면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

요약

이 프로토콜은 파라핀에 내장된 포르말린 고정 결장 섹션의 면역형광을 이용한 면역성 화학에 의한 에스트로겐 수용체의 시각화 방법 및 크론병의 완전한 검증된 TNBS 유도 뮤린 모델을 제시한다.

초록

크론병은 가장 진단된 염증성 장 질환입니다. 장에서 발전하는 만성 염증은 연동 무질서 및 장 점막의 손상으로 이끌어 내고 결장 신생물 변환의 증가한 리스크와 연관되는 것처럼 보입니다. 축적 된 증거는 에스트로겐과 에스트로겐 수용체가 호르몬에 민감한 조직뿐만 아니라 폐 또는 결장과 같은 에스트로겐과 직접 관련이없는 다른 조직에도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 여기서, 우리는 TNBS 유도 크론병의 뮤린 모델로부터 수득된 결장에서 에스트로겐 수용체의 성공적인 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 기술한다. 마우스와 장 제제에서 크론 병의 유도에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 내장 장 절편을 사용하여 단계별 면역 히스토미칼 절차가 제공됩니다. 기술된 방법은 생체 내에서 에스트로겐 수용체 검출 및 에스트로겐 신호 조사뿐만 아니라 대장염의 발달에 관여할 수 있는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.

서문

크론병(CD)은 만성 장염증으로 나타나는 염증성 장질환(IBD)입니다. CD의 병인은 제대로 이해되지 않지만, 장내 미생물, 식이 또는 스트레스와 같은 유전적 및 환경적 요인을 포함하여 CD 발달을 담당하는 것으로 보이는 몇 가지 주요 요인이^{있다 1.} 크론 병의 병인을 더 잘 이해하기 위해^,장 염증의 여러 모델이^{2,3,43,5,56,7을}사용했습니다. 본 문서에서, 우리는 CD의 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉산(TNBS)-유도 된 뮤린 모델으로부터 얻은 결과를 제시한다.

에스트로겐은 만성 장 염증^{8,,9,10,,11,,12를}변조 할 수 있다는 것이 문서화되었습니다.⁹ 에스트로겐의 생물학적 활성은 핵 에스트로겐 수용체(ER), 즉 ERα(유전자 ESR1)및 ERβ(유전자 ESR2),G 단백질 결합 에스트로겐 수용체, 즉 GPER(유전자 GPER1)로지칭되는 핵 에스트로겐 수용체(ER)에 의해 매개된다.^13,14 에스트로겐 수용체의 수준을 결정하는 몇 가지 방법이 있습니다, 하지만 몇 가지만 장에서 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.

면역 조직화학(IHC)은 불소-컨쥬게이트 항체를 가진 세포 또는 조직에서 특정 항원검출을 위한 임상 및 기초 연구에서 널리 사용되는 방법이다. IHC는 대장염의 발달을 이해하는 것이 중요할 지도 모르다 특정 단백질의 식별 그리고 현지화에서 조직 구조 시각화에 있는 중요한 방법 일 것 같습니다. 여기에서, 우리는 면역형광을 사용하여 창자에 있는 에스트로겐 수용체의 면역성 화학적 시각화를 위한 완전하고 검증된 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

동물 연구는 유럽 의회 및 2010년 9월 22일 이사회의 지침 2010/63/EU 및 제도적 권고에 따라 지역 윤리위원회(28/ŁB29/2016)의 동의하에 수행되었습니다.

1. 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델

참고 : 이 프로토콜은 25-28 g의 수컷 BALB / C 마우스를 사용합니다. 동물은 일정한 온도 (22-24 ° C)에 보관되고, 상대 습도 55 ± 5 %, 표준 차우 펠릿 및 수돗물 ad libitum에무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 어두운 주기에서 유지됩니다.

1. 마우스를 유도 챔버에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 이소플루란(25%₂ O2+1.5-2L/min)으로 마우스를 짧게 마취시다.₂
   참고: 호흡률은 정상보다 리드미컬하고 느리게 유지되어야 하며 유해한 자극에 반응하여 변하지 않아야 합니다.
2. 0.9% NaCl에서 0.9% NaCl에서 30% 에탄올의 0.1 mL에 TNBS의 4 mg을 주입하거나 0.9% NaCl에서 0.1% 에탄올의 0.1 mL을 카테터를 통해 말단 결장으로 의한 비히클 제어로.
   참고 : 카테터는 항문으로 약 3cm 조심스럽게 도입해야합니다.
3. 체중, 직장 출혈, 대변 일관성 및 사망률을 포함한 임상 매개 변수에 대해 2일째부터 8일까지 매일 마우스를 모니터링합니다.
4. 8 일째에 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시하십시오.

그림 1: 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델에 대한 타임라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 결장의 분리 및 거시적 평가

참고: 결장 분리 하루 전에 인산완충염수(PBS) 1mL에 100 μL의 항생제를 희석하고 밤새 4°C에서 둡니다.

1. 75% 에탄올과 멸균 거즈를 사용하여 복부에 피부를 청소하십시오.
2. 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 가슴뼈에서 항문으로 복벽을 자른다.
3. 항문과 장모에 가능한 한 가까운 결장절단.
4. 페트리 접시에 결장합니다. 항문에서 대장을 장막 끝으로 잘라냅니다. 감기 항생제-PBS 용액으로 결장 2-4회 세척합니다.
5. 표 1에따라 캘리퍼스를 사용하여 거시적 평가를 수행합니다.
   참고 : 조직 부착^* 및 홍반 / 출혈^#,대변 혈액^# 및 설사^# 시각적 평가의 대상이됩니다. ^* 조직 접착은 3 점 척도를 사용하여 평가 (0 : 조직 접착이없는 결장, 1 : 적당한 조직 접착이있는 결장, 2 : 광범위한 조직 접착이있는 결장); ^#부재 (0) 또는 존재 (1) 홍반 / 출혈, 대변 혈액과 설사에 따라.

접착*	홍반/ 출혈#	대변 혈액#	설사#	궤양의 길이	결장 두께	결장 길이
포인트 (0 – 2)	포인트 (0 – 1)	포인트 (0 – 1)	포인트 (0 – 1)	cm/포인트	mm/포인트	cm/포인트
0 – 결석	0 – 결석	0 – 결석	0 – 결석	0.5 cm = 0.5 포인트	n mm = n 포인트	0 – <10% 컨트롤보다 짧아
1 – 보통	1 – 현재	1 – 현재	0.5 – 약간/느슨한 대변			1 – 컨트롤보다 10~20% 더 짧습니다.
2 – 현재			1 – 현재			2 – 컨트롤보다 20% 이상 짧습니다.

표 1: 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스의 장의 거시적 스코어링.

6. 센티미터의 궤양의 길이를 점 척도, 즉 궤양의 0.5 cm마다 0.5 포인트로 계산됩니다. 대장의 두께를 밀리미터 단위로 점 눈금으로 변환합니다( 즉, 모든 nmm은 n포인트에 해당합니다).
7. 콜론의 길이를 3점 척도로 센티미터단위로 변환합니다. TNBS-유도 된 크론 병을 가진 각 마우스로부터 얻은 결장의 길이는 대조군에 대한 평균 결장 길이와 관련하여 평가된다(0: lt;10% 대조군보다 짧음, 1: 대조군보다 10~20% 더 짧음, 2: 20% 이상 짧아 제어)를 참조하십시오.
8. 방정식에 따라 총 거시 점수 계산: 총 거시 점수 = 접착력 (점) + 홍반/출혈 (점) + 대변 혈중 (점) + 설사 (점) + 궤양의 길이 (포인트) + 결장 두께 (포인트) + 결장 길이 (점).

3. 결장 샘플 준비

1. 결장 1-2cm 조각으로 잘라 적절하게 표지 조직 학적 카세트에 스폰지에 각각을 배치합니다.
   참고: 조직학적 카세트용 스폰지는 액체 파라핀의 탈수 및 배양 중에 결장 접이식을 방지합니다.
2. 결장 단편을 포름알데히드 4% 에 놓고 4°C에서 적어도 24시간 동안 배양한다.
3. 조직 프로세서를 50%, 70%, 90%, 95%, 100% 에탄올, 자일렌/100% 에탄올(1:1; v/v) 및 자일렌만, 액체 파라핀에서 3시간 이상 인큐베이션할 때 1시간 동안 준비및 프로그래밍한다.
   참고 : 탈수는 에탄올과 자일렌의 농도가 증가함에 따라 수행되어야하지만 에탄올의 농도는 수정 될 수 있습니다. 자일렌/에탄올 혼합물은 권장되지만 필수는 아닙니다.
4. 결장 단편을 조직학적 상자로 옮기고 미리 프로그래밍된 조직 프로세서에 놓습니다.
5. 티슈 프로세서를 실행합니다.
6. 배양 단계 후, 결장의 두 끝이 똑바로 놓이게 하고 금형의 3분의 1을 액체 파라핀으로 채우게 되도록 결장 단편을 금속 몰드에 넣습니다.
7. 금형을 냉각 영역(-5°C)에 몇 초 동안 둔다음 금형을 온난화 영역(70°C)으로 옮니다. 조직학 상자의 하단 부분에 놓고 전체 결장 조각을 액체 파라핀으로 덮습니다.
8. 냉각 영역에서 몇 분 동안 파라핀에 결장 조각과 금속 금형을 둡니다. 파라핀 블록에서 금속 몰드를 제거하고 4°C에서 적어도 24시간 동안 배양한다.
9. 블록에서 여분의 파라핀을 제거하고 완전히 자동화 된 회전 마이크로 토메에 삽입합니다.
   참고: 파라핀 블록은 이 단계 전에 -20°C에서 몇 분 동안 보관될 수 있다.
10. 결장 조각을 5 μm 섹션으로 자른다.
11. 결장 부분을 40°C로 예열된 수조로 옮김을 옮김.
12. 라벨이 부착된 유리 슬라이드를 사용하여 수조에서 결장 부분을 제거합니다.
    참고: 결장 섹션은 물에 떠 있습니다. 라벨이 붙은 유리 슬라이드를 결장 섹션 아래에 있는 물에 넣고 유리 슬라이드를 조심스럽게 철회합니다.
13. 실온에서 24 시간 동안 유리 슬라이드를 둡니다. 장기간 보관을 위해 실온에서 24시간 배양한 후 유리 슬라이드를 4°C로 유지하십시오.

4. 면역형광 염색을 가진 면역성화학

참고: 수술 중 어떤 단계에서도 결장 부분을 건조시키지 마십시오.

1. 자일렌에서 유리 슬라이드를 5분 동안 배양하여 파라핀을 제거합니다.
2. 유리 슬라이드를 자일렌/100% 에탄올(1:1; v/v)에 5분 동안 놓습니다.
3. 결장 부위를 일련의 감소에 따라 수화, 즉 70%, 50%, 30% 및 10% 에탄올을 5분 동안 반복한다.
4. 흐르는 물에 유리 슬라이드를 5 분 동안 헹구십시오.
5. 예열 항원 회수 완충제(구연산 나트륨 10mM; 0.05% 트웬20, pH 6.0)를 95-98°C로 가열하고 10분 동안 끓는 항원 회수 용액으로 유리 슬라이드를 가열한다.
   참고: 항원 검색 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다. 마스킹 해제 용액은 실험에 사용된 항체에 따라 최적화되어야 한다.
6. 소수성 펜을 사용하여 콜론 섹션 주위에 원을 그립니다.
   참고: 이 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다. 소수성 펜은 액체를 원 내부에 작은 부피로 풀링하여 시약 낭비를 방지합니다.
7. 10 분 동안 수소 과산화효소의 3 % 물 용액으로 섹션을 배양하십시오.
8. 세척 용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% 트웬 20)에서 5 분 동안 세척하십시오.
9. 차단 용액에서 배양 (5 % 일반 염소 혈청, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05 % 트리톤 X-100) 실온에서 1 시간 동안.
   참고 : 차단 용액에서 정상적인 혈청은 이차 항체와 동일한 종에서 온 것이어야합니다. 배양이 필요한 단계에서 는 과도한 증발을 방지하기 위해 유리 슬라이드를 습도 챔버에 놓습니다.
10. 차단 용액을 제거하고 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트리톤 X-100으로 1% 소 혈청 알부민으로 희석된 ERα, ERβ 또는 GPER에 대해 20-50 μL의 1차 항체를 첨가한다.
    참고: 1차 항체의 권장 희석은 표 2에나와 있다.

항체 유형	반대 항체	복제	호스트 종	종 반응성	희석
기본	ERα	Polyclonal	토끼	인간의	1:100
				마우스
				거북이
				카피바라 주
	ERβ	Polyclonal	토끼	인간의
				원숭이
				쥐
				마우스
				양
				돼지
	GPER	Polyclonal	토끼	인간의
				쥐
				마우스
보조	다이라이트 650	Polyclonal	염소	토끼	1:250

표 2: 항체의 특성.

11. 어둠 속에서 4 °C에서 하룻밤 1 차 항체와 배양.
12. 항체 용액을 제거하고 세척 액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척한다.
13. 1% 소 혈청 알부민에 희석된 DyLight 650 이차 항체 20-50 μL을 첨가합니다(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트리톤 X-100 함유). 이차 항체와 배양염료와 결합 1 시간 어둠 속에서 실온에서.
    참고: 이차 항체의 권장 희석은 표 2에나타내고 있다.
14. 항체 용액을 제거하고 세척 액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척합니다.
15. 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl에서 희석 한 2 % DiOC6 (3)을 넣고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
16. 용액을 제거하고 세척액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척합니다.
17. 콜론 섹션에 DAPI가 있는 글리세롤 기반 액체 몇 방울을 넣고 커버 슬라이드로 조심스럽게 덮습니다. 4 °C에서 적어도 24 시간 동안 결장 섹션을 배양합니다.
    참고: 커버 슬라이드로 티슈를 덮을 때기포를 피하십시오.
18. 전용 소프트웨어를 사용하여 20배 또는 63배 의 목표와 오일 침수를 특징으로 하는 공초점 현미경으로 결장 섹션을 분석합니다.
    참고: 표 3은 이 연구에 사용된 불소의 특성을 나열합니다.

플루오로홈 타입	파장 (nm)		염료
	흥분	방출
DAPI	405	460 – 480	블루
디OC6 (3)	485	538 – 595	녹색
다이라이트 650	654	660 – 680	빨간색

표 3: 불소의 특성.

결과

TNBS 유도 된 크론 병을 가진 마우스에 있는 결장의 거시적 특성
대조군 및 TNBS 처리 마우스로부터 채취한 결장의 대표적인 이미지는 도 2에나타내고 있다. 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스에서, 결장의 길이는 결장의 폭이 증가하는 동안 감소된다.

토론

IBD 병리생리학 검사를 위한 수많은 동물 모델들이 있는데, 여기에는 유전적, 면역학적 또는 자발적인 모델뿐만 아니라 화학적으로 유도된^{모델(15)을}포함한다. 대장염의 여러 동물 모델 중에서, 이 프로토콜에 기재된 TNBS 유도 모델과 같은 화학적으로 유도된 모델은 비교적 저렴하고 쉽게 얻을 수 있다. 대장염의 TNBS 유도 뮤린 모델은 CD의 병리학적 기초와 관련된 몇 가지 임상 증?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
BALB/C mice	University of Lodz	NA
Equipment
Caliper	VWR	62379-531
Cardboard block	NA	NA
Confocal microscope - TCS SP8	Leica Biosystems	NA
Fully automated rotary microtome - RM2255	Leica Biosystems	NA
Glass slide	Thermo Scientific	J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H	Leica Biosystems	NA
Histological box	Marfour	LN.138747
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Laboratory balance	Radwag	WL-104-0048
LAS X software	Leica Biosystems	NA
Metal mold	Marfour	CP.5105
Sterile gauze	NA	NA
Sterile scissor	NA	NA
Sterile tweezer	NA	NA
Tissue processor - TP1020	Leica Biosystems	NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid	Sigma-Aldrich	92822
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3294
DiOC6 (3)	Sigma-Aldrich	318426
DyLight 650 secondary antibody	Abcam	ab96886
ERα primary antibody	Abcam	ab75635
ERβ primary antibody	Abcam	ab3576
Ethanol	Avantor Performance Materials Poland	396480111
Formaldehyde	Avantor Performance Materials Poland	432173111
GPER primary antibody	Abcam	ab39742
Hydrochloric acid	Avantor Performance Materials Poland	575283421
Hydrogen peroxidase	Avantor Performance Materials Poland	885193111
isoflurane (forane)	Baxter	1001936040
Normal goat serum	Gibco	16210064
Paraffin	Leica Biosystems	39602012
Petrie dish	Nest Scientific	705001
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich	P3813
Physiological saline	Sigma-Aldrich	7982
Primocin (antibiotic)	Invitrogen	ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)	Invitrogen	P36971
Sodium chloride	Chempur	WE/231-598-3
Sodium citrate	Avantor Performance Materials Poland	795780429
Tris	Avantor Performance Materials Poland	853470115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Xylene	Avantor Performance Materials Poland	BA0860119