植物病原体の分泌されたエフェクターからのRNAサイレンシング抑制剤のスクリーニングと同定

要約

ここでは、植物病原体のRNAサイレンシング抑制剤を迅速にスクリーニングするために広く使用できる改変スクリーニング方法を紹介する。

要約

RNAサイレンシングは、真核生物における進化的に保存された配列特異的遺伝子調節機構です。いくつかの植物病原体は、宿主植物RNAサイレンシング経路を阻害する能力を持つタンパク質を進化させた。ウイルスエフェクタータンパク質とは異なり、細菌、ウーミセテ、真菌病原体のRNAサイレンシングを抑制する能力を示したのは、分泌されたエフェクタータンパク質の数個のみであり、ほとんどのエフェクターの分子機能はほとんど知られていない。ここでは、RNAサイレンシングを観察する一般的な方法として役立つ可能性のあるCo-浸潤アッセイのわずかに改変されたバージョンと、植物病原体によって分泌されるエフェクタータンパク質の特徴付けについて詳しく説明します。このアプローチの重要なステップは、健康で完全に発達した葉を選択し、細菌培養を600nmで適切な光学密度(OD)に調整し、浸潤した最適な時間に蛍光タンパク質(GFP)蛍光を観察することです。抑制活性が弱いエフェクターを省略することを避けるために葉。この改良されたプロトコルは、RNAサイレンシング抑制剤の迅速かつ正確かつ広範なスクリーニングに寄与し、これらのタンパク質の分子機能を調べるための優れた出発点として役立ちます。

概要

過去20年間、植物疾患を引き起こす微生物のゲノムシーケンシングの加速は、配列情報とコード化タンパク質の生物学的機能との間の知識格差の増加につながっている^1。シーケンシングプロジェクトによって明らかにされた分子の中には、自然免疫を抑制し、宿主のコロニー形成を促進するエフェクター分子があります。これらの因子は、細菌、線虫、糸状微生物を含む破壊的な植物病原体によって分泌される。これらの脅威に対応するために、宿主植物はこれらのエフェクターを認識する新しい受容体を進化させたので、免疫応答の回復が可能になりました。したがって、エフェクターは様々な選択的圧力を受け、病原体系統²間のエフェクターレパートリーの多様化を招く。近年、植物病原体からの推定エフェクターは、シグナル伝達経路の調節制御、転写、細胞内輸送、細胞骨格安定性、小胞の密転、およびRNAサイレンシング^3、4、5を含む様々な方法で微生物に利益をもたらす宿主細胞プロセスを妨げることによって、植物の先天性免疫を破壊することが示されている。しかし、大多数の病原体のエフェクター、特に糸状病原体のエフェクターは、謎めいたままである。

RNAサイレンシングは、真核生物の間で保存されている相同性媒介性遺伝子不活性化機械です。このプロセスは、長い二本鎖RNA(dsRNA)によって引き起こされ、相同の一本鎖RNA(ssRNA)を配列特異的に標的とし、抗ウイルス防御⁶を含む幅広い生物学的プロセスを操作する。宿主の自然免疫応答を乗り越えるために、一部のウイルスは、細胞内コンパートメント内で複製したり、サイレンシング再編成されたシグナルから脱出したりする能力を含むRNAサイレンシングを相殺するために進化した。それにもかかわらず、ウイルスがRNAサイレンシング依存性遺伝子機能の喪失からゲノムを保護する最も一般的な戦略は、RNAサイレンシング^7、8を抑制する特定のタンパク質をコードすることです。いくつかの機械学的に異なるアプローチが確立され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス培養物の共浸潤、推定サプレッサーを発現するトランスジェニック植物、グラフトおよび細胞培養^{9、10、11、12、13}のウイルス抑制剤(VSR)をスクリーニングし^、特徴付けされている。

これらのアッセイには、それぞれ長所と短所があり、VSRを独自の方法で識別します。最も一般的なアプローチの1つは、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの制御下でGFPを構成的に発現するニコチアナベンタミアナ16c植物上の潜在的なウイルスタンパク質およびレポーター遺伝子(典型的には緑色蛍光タンパク質[GFP])を収容する個々のA.tmuefaciens培養物の共浸透に基づいている。アクティブなウイルスサイレンシング抑制剤がない場合、GFPは宿主細胞によって外因性として同定され、浸潤後3日以内に無音(dpi)される。これに対して、ウイルスタンパク質が抑制活性を有する場合、GFPの発現量は3−9dpi9を超えて安定したままである。この共浸透アッセイは、シンプルかつ高速です。ただし、安定性も高い感度も低いわけではありません。それにもかかわらず、アッセイは、多くのRNAウイルス^7、8において多様なタンパク質配列および構造を有する多数のVsRを同定した。

近年、細胞RNAサイレンシング活性を阻害し得るいくつかのエフェクタータンパク質は、細菌、ウーミセテ、および真菌性植物病原体^14、15、16から特徴付けられている。これらの知見は、RNAサイレンシング抑制がほとんどの王国の病原体によって使用される感染を促進するための一般的な戦略であることを示唆している。理論的には、エフェクターの多くは、すべてではないにしても、RNAサイレンシング抑制剤(RSS)をコードする可能性があります。しかし、現在までに、信頼できる一般的なスクリーニング戦略の不足のために、少数しか特定されていません。また、植物病原体¹⁷の大半では、RNAサイレンシングの抑制剤は調査されていない。

本報告では、農潤浸潤アッセイを用いて局所的および全身的なRNAサイレンシングを抑制できる植物病原体エフェクターを同定するための最適化された一般的なプロトコルを提示する。この研究の最も重要な目的は、プロトコルの重要な側面を強調し、そのステップを詳細に記述し、それによって植物病原体のほぼすべてのエフェクターに適したスクリーニングアッセイを提供することであった。

プロトコル

メモ:手順のすべてのステップは、室温(RT)で行う必要があります。

注意:病原性微生物を含むすべての培地、ならびにアッセイに使用される植物および植物組織を、廃棄する前に適切な廃棄物容器およびオートクレーブに預けてください。

1. 推定エフェクターを含むプラスミド構築物の調製

1. RNAシーケンシング(RNA-Seq)によって決定される感染時に高発現する推定分泌エフェクターを選択し、さらに定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)技術によって決定されます。
2. SignalP¹⁸などのソフトウェアツールを使用して、各エフェクターのシグナルペプチド切断部位を決定する。
3. プライマーを設計し、高忠実度DNAポリメラーゼを使用して目的のエフェクターをコードする遺伝子を増幅するPCRを行います。アガロースゲル電気泳動を行ってPCR産物を検査し、次いで、リンゲーションフリークローニングキット(材料表)を用いてアンプリコンをゲートウェイ入口ベクターpQBV3にクローニングし、続いてLR組換反応¹⁹を用いてデスティネーション発現ベクターpEG100に入る。
4. 3-5 μLのLR反応混合物を有能な大腸菌細胞(例えば、TOP10、DH5α)の100μLに変換し、50 μg/mLカナマイシンを添加したルリア・ベルタニ(LB)寒天培地に形質転換された細菌細胞を広げ、37°Cで16〜20時間インキュベートする。
   注:正の形質転換体はコロニー^PCR20によって同定され、プラスミドミニプレップおよびシーケンシングによってさらに分析される。
5. 化学能力のあるA.ツメファシエンス細胞(GV3101またはC58C1など)の100μLにエフェクタータンパク質を運ぶ組換えプラスミド50-100ngを導入し、穏やかに混合し、液体窒素で1分間凍結します。
6. LBスープ500μLを加え、穏やかな振とうち4-6時間30°Cでインキュベートし、50μg/mLカナマイシンと50μg/mLリパンピシンを2日間30°Cで添加したLB寒天培地上にすべての農薬細胞を移して広げます。
   注:正のクローンはコロニーPCRによって検証することができます。
7. 特に指示がない限り、単一の形質転換コロニーを使用して、農潤浸潤実験を行います。
   注:本研究では、試験されたエフェクター遺伝子に予測イントロンが含まれていない。各遺伝子は、フィトフトーラ・ソジェ単離のゲノムDNAから直接増幅した。タグのないゲートウェイプラント発現ベクトルが推奨されますが、必須ではありません。

2.ベンタミアナ16c植物の調製

1. (体積で)50%の泥炭苔、30%パーライト、20%のバーミクライトからなるポッティング土壌ミックスを準備し、オートクレーブを120°Cで20分間準備します。
2. オートクレーブ土壌を植物肥料溶液(1 g/L)と混ぜ、より大きなトレイ(540 mm x 285 mm x 60 mm)に保存された小さなポット(80 mm x 80 mm x 75 mm)にサブパッケージします。
3. 各鍋の土壌表面にN.ベンタミアナ16cの1つまたは2つの種をまきます。トレイをプラスチックドームで覆い、種子が発芽できるようにします。
4. 温度23-25°C、相対湿度50~60%、長時間の光周期(14時間光/10時間暗く、照明130-150 μE・m^-2s-1)の下にトレイを置きます。
5. 種子が発芽した後にプラスチックドームを取り除き(3-4日)、発芽ステップに使用されるのと同じ条件で苗を成長させます。
6. 適切な量の水を加え、2〜3日ごとに土壌を湿らせても浸さない。更なる成長を促進するために10日ごとに肥料を追加します。彼らは使用の準備ができるまで、通常の条件下でN.ベンタミアナ16c植物を維持します。この段階では、植物は少なくとも5つの完全に開発された真の葉と目に見える腋や花の芽を持っている必要があり、葉は健康的な緑の外観を持っている必要があります)。
7. 局所RNAサイレンシングアッセイにはN.ベンタミアナ16cの3-4週齢の葉、全身RNAサイレンシングアッセイには若いN.ベンタミアナ16c植物(10-14日齢)を使用してください。
   注:植物の成長条件と施設は、研究所によって異なります。浸潤のために健康、よく発達し、完全に拡大された葉を選択してください。

浸潤のためのアグロバクテリウム培養の3.

1. LBプレートから正のコロニーを選び、50 μg/mLカナマイシンと50 μg/mLリパンピシンを添加したLB培地5mLを含むガラス管に細胞を接種します。24-48時間200rpmで振とうして30°Cで細胞を成長させます。
2. 同じ抗生物質を添加した5mLのLB培地、10mM 2-(N-モルフォリーノ)エタンスルホン酸(MES;pH 5.6)および20 μMアセトシリンゲ(AS)に100μLの培養液を移す。16-20時間200rpmで振とうして30°Cで細菌を成長させます。
3. 4,000 x gの遠心分離細胞を10分間4,000 x gで流し、ペレットを10 mM_MgCl2バッファーの2 mLで再懸濁します。
4. 手順3.3を繰り返して、抗生物質の完全な除去を確実に行います。
5. 600 nm (OD₆₀₀₎で光学密度を測定することにより、アグロバクテリウム培養物の密度を決定します。10 mM MgCl₂バッファを備えた 1.5-2.0 の OD₆₀₀に調整します。
6. 最終懸濁培養物に10 mM MES(pH 5.6)と150 μM ASを加え、3時間以上、振ずけて細胞をRTでインキュベートします。
   注:最終的なサスペンション文化を一晩放置しないでください。

4. 共浸透N. ベンタミアナの葉

1. 35S-GFPを含有するアグロバクテリウム培養液と35S-キュウリモザイクウイルス抑制剤2b(CMV2b)、推定エフェクター、または空ベクター(EV)を含む同等の量のアグロバクテリウム培養物を混合する。
2. N.ベンタミアナ16c葉の腹筋側に1mLの針なし注射器を使用して、慎重かつゆっくりと混合されたアグロバクテリウム懸濁液に浸潤する。
3. 軟部組織ワイパーで葉から残りの細菌性懸濁液を取り出し、浸透したパッチのマージンをメーカーペンで丸で囲みます。
4. 同じ成長条件下で成長室に浸潤した植物を残す。
   注意:安全と健康上の理由から、保護眼球とマスクは、浸潤時に着用する必要があります。クロスコンタミネーションを防ぐために、手袋は、浸透の間にエタノールで交換または滅菌する必要があります。通常、浸潤には葉当たり少なくとも1mLのアグロバクテリウム懸濁液が必要である。全身サイレンシングの場合、浸潤には少なくとも2つの葉が必要です。

5. GFP イメージング解析

1. 植物全体の新しく成長した葉のGFP蛍光を視覚的に検出する 2 週間の浸潤後 (全身 RNA サイレンシング用) または葉の浸潤パッチ 3-4 dpi 葉のコレクションなし長波紫外線 (UV) ランプを使用して.
2. 写真は、UVと黄色のフィルターの両方を取り付けたデジタルカメラで植物や取り外し葉を収集しました。
   注:局所サイレンシング抑制のアッセイでは、N.ベンタミアナ16c葉の浸潤パッチを調査し、全身サイレンシング抑制活性については、新たに成長した葉を調査する。RNAサイレンシング抑制活性は、個々のエフェクター間で変化する可能性がある。したがって、3 dpi から数日間にわたってパッチまたはリーフを観察してください。CMV2b と EV をそれぞれ正の制御と負の制御として使用します。

6. 浸潤した葉のGFP mRNAレベルのノーザンブロット分析

1. RNA単離試薬(材料表)を用いた葉組織からの全RNAの単離
   1. 浸潤したN.ベンタミアナ16cパッチから葉組織を4-7 dpiで集め、液体窒素を微粉に粉砕し、粉末を無菌2 mLチューブに移します。
   2. RNA単離試薬(1 mL/100 mgの組織)をフード内のサンプルチューブにすぐに添加し、均質に激しく振り、RTで5分間インキュベートします。
   3. フード内の各チューブにクロロホルム(200μL/1 mL RNA分離試薬)を加え、15秒強く振り回し、RTで5分間均離させ、ホモジネートを15分間15°Cで12,000 x gでインキュベートします。
   4. 上清を新しいRNaseフリーのチューブに移し、ペレットを捨てます。上清に0.7分のイソプロパノールを加え、数回静かに反転させ、RTで10分間インキュベートします。
   5. 4°Cで15分間12,000 x gで遠心分離することによりRNAペレットを沈殿させる。
   6. 上清を捨て、70%エタノールでペレットを洗い、ペレットをフードで空気乾燥させます。65°Cの水浴で10~20分間インキュベートして、RNAをジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水に溶解します。
2. 浸潤葉におけるGFP mRNAレベルのノーザンブロット分析
   1. 1.2%ホルムアルデヒド変性アガロースゲルを1x MOPSランニングバッファーに調製します。
   2. RNA 1:1とRNAローディング染料を混合し、65°Cで10分間インキュベートして変性し、すぐに1分間氷上で変性サンプルを冷やします。
   3. RNAが十分に分離されるまで、サンプルを100Vで50Vでゲルと電気phoreseにロードします。
   4. 20x生理食塩水ナトリウムクエン酸ナトリウム(SSC)バッファーでゲルをリンスし、ホルムアルデヒドを除去し、20x SSCバッファーでキャピラリー転写によりゲルをナイロン膜に移します。膜を2x SSCに浸し、濡れた膜をUV架橋に露出させることでRNAを膜に固定します。
   5. ハイブリダイゼーションバッファーの適切な量を追加します (100 cm²膜あたり10 mL;材料のテーブル)ハイブリダイゼーションチューブで、ハイブリダイゼーションオーブンで60°Cで攪拌します。
   6. 膜をハイブリダイゼーションチューブに入れ、60°Cで60分間インキュベートします。5'DIG標識DNAプローブ(最終濃度50ng/mL)を、予め温めたハイブリダイゼーションバッファーを含むハイブリダイゼーション溶液に希釈します。
   7. プリハイブリダイゼーションバッファーを破棄し、DIGラベルプローブを含むプレウォームハイブリダイゼーションソリューションに直ちに交換します。60°Cで一晩のプローブでブロットをインキュベートし、穏やかな攪拌を行います。
   8. ハイブリダイゼーション後、膜を60°Cでそれぞれ20分間増加する緩衝液で2回洗浄する。膜を軽く拭いて余分な洗浄バッファーを除去し、化学発光ハイブリダイゼーションおよび検出キット (表の材料) に示すように試薬を追加します。
   9. イメージングシステムと組み合わせた化学発光反応によりハイブリダイズされたシグナルを検出します。

結果

上記では、P. sojae RxLR エフェクターの RSS 活性を評価するためのスクリーニングアッセイの改善手順について説明します。全体として、実験には5-6週間かかります。続いて、アッセイによって同定されたRSSを、機能および分子機構の観点からさらに特徴付けることができる。我々のアプローチの一例として、我々は、感染時にハウストリアを介して分泌され、宿...

ディスカッション

RNAサイレンシングは、ウイルス、細菌、ウーミセテ、真菌病原体と闘うために植物によって採用される重要な防御機構です。次に、これらの微生物は、抗ウイルスサイレンシングを打ち消すためにサイレンシング抑制タンパク質を進化させ、そしてこれらのRSSは、RNAサイレンシング経路^22、23の異なるステップを妨害する。^RSS10を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern