) imediatamente ao tubo amostrado em um capô, agite vigorosamente para homogeneizar e incubar na RT por 5 min.
   3. Adicione clorofórmio (200 μL/1 mL RNA reagente de isolamento) a cada tubo em um capô, agite vigorosamente por 15 s e incuba r 5 min. Centrífuga o homogeneado a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
   4. Transfira o supernatant para um novo tubo livre de RNase e descarte a pelota. Adicione 0,7 volume de isopropanol ao supernatante, inverta delicadamente várias vezes e incuba a mistura na RT por 10 minutos.
   5. Precipitar a pelota de RNA por centrífuga em 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
   6. Descarte o supernatante, lave a pelota com 70% de etanol e seque a pelota em um capô. Dissolva o RNA em água tratada com pirocarbonato diethyl (DEPC) incubando em um banho de água de 65 °C por 10-20 min.
2. Análise de manchas norte do nível de GFP mRNA nas folhas infiltradas
   1. Prepare um gel de agarose de dedenação de formaldeído de 1,2% em 1x mops tampão de execução.
   2. Misture rna 1:1 com tintura de carregamento de RNA e denatureza por incubação a 65 °C por 10 min, esfrie imediatamente as amostras desnaturadas no gelo por 1 min.
   3. Carregue as amostras no gel e eletroforese a 100 V por 50 min até que o RNA esteja bem separado.
   4. Enxágüe o gel em 20x tampão de citrato salino-sódio (SSC) para remover formaldeído e transfira o gel para membrana de nylon por transferência capilar em tampão SSC de 20x durante a noite. Mergulhe a membrana em 2x SSC e fixe o RNA na membrana expondo a membrana molhada à ligação da cruz UV.
   5. Adicione a quantidade apropriada de tampão de hibridização (10 mL por membrana de 100 cm^2; Tabela de Materiais) em um tubo de hibridização e agitar a 60 °C em um forno de hibridização.
   6. Coloque a membrana no tubo de hibridização e incuba por 60 min a 60 °C. Diluir uma sonda de DNA com rótulo DIG de 5'DIG (concentração final, 50 ng/mL) na solução de hibridização contendo tampão de hibridização pré-aquecido.
   7. Descarte o buffer de pré-hibridização e substitua imediatamente por uma solução de hibridização pré-aquecida contendo a sonda rotulada dig. Incubar a mancha com sonda a 60 °C durante a noite, com agitação suave.
   8. Após a hibridização, lave a membrana duas vezes em buffers de cada fio de 60 °C por 20 min cada. Limpe delicadamente a membrana para remover o tampão extra de lavagem e adicione reagentes conforme sugerido no kit de hibridização e detecção quimiologo(Tabela de Materiais).
   9. Detecte sinais hibridizados pela reação quimiológica combinada com o sistema de imagem.

Resultados

Acima, descrevemos o procedimento passo a passo para um melhor ensaio de triagem para avaliar a atividade RSS dos effectores P. sojae RxLR. Ao todo, o experimento leva de 5 a 6 semanas. Posteriormente, os RSSs identificados pelo ensaio podem ser ainda mais caracterizados em termos de função e mecanismo molecular. Como exemplo de nossa abordagem, usamos o supressor P. sojae RxLR do Silencing RNA 1 (PSR1), que é secretado e entregue em células hospedeiras através da h...

Discussão

O silenciamento de RNA é um mecanismo de defesa chave empregado pelas plantas para combater patógenos virais, bacterianos, oomycete e fúngicos. Por sua vez, esses micróbios evoluíram silenciando proteínas supressoras para neutralizar o silenciamento antiviral, e esses RSSs interferem em diferentes etapas da via de silenciamento rna^22,23. Vários ensaios de triagem foram desenvolvidos para identificar rsss¹⁰.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern