تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي

Summary

يقدم البروتوكول نموذج ًا كاملًا من المورين الناجم عن TNBS من مرض كرون وطرق تصور مستقبلات الإستروجين بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام الفلورات المناعية لأقسام القولون الثابتة من formalin المضمنة في البارافين.

Abstract

مرض كرون هو النوع الأكثر تشخيصا من مرض التهاب الأمعاء. التهاب مزمن النامية في الأمعاء يؤدي إلى اضطراب التمعم وتلف الغشاء المخاطي المعوي ويبدو أن يرتبط مع زيادة خطر التحول النيوبلاستيك القولون. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن هرمون الاستروجين ومستقبلات الإستروجين لا تؤثر فقط على الأنسجة الحساسة للهرمون ، ولكن أيضًا على الأنسجة الأخرى التي لا ترتبط مباشرة بهرمون الاستروجين ، مثل الرئتين أو القولون. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتلطيخ الفلور المناعي الناجح لمستقبلات هرمون الاستروجين في القولون التي تم الحصول عليها من نموذج مورين من مرض كرون الناجم عن TNBS. يتم توفير بروتوكول مفصل لتحريض مرض كرون في إعداد الفئران والأمعاء بالإضافة إلى إجراء مناعي خطوة بخطوة باستخدام أقسام الأمعاء المضمنة بالبارافين الثابتة. الأساليب الموصوفة ليست مفيدة فقط للكشف عن مستقبلات هرمون الاستروجين والاستروجين إشارة التحقيق في الجسم الحي ولكن يمكن أيضا أن تطبق على للبروتينات الأخرى التي قد تشارك في تطوير التهاب القولون.

Introduction

مرض كرون (CD) هو مرض التهاب الأمعاء (IBD) يتجلى التهاب الأمعاء المزمن. لا يفهم مسببات CD بشكل جيد ، ولكن هناك عدد قليل من العوامل الرئيسية التي يبدو أنها مسؤولة عن تطوير CD ، بما في ذلك ميكروبيوتا الأمعاء ، والعوامل الوراثية والبيئية ، مثل النظام الغذائي أو الإجهاد¹. من أجل فهم أفضل لإمراض مرض كرون ، تم استخدام عدة نماذج من التهاب الأمعاء^2،3،^4،5^،66،7., في هذه المقالة، نقدم النتائج التي تم الحصول عليها من 2,4,6-trinitrobenzene حمض السلفوين (TNBS) الناجمة عن نموذج المورين من CD.

وقد تم توثيق أن هرمون الاستروجين قادرة على تحوير التهاب الأمعاء المزمن^{8،9،10،11،12.} النشاط البيولوجي لهرمون الاستروجين بوساطة مستقبلات الكونات ، من بينها مستقبلات الإستروجين النووية (ERs) ، أي ERα (جين ESR1)و ERα (جين ESR2)، وكذلك مستقبلات الإستروجين المقترنة بالبروتين G ، أي GPER (جين GPER1)، يشار إليها باسم ER^13،14. هناك عدة طرق لتحديد مستوى مستقبلات هرمون الاستروجين، ولكن يمكن استخدام عدد قليل فقط لتصور لهم في الأمعاء.

الكيمياء المناعية (IHC) هي طريقة تستخدم على نطاق واسع في الدراسات السريرية والأساسية للكشف عن بعض المستضدات في الخلايا أو الأنسجة مع الأجسام المضادة المترافقة الفلوروكروم. يبدو أن الـ IHC طريقة مهمة في تصور بنية الأنسجة ، وكذلك في تحديد وتوطين بروتينات محددة ، والتي قد تكون حاسمة لفهم تطور التهاب القولون. هنا ، نقدم بروتوكولًا كاملًا ومصدقًا عليه للتصور المناعي الكيميائي لمستقبلات هرمون الاستروجين في الأمعاء باستخدام الفلورسينس المناعي.

Protocol

أجريت الدراسات على الحيوانات بموافقة اللجنة الأخلاقية المحلية (28/ŁB29/2016) وفقًا للتوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي ومجلس 22 سبتمبر 2010 والتوصيات المؤسسية.

1. TNBS الناجمة عن نموذج مورين من مرض كرون

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول ذكور BALB/ C الفئران وزنها 25-28 غرام. يتم إيواء الحيوانات في درجة حرارة ثابتة (22-24 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 55 ± 5٪، والحفاظ عليها في دورة 12 ساعة ضوء / الظلام مع حرية الوصول إلى الكريات تشاو القياسية والصنبور الإعلانية libitum.

1. ضع الماوس في غرفة الحث وأغلق الغطاء بإحكام. قم بتنويم الفأرة لفترة وجيزة مع الايزوفلوران (25% O₂ مع معدل تدفق O₂ عند 1.5-2 لتر/دقيقة).
   ملاحظة: يجب أن يبقى معدل التنفس إيقاعيًا وأبطأ من المعتاد ويجب ألا يتغير استجابة ً لتحفيز ضار.
2. غرس 4 ملغ من TNBS في 0.1 مل من الإيثانول بنسبة 30٪ في 0.9٪ NaCl أو 0.1 مل من الإيثانول بنسبة 30٪ في 0.9٪ NaCl كتحكم في السيارة في القولون القاصي من خلال القسطرة.
   ملاحظة: يجب إدخال القسطرة بعناية حوالي 3 سم في داخل السّجس.
3. مراقبة الماوس يوميا من اليوم الثاني إلى الثامن للمعلمات السريرية بما في ذلك وزن الجسم، ونزيف المستقيم، واتساق البراز والوفيات.
4. في اليوم الثامن، قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم.

الشكل 1: الجدول الزمني لنموذج المورين الناجم عن TNBS لمرض كرون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. فصل وتقييم ماصوسكوبي القولون

ملاحظة: يوم واحد قبل انفصال القولون، تمييع 100 ميكرولتر من المضادات الحيوية في 1 مل من الفوسفات المُلّع بالمالحة (PBS) واتركه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.

1. تنظيف الجلد فوق البطن باستخدام الإيثانول 75٪ والشاش المعقم.
2. قطع جدار البطن من عظم الثدي إلى جُرج باستخدام مقص معقمة وملاقط.
3. قطع القولون في أقرب وقت ممكن إلى بشرة والمخنس.
4. ضع القولون على طبق بيتري. قطع القولون على طول من داخل الرّقان إلى نهاية الأوسيّة. تنظيف وغسل القولون 2-4 مرات في محلول المضادات الحيوية الباردة-PBS.
5. إجراء تقييم العياني باستخدام الفرجار وفقا للجدول 1.
   ملاحظة: التصاق الأنسجة^* وإحيائم / نزيف^#، دم البراز^# والإسهال^# تخضع للتقييم البصري. ^* تقييم التصاق الأنسجة باستخدام مقياس من ثلاث نقاط (0: القولون دون التصاق الأنسجة، 1: القولون مع التصاق الأنسجة المعتدلة، 2: القولون مع التصاق الأنسجة واسعة)؛ ^#على أساس غياب (0) أو وجود (1) من الدم / النزيف، والبراز والإسهال.

التصاق*	اُلياما/نزيف	دم البراز#	الإسهال#	طول القرحة	سمك القولون	طول القولون
نقاط (0 - 2)	نقاط (0 - 1)	نقاط (0 - 1)	نقاط (0 - 1)	سم/نقاط	مم/نقطة	سم/نقاط
0 – غائبة	0 – غائبة	0 – غائبة	0 – غائبة	0.5 سم = 0.5 نقطة	n مم = n نقاط	0 – lt;10% أقصر من عنصر التحكم
1 - معتدل	1 - الحاضر	1 - الحاضر	0.5 – البراز طفيف / فضفاض			1 - من 10 إلى 20٪ أقصر من عنصر التحكم
2 - الحاضر			1 - الحاضر			2 - أكثر من 20٪ أقصر من عنصر التحكم

الجدول 1: تسجيل المناظير للأمعاء من الفئران مع نموذج TNBS الناجم عن مرض كرون.

6. تحويل طول القرحة بالسنتيمتر إلى مقياس نقطة ، أي أن كل 0.5 سم من القرحة تحسب ك0.5 نقطة. تحويل سمك القولون في ملليمترات إلى مقياس نقطة، أي كل ن ملم يتوافق مع n نقطة.
7. تحويل طول القولون في سنتيمتر على مقياس من ثلاث نقاط. يتم تقييم طول القولون التي تم الحصول عليها من كل فأر مع مرض كرون الناجم عن TNBS فيما يتعلق بمتوسط طول القولون لمجموعة التحكم (0: <10٪ أقصر من التحكم، 1: من 10 إلى 20٪ أقصر من التحكم، 2: أكثر من 20٪ أقصر ثم السيطرة).
8. حساب مجموع النتيجة العيانية وفقا للمعادلة: مجموع درجة العيانية = التصاق (نقاط) + حُمية / نزف (نقاط) + دم البراز (نقاط) + الإسهال (نقاط) + طول القرحة (نقاط) + سمك القولون (نقاط) + طول القولون (نقاط).

3. إعداد عينة القولون

1. قطع القولون إلى شظايا 1-2 سم ووضع كل على الإسفنج في كاسيت النسيجية المسمى بشكل مناسب.
   ملاحظة: الإسفنج للكاسيت اتليسيوم منع القولون للطي أثناء الجفاف وحضانة في البارافين السائل.
2. وضع جزء القولون في 4٪ الفورمالديهايد واحتضان لمدة 24 ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية.
3. إعداد وبرمجة معالج الأنسجة ل1 ساعة من الحضانة في 50٪، 70٪، 90٪، 95٪، 100٪ الإيثانول، الإيثانول xylene/100٪ (1:1؛ v/v)، والزيلين فقط، وكذلك لما لا يقل عن 3 ساعة من الحضانة في البارافين السائل.
   ملاحظة: يجب أن يتم الجفاف في تركيزات متزايدة من الإيثانول والزيلين، ولكن يمكن تعديل تركيز الإيثانول. يوصى بخليط الزيلين/الإيثانول ولكن ليس مطلوباً.
4. نقل جزء القولون إلى مربع النسيج ية ووضعها في معالج الأنسجة المبرمجة مسبقا.
5. تشغيل معالج الأنسجة.
6. بعد خطوات الحضانة ، ضع جزء القولون في قالب معدني بحيث يكون طرفا القولون في وضع منتصب وملء ثلث القالب بالبارافين السائل.
7. ضع القالب في منطقة التبريد (-5 درجة مئوية) لبضع ثوان، ثم حرك القالب إلى منطقة الاحترار (70 درجة مئوية). مكان في الجزء السفلي من مربع النسيجية وتغطي كامل جزء القولون مع البارافين السائل.
8. اترك القالب المعدني مع جزء القولون في البارافين لبضع دقائق في منطقة التبريد. إزالة القالب المعدني من كتلة البارافين واحتضان لمدة 24 ساعة على الأقل في 4 درجة مئوية.
9. إزالة البارافين الزائدة من كتلة وإدراجه في ميكروتومي دوارة مؤتمتة بالكامل.
   ملاحظة: قد يتم تخزين كتلة البارافين في -20 درجة مئوية لبضع دقائق قبل هذه الخطوة.
10. قطع جزء القولون إلى 5 مقاطع ميكرون.
11. نقل قسم القولون إلى حمام مائي محمى مسبقا إلى 40 درجة مئوية.
12. استخدم الشريحة الزجاجية المسماة لإزالة قسم القولون من الحمام المائي.
    ملاحظة: تطفو أقسام القولون على الماء. وضع الشريحة الزجاجية المسمى في الماء تحت قسم القولون وسحب الشريحة الزجاجية بعناية.
13. اترك الشريحة الزجاجية لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. للتخزين على المدى الطويل، حافظ على الشريحة الزجاجية عند 4 درجات مئوية بعد 24 ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.

4. الكيمياء المناعية مع تلطيخ الفلورة المناعية

ملاحظة: لا تسمح المقطع القولون لتجف في أي خطوة أثناء الإجراء.

1. إزالة البارافين عن طريق احتضان الشريحة الزجاجية في زيلين لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
2. ضع الشريحة الزجاجية في الإيثانول xylene/100٪ (1:1؛ v/v) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
3. إعادة ترطيب قسم القولون في سلسلة من تركيزات الإيثانول المتناقصة ، أي 70 ٪ ، 50 ٪ ، 30 ٪ و 10 ٪ الإيثانول لمدة 5 دقيقة. كرر كل خطوة ثلاث مرات.
4. شطف الشريحة الزجاجية تحت الماء الجاري لمدة 5 دقيقة.
5. سخني محفظ استرجاع المستضد (10 مم من سيتر الصوديوم؛ 0.05% توين 20، درجة الحموضة 6.0) إلى 95-98 درجة مئوية وسخن الشريحة الزجاجية في محلول استرجاع مستضد الغليان لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: خطوة استرداد المستضد اختياري ولكن موصى به. يجب تحسين حل كشف القناع اعتمادًا على الأجسام المضادة المستخدمة في التجربة.
6. رسم دائرة حول قسم القولون باستخدام قلم كاره للماء.
   ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكن موصى بها. القلم الكاره للماء يمنع النفايات من الكواشف عن طريق الحفاظ على السائل المجمعة في حجم صغير داخل ملحوظ الدائرة.
7. احتضان القسم في محلول الماء 3٪ من بيروكسيديز الهيدروجين لمدة 10 دقيقة.
8. غسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4؛ 150 mM NaCl؛ 0.05٪ Tween 20) لمدة 5 دقيقة.
9. احتضان في محلول الحجب (5٪ مصل الماعز العادي؛ 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4؛ 150 mM NaCl؛ 0.05٪ تريتون X-100) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: في محلول الحجب، يجب أن يكون المصل العادي من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي. في المراحل التي تتطلب الحضانة، ضع الشريحة الزجاجية في غرفة رطوبة لمنع التبخر المفرط.
10. قم بإزالة محلول الحجب وإضافة 20-50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية ضد ERα أو ERα أو GPER المخفف في 1٪ من الزلفير المصلي البقري مع 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ تريتون X-100.
    ملاحظة: يتم عرض المخففات الموصى بها للأجسام المضادة الأولية في الجدول 2.

نوع الجسم المضاد	الأجسام المضادة ضد	الكلونية	الأنواع المضيفة	تفاعل الأنواع	التخفيف
الاساسي	ERα	بوليكلونال	الارنب	الانسان	1:100
				الماوس
				السلحفاه
				كابيبارا
	ERа	بوليكلونال	الارنب	الانسان
				القرد
				الفئران
				الماوس
				الاغنام
				خنزير
	GPER	بوليكلونال	الارنب	الانسان
				الفئران
				الماوس
الثانويه	DyLight 650	بوليكلونال	الماعز	الارنب	1:250

الجدول 2: خصائص الأجسام المضادة.

11. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الظلام.
12. إزالة محلول الأجسام المضادة وغسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
13. أضف 20-50 ميكرولتر من DyLight 650 جسممضاد ثانوي مخفف في 1٪ من الزلال المصل البقري (يحتوي على 50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ تريتون X-100). احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع صبغة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: يظهر التخفيف الموصى به للجسم المضاد الثانوي في الجدول 2.
14. إزالة محلول الأجسام المضادة وغسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ Tween 20) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
15. إضافة 2٪ DiOC6 (3) المخفف في 50 mM تريس-HCl، ودرجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
16. إزالة الحل وغسل في محلول الغسيل (50 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 150 mM NaCl، 0.05٪ Tween 20) لمدة 5 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
17. إضافة بضع قطرات من السائل القائم على الجلسرين مع DAPI مباشرة على قسم القولون وتغطي بعناية مع شريحة غطاء. احتضان قسم القولون لمدة 24 ساعة على الأقل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء عند تغطية الأنسجة مع شريحة الغطاء.
18. تحليل قسم القولون تحت المجهر البؤري يضم أهداف 20x أو 63x والغمر النفط باستخدام برامج مخصصة.
    ملاحظة: يسرد الجدول 3 خصائص الفلوروكرومات المستخدمة في هذه الدراسة.

نوع فلوروش	الطول الموجي (نانومتر)		صبغ
	الاثاره	الانبعاثات
DAPI	405	460 – 480	الازرق
DiOC6 (3)	485	538 – 595	الاخضر
DyLight 650	654	660 – 680	الاحمر

الجدول 3: خصائص الفلوروكرومات.

النتائج

خصائص تنظير القولون في الفئران مع مرض كرون الناجم عن TNBS
تظهر الصور التمثيلية للنقطتين المأخوذة من التحكم والفئران المعالجة من TNBS في الشكل 2. في الفئران التي لديها نموذج TNBS الناجم عن مرض كرون ، يتم تقليل طول القولون بينما يتم زيادة عرض القولون.

...

Discussion

هناك العديد من النماذج الحيوانية لفحص الفيزيولوجيا المرضية IBD ، بما في ذلك النماذج الوراثية أو المناعية أو العفوية ، وكذلك النماذج المستحثة كيميائيًا^15. ومن بين عدة أنواع من النماذج الحيوانية من التهاب القولون، النماذج المستحثة كيميائيا مثل النموذج الناجم عن TNBS الموصوفة في ه...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
BALB/C mice	University of Lodz	NA
Equipment
Caliper	VWR	62379-531
Cardboard block	NA	NA
Confocal microscope - TCS SP8	Leica Biosystems	NA
Fully automated rotary microtome - RM2255	Leica Biosystems	NA
Glass slide	Thermo Scientific	J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H	Leica Biosystems	NA
Histological box	Marfour	LN.138747
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Laboratory balance	Radwag	WL-104-0048
LAS X software	Leica Biosystems	NA
Metal mold	Marfour	CP.5105
Sterile gauze	NA	NA
Sterile scissor	NA	NA
Sterile tweezer	NA	NA
Tissue processor - TP1020	Leica Biosystems	NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid	Sigma-Aldrich	92822
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3294
DiOC6 (3)	Sigma-Aldrich	318426
DyLight 650 secondary antibody	Abcam	ab96886
ERα primary antibody	Abcam	ab75635
ERβ primary antibody	Abcam	ab3576
Ethanol	Avantor Performance Materials Poland	396480111
Formaldehyde	Avantor Performance Materials Poland	432173111
GPER primary antibody	Abcam	ab39742
Hydrochloric acid	Avantor Performance Materials Poland	575283421
Hydrogen peroxidase	Avantor Performance Materials Poland	885193111
isoflurane (forane)	Baxter	1001936040
Normal goat serum	Gibco	16210064
Paraffin	Leica Biosystems	39602012
Petrie dish	Nest Scientific	705001
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich	P3813
Physiological saline	Sigma-Aldrich	7982
Primocin (antibiotic)	Invitrogen	ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)	Invitrogen	P36971
Sodium chloride	Chempur	WE/231-598-3
Sodium citrate	Avantor Performance Materials Poland	795780429
Tris	Avantor Performance Materials Poland	853470115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Xylene	Avantor Performance Materials Poland	BA0860119