Visualización de receptores de estrógeno en colones de ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBS utilizando inmunofluorescencia

Resumen

El protocolo presenta un modelo murino completo validado inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn y métodos para la visualización de receptores de estrógeno por inmunohistoquímica utilizando inmunofluorescencia de secciones de colon fijas en formalina incrustadas en parafina.

Resumen

La enfermedad de Crohn es el tipo más diagnosticado de enfermedad inflamatoria intestinal. La inflamación crónica que se desarrolla en el intestino conduce al trastorno de peristalsis y al daño de la mucosa intestinal y parece estar asociada con un mayor riesgo de transformación neoplásica del colon. La evidencia acumulada indica que los estrógenos y los receptores de estrógenos afectan no sólo los tejidos sensibles a las hormonas, sino también otros tejidos no directamente relacionados con los estrógenos, como los pulmones o el colon. Aquí, describimos el protocolo para la correcta tinción de inmunofluorescencia de receptores de estrógeno en el colon obtenido de un modelo murino de la enfermedad de Crohn inducida por TNBS. Se proporciona un protocolo detallado para la inducción de la enfermedad de Crohn en ratones y la preparación intestinal, así como un procedimiento inmunohistoquímico paso a paso utilizando secciones intestinales fijas en parafina fijas en formalina. Los métodos descritos no sólo son útiles para la detección de receptores de estrógeno y la investigación de señalización de estrógeno in vivo, sino que también se pueden aplicar a otras proteínas que pueden estar implicadas en el desarrollo de la colitis.

Introducción

La enfermedad de Crohn (CD) es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) que se manifiesta como inflamación del intestino crónico. La etiología de la CD no se entiende bien, pero hay algunos factores importantes que parecen ser responsables del desarrollo de la CD, incluida la microbiota intestinal, y los factores genéticos y ambientales, como la dieta o el estrés¹. Para una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad de Crohn, se han utilizado varios modelos de inflamación intestinal^2,3,4,5,6,7. En este artículo, presentamos resultados obtenidos de un modelo murino inducido por ácido sulfónico (TNBS) de 2,4,6-trinitrobenzeno(TNBS) de CD.

Se ha documentado que los estrógenos son capaces de modular la inflamación intestinal crónica^8,9,10,11,12. La actividad biológica de los estrógenos está mediada por receptores cognados, entre los que se encuentran los receptores de estrógeno nuclear (ER), es decir, eRE (gen ESR1)y ER ( gen ESR2), así como el receptor de estrógeno acoplado a proteínas G, es decir, GPER (gen GPER1),denominado ER^13,,14. Hay varios métodos para determinar el nivel de receptores de estrógeno, pero sólo unos pocos se pueden utilizar para visualizarlos en el intestino.

La inmunohistoquímica (IHC) es un método ampliamente utilizado en estudios clínicos y básicos para la detección de ciertos antígenos en células o tejidos con anticuerpos conjugados con fluorocromo. IHC parece ser un método importante en la visualización de la estructura tisular, así como en la identificación y localización de proteínas específicas, que pueden ser cruciales para entender el desarrollo de la colitis. Aquí, presentamos un protocolo completo y validado para la visualización inmunohistoquímica de receptores de estrógeno en el intestino utilizando inmunofluorescencia.

Protocolo

Los estudios en animales se llevaron a cabo con el consentimiento del Comité ético local (28/B29/2016) de conformidad con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, y las recomendaciones institucionales.

1. Modelo murino inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn

NOTA: Este protocolo utiliza ratones macho sABA/C con un peso de 25-28 g. Los animales se alojan a una temperatura constante (22-24 oC) y, humedad relativa de 55 a 5%, y se mantienen en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso gratuito a pellets de chow estándar y agua del grifo ad libitum.

1. Coloque el ratón en la cámara de inducción y cierre bien la tapa. Anestetizar el ratón brevemente con isoflurano (25% O₂ con O₂ caudal a 1,5-2 L/min).
   NOTA: La frecuencia respiratoria debe permanecer rítmica y más lenta de lo normal y no debe cambiar en respuesta a un estímulo nocivo.
2. Inculcar 4 mg de TNBS en 0,1 ml de etanol 30% en 0,9% de NaCl o 0,1 ml de etanol al 30% en 0,9% de NaCl como control del vehículo en el colon distal a través de un catéter.
   NOTA: El catéter debe introducirse cuidadosamente aproximadamente 3 cm en el ano.
3. Supervise el ratón diariamente del día dos al ocho para conocer los parámetros clínicos, como el peso corporal, el sangrado rectal, la consistencia de las heces y la mortalidad.
4. En el octavo día, eutanasia el ratón por luxación cervical.

Figura 1: Cronología del modelo murino inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Separación y evaluación macroscópica del colon

NOTA: Un día antes de la separación del colon, diluir 100 ml de antibiótico en 1 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) y dejar a 4 oC durante la noche.

1. Limpie la piel sobre el abdomen con 75% de etanol y gasa estéril.
2. Corta la pared abdominal del esternón al ano usando tijeras y pinzas estériles.
3. Cortar el colon lo más cerca posible del ano y el cecum.
4. Coloque el colon en el plato Petri. Corta los dos puntos desde el ano hasta el extremo del cecum. Limpie y lave el colon 2-4 veces en solución fría de antibiótico-PBS.
5. Realice una evaluación macroscópica utilizando una pinza según la Tabla 1.
   NOTA: La adhesión de los tejidos^* y el eritema/hemorragia,^#la^sangre fecal y la^diarrea están sujetos a evaluación visual. ^* La adhesión tisular se evalúa utilizando una escala de tres puntos (0: colon sin adherencia tisular, 1: colon con adhesión moderada de tejido, 2: colon con adhesión tisular extensa); ^•basado en ausencia (0) o presencia (1) de eritema/hemorragia, sangre fecal y diarrea.

Adhesión*	Eritema/hemorragia?	Sangre fecal?	Diarrea?	Duración de la úlcera	Grosor del colon	Longitud del colon
puntos (0 – 2)	puntos (0 – 1)	puntos (0 – 1)	puntos (0 – 1)	cm/puntos	mm/puntos	cm/puntos
0 – ausente	0 – ausente	0 – ausente	0 – ausente	0,5 cm a 0,5 puntos	n mm n puntos	0 – <10% más corto que el control
1 – moderado	1 – presente	1 – presente	0.5 – heces ligeras/sueltas			1 – de 10 a 20% más corto que el control
2 – presente			1 – presente			2 – más del 20% más corto que el control

Tabla 1: Puntuación macroscópica del intestino de los ratones con el modelo inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn.

6. Convertir la longitud de la úlcera en centímetros a una escala de puntos, es decir, cada 0,5 cm de úlcera se cuenta como 0,5 puntos. Convierta el grosor de los dos puntos en milímetros a una escala de puntos, es decir, cada n mm corresponde a n puntos.
7. Convierta la longitud de los dos puntos en centímetros en una escala de tres puntos. La longitud de colon obtenida de cada ratón con la enfermedad de Crohn inducida por TNBS se evalúa en relación con la longitud media del colon para el grupo de control (0: <10% más corto que el control, 1: de 10 a 20% más corto que el control, 2: más de 20% más corto que el control).
8. Calcular la puntuación macroscópica total de acuerdo con la ecuación: Puntuación macroscópica total - adhesión (puntos) + eritema /hemorragia (puntos) + sangre fecal (puntos) + diarrea (puntos) + longitud de la úlcera (puntos) + espesor del colon (puntos) + longitud del colon (puntos).

3. Preparación de la muestra de colon

1. Cortar el colon en fragmentos de 1-2 cm y colocar cada uno en una esponja en un casete histológico debidamente etiquetado.
   NOTA: Las esponjas para casetes histológicos evitan el plegado del colon durante la deshidratación y la incubación en parafina líquida.
2. Colocar el fragmento de colon en un 4% de formaldehído e incubar durante al menos 24 h a 4oC.
3. Preparar y programar el procesador de tejidos para 1 h de incubación en 50%, 70%, 90%, 95%, 100% etanol, xileno/100% etanol (1:1; v/v), y xileno solamente, así como para al menos 3 h de incubación en parafina líquida.
   NOTA: La deshidratación debe realizarse en concentraciones crecientes de etanol y xileno, pero la concentración de etanol puede modificarse. Se recomienda la mezcla de xileno/etanol, pero no es necesaria.
4. Transfiera el fragmento de colon a una caja histológica y colóquelo en el procesador de tejido preprogramado.
5. Ejecuta el procesador de tejidos.
6. Después de los pasos de incubación, coloque el fragmento de colon en un molde de metal para que los dos extremos del colon estén en posición vertical y llene un tercio del molde con parafina líquida.
7. Coloque el molde en el área de enfriamiento (-5 oC) durante unos segundos y, a continuación, mueva el molde al área de calentamiento (70 oC). Colocar en la parte inferior de la caja histológica y cubrir todo el fragmento de colon con parafina líquida.
8. Deje el molde metálico con el fragmento de colon en parafina durante unos minutos en el área de enfriamiento. Retirar el molde metálico del bloque de parafina e incubar durante al menos 24 h a 4oC.
9. Retire el exceso de parafina del bloque e insértelo en un microtome rotativo totalmente automatizado.
   NOTA: El bloque de parafina puede almacenarse a -20 oC durante unos minutos antes de este paso.
10. Cortar el fragmento de dos puntos en secciones de 5 m.
11. Transfiera la sección de dos puntos a un baño de agua precalentado a 40 oC.
12. Utilice el portaobjetos de vidrio etiquetado para eliminar la sección de dos puntos del baño de agua.
    NOTA: Las secciones de dos puntos flotan en el agua. Coloque el portaobjetos de vidrio etiquetado en el agua debajo de la sección de dos puntos y retire el portaobjetos de vidrio con cuidado.
13. Deje el portacristales durante 24 horas a temperatura ambiente. Para un almacenamiento a largo plazo, mantenga el portaobjetos de vidrio a 4 oC después de 24 h de incubación a temperatura ambiente.

4. Inmunohistoquímica con tinción de inmunofluorescencia

NOTA: No permita que la sección de dos puntos se seque en ningún paso durante el procedimiento.

1. Retire la parafina incubando el portaobjetos de vidrio en xileno durante 5 min. Repita este paso tres veces.
2. Coloque el portaobjetos de vidrio en xileno/100% etanol (1:1; v/v) durante 5 min. Repita este paso tres veces.
3. Rehidratar la sección del colon en una serie de concentraciones de etanol decrecientes, es decir, 70%, 50%, 30% y 10% etanol durante 5 min. Repita cada paso tres veces.
4. Enjuague el portaobjetos de vidrio con agua corriente durante 5 min.
5. Precalentar el tampón de recuperación de antígenos (10 mM de citrato de sodio; 0,05% Tween 20, pH 6.0) a 95-98 oC y calentar el deslizamiento de vidrio en solución de recuperación de antígeno hirviendo durante 10 minutos.
   NOTA: El paso de recuperación de antígenos es opcional, pero se recomienda. La solución de desenmascaramiento debe optimizarse en función del anticuerpo utilizado en el experimento.
6. Dibuje un círculo alrededor de la sección del colon usando una pluma hidrófoba.
   NOTA: Este paso es opcional, pero se recomienda. La pluma hidrófoba evita el desperdicio de reactivos manteniendo el líquido agrupado en un pequeño volumen en el interior marcado el círculo.
7. Incubar la sección en 3% solución de agua de hidrógeno peroxidasa durante 10 min.
8. Lavar en solución de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) durante 5 min.
9. Incubar en solución de bloqueo (5% de suero normal de cabra; 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) durante 1 h a temperatura ambiente.
   NOTA: En la solución de bloqueo, el suero normal debe ser de la misma especie que el anticuerpo secundario. En etapas donde se requiera incubación, coloque el portaobjetos de vidrio en una cámara de humedad para evitar una evaporación excesiva.
10. Retire la solución de bloqueo y agregue 20-50 l de anticuerpo primario contra ER, ER o GPER diluido en albúmina sérica bovina al 1% con 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Triton X-100.
    NOTA: Las diluciones recomendadas de anticuerpos primarios se muestran en la Tabla 2.

Tipo de anticuerpo	Anticuerpo contra	Clonality	Especies anfitrionas	Reactividad de las especies	Dilución
Primaria	ER	Policlonal	Conejo	Humano	1:100
				Ratón
				Tortuga
				Carpincho
	ER.	Policlonal	Conejo	Humano
				Mono
				Rata
				Ratón
				Ovejas
				Cerdo
	GPER	Policlonal	Conejo	Humano
				Rata
				Ratón
Secundaria	DyLight 650	Policlonal	Cabra	Conejo	1:250

Tabla 2: Características de los anticuerpos.

11. Incubar con anticuerpo primario durante la noche a 4oC en la oscuridad.
12. Retire la solución de anticuerpos y lave en solución de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20) durante 5 min. Repita este paso tres veces.
13. Añadir 20-50 l de anticuerpo secundario DyLight 650 diluido en albúmina sérica bovina al 1% (que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,05% de tritón X-100). Incubar con anticuerpo secundario conjugado con tinte durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    NOTA: La dilución recomendada del anticuerpo secundario se muestra en la Tabla 2.
14. Retire la solución de anticuerpos y lave en solución de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) durante 5 min. Repita este paso tres veces.
15. Añadir 2% DiOC6(3) diluido en 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
16. Retire la solución y lave en solución de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) durante 5 min. Repita este paso tres veces.
17. Agregue unas gotas de líquido a base de glicerol con DAPI directamente en la sección del colon y cubra cuidadosamente con una diapositiva de cubierta. Incubar la sección de dos puntos durante al menos 24 h a 4oC.
    NOTA: Evite las burbujas de aire al cubrir el tejido con el portaobjetos de la cubierta.
18. Analice la sección del colon bajo microscopio confocal con objetivos 20x o 63x e inmersión en aceite utilizando software dedicado.
    NOTA: En la Tabla 3 se enumeran las características de los fluorocromos utilizados en este estudio.

Tipo de fluorochome	Longitud de onda (nm)		Tinte
	Excitación	Emisión
Dapi	405	460 – 480	Azul
DiOC6 (3)	485	538 – 595	Verde
DyLight 650	654	660 – 680	Rojo

Tabla 3: Características de los fluorocromos.

Resultados

Características macroscópicas de los colones en ratones con enfermedad de Crohn inducida por TNBS
En la Figura 2se muestran imágenes representativas de colones tomados del control y ratones tratados con TNBS. En ratones con un modelo inducido por TNBS de la enfermedad de Crohn, la longitud del colon se reduce mientras aumenta el ancho del colon.

Discusión

Existen numerosos modelos animales para el examen de la fisiopatología de la EII, incluidos los modelos genéticos, inmunológicos o espontáneos, así como los modelos¹⁵inducidos químicamente. Entre los varios tipos de modelos animales de colitis, los modelos inducidos químicamente como el modelo inducido por TNBS descrito en este protocolo, son relativamente baratos y fáciles de obtener. El modelo murino inducido por TNBS de la colitis tiene varios síntomas clínicos relacionados con la bas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
BALB/C mice	University of Lodz	NA
Equipment
Caliper	VWR	62379-531
Cardboard block	NA	NA
Confocal microscope - TCS SP8	Leica Biosystems	NA
Fully automated rotary microtome - RM2255	Leica Biosystems	NA
Glass slide	Thermo Scientific	J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H	Leica Biosystems	NA
Histological box	Marfour	LN.138747
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Laboratory balance	Radwag	WL-104-0048
LAS X software	Leica Biosystems	NA
Metal mold	Marfour	CP.5105
Sterile gauze	NA	NA
Sterile scissor	NA	NA
Sterile tweezer	NA	NA
Tissue processor - TP1020	Leica Biosystems	NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid	Sigma-Aldrich	92822
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3294
DiOC6 (3)	Sigma-Aldrich	318426
DyLight 650 secondary antibody	Abcam	ab96886
ERα primary antibody	Abcam	ab75635
ERβ primary antibody	Abcam	ab3576
Ethanol	Avantor Performance Materials Poland	396480111
Formaldehyde	Avantor Performance Materials Poland	432173111
GPER primary antibody	Abcam	ab39742
Hydrochloric acid	Avantor Performance Materials Poland	575283421
Hydrogen peroxidase	Avantor Performance Materials Poland	885193111
isoflurane (forane)	Baxter	1001936040
Normal goat serum	Gibco	16210064
Paraffin	Leica Biosystems	39602012
Petrie dish	Nest Scientific	705001
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich	P3813
Physiological saline	Sigma-Aldrich	7982
Primocin (antibiotic)	Invitrogen	ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)	Invitrogen	P36971
Sodium chloride	Chempur	WE/231-598-3
Sodium citrate	Avantor Performance Materials Poland	795780429
Tris	Avantor Performance Materials Poland	853470115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Xylene	Avantor Performance Materials Poland	BA0860119