İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi

Özet

Protokol, Crohn hastalığının tam doğrulanmış TNBS kaynaklı murine modelini ve parafine gömülü formalin-sabit kolon bölümlerinin immünororesansını kullanarak immünohistokimya ile östrojen reseptörlerinin görüntülenmesi için kullanılan yöntemleri sunar.

Özet

Crohn hastalığı inflamatuar barsak hastalığının en çok tanı konulan tipidir. Bağırsakta gelişen kronik inflamasyon peristalsis bozukluğu ve bağırsak mukozası hasarına yol açar ve kolon neoplastik dönüşüm riski ile ilişkili gibi görünüyor. Kanıt birikmesi östrojen ler ve östrojen reseptörleri sadece hormona duyarlı dokuları etkiler gösterir, ama aynı zamanda diğer dokular doğrudan östrojen ile ilgili değil, akciğerler veya kolon gibi. Burada, tnbs kaynaklı Crohn hastalığının bir murine modelinden elde edilen kolonda östrojen reseptörlerinin başarılı immünororesans boyama protokolünü açıklıyoruz. Crohn hastalığının fare ve bağırsak preparatına indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol ve formalin-sabit parafin gömülü bağırsak bölümleri kullanılarak adım adım immünohistokimyasal bir prosedür sağlanmaktadır. Açıklanan yöntemler sadece östrojen reseptör algılama ve in vivo östrojen sinyal araştırma için yararlı değil, aynı zamanda kolit gelişiminde rol olabilir diğer proteinler için uygulanabilir.

Giriş

Crohn hastalığı (CD) kronik bağırsak iltihabı olarak kendini gösteren inflamatuar bir barsak hastalığıdır (IBD). CD etiyolojisi kötü anlaşılmaktadır, ancak cd gelişimi için sorumlu gibi görünen birkaç önemli faktörler vardır, bağırsak mikrobiyota dahil, ve genetik ve çevresel faktörler, diyet veya stres gibi¹. Crohn hastalığının patogenezinin daha iyi anlaşılması için, bağırsak iltihabının çeşitli modelleri^{,2,3,34,5,6,7}olarak kullanılmaktadır. Bu makalede, CD'nin 2,4,6-trinitrobenzene sülfonik asit (TNBS) kaynaklı murine modelinden elde edilen sonuçları satıyoruz.

Bu östrojenler kronik bağırsak iltihabı^8,9,^,10,,11,12modüle yeteneğine sahip olduğu belgelenmiştir. Östrojenlerin biyolojik aktivitesi, aralarında nükleer östrojen reseptörleri (ER), yani ERα (ESR1geni) ve ERβ (ESR2geni) ve G proteinle birleşen östrojen reseptörü, yani GPER (gen GPER1),membrana bağlı ER^13,14gibi konjenital reseptörler tarafından aracılık edilir. Östrojen reseptörlerinin düzeyini belirlemek için çeşitli yöntemler vardır, ama sadece birkaç bağırsakta onları görselleştirmek için kullanılabilir.

İmmünohistokimya (IHC), florokrom konjuge antikorları olan hücre veya dokularda bazı antijenlerin saptanması için klinik ve temel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. IHC doku yapısı görselleştirme önemli bir yöntem gibi görünüyor, yanı sıra belirlenmesi ve kolit gelişimini anlamak için çok önemli olabilir belirli proteinlerin lokalizasyonu. Burada, immünoresans kullanarak bağırsakta östrojen reseptörlerinin immünohistokimyasal görüntüleme için tam ve doğrulanmış bir protokol salıyoruz.

Protokol

Hayvan çalışmaları, Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/AB Direktifi ve 22 Eylül 2010 Tarihli Konsey Direktifi ve kurumsal tavsiyeler doğrultusunda Yerel Etik Komitesi'nin (28/ŁB29/2016) onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı ürinen üriner modeli

NOT: Bu protokol, 25-28 g. Ağırlığındaki erkek BALB/C farelerini kullanır. ad libitum

1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatın. Fareyi kısaca izoflurane ile anesthetize edin (25% O₂ O₂ akış hızı ile 1.5-2 L/dk).
   NOT: Solunum hızı ritmik ve normalden daha yavaş kalmalı ve zararlı bir uyarıcıya yanıt olarak değişmemelidir.
2. 0.1 mL%30 etanol %0.9 NaCl veya 0.1 mL %30 etanol içinde %0.9 NaCl'de %0.9 NaCl'de bir kateter aracılığıyla distal kolona araç kontrolü olarak 4 mg TNBS aşındırın.
   NOT: Kateter anüsiçine yaklaşık 3 cm dikkatlice tanıtılmalıdır.
3. Vücut ağırlığı, rektal kanama, dışkı tutarlılığı ve mortalite gibi klinik parametreler için fareyi ikinci günden sekiz güne kadar her gün izleyin.
4. Sekizinci günde, servikal çıkığı ile fareyi ötenazi edin.

Şekil 1: Crohn hastalığının TNBS kaynaklı murine modeli için zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kolon ayrılması ve makroskopik değerlendirilmesi

NOT: Kolon ayrılmasından bir gün önce, 1 mL fosfat tamponsal salininde (PBS) 100 μL antibiyotik seyreltin ve bir gecede 4 °C'de bırakın.

1. % 75 etanol ve steril gazlı bez kullanarak karın üzerinde cilt temizleyin.
2. Steril makas ve cımbız kullanarak göğüs kemiğinden anüse karın duvarını kesin.
3. Anüs ve çekum mümkün olduğunca yakın kolon kesin.
4. Petri kabının üzerine kolon yerleştirin. Çekum ucuna anüs boyunca kolon kesin. Soğuk antibiyotik-PBS çözeltisinde kolonu 2-4 kez temizleyin ve yıkayın.
5. Tablo 1'egöre kaliper kullanarak makroskopik değerlendirme yapın.
   NOT: Doku yapışması^* ve eritem / kanama^#, dışkı kan^# ve ishal^# görsel değerlendirmeye tabidir. ^* Doku adezyonu üç noktalı bir ölçek kullanılarak değerlendirmek (0: doku adezyonu olmadan kolon, 1: orta doku adezyonu ile kolon, 2: geniş doku adezyonu ile kolon); ^#yokluğuna göre (0) veya varlığı (1) eritem / kanama, dışkı kan ve ishal.

Yapışma*	Eritem / kanama#	Dışkı kanı#	İshal#	Ülser uzunluğu	Kolon kalınlığı	Kolon uzunluğu
puan (0 - 2)	puan (0 - 1)	puan (0 - 1)	puan (0 - 1)	cm/noktalar	mm/puan	cm/noktalar
0 – yok	0 – yok	0 – yok	0 – yok	0,5 cm = 0,5 nokta	n mm = n noktaları	0 –
1 – Orta	1 – mevcut	1 – mevcut	0.5 - hafif/gevşek dışkı			1 – kontrolden %10 ila %20 daha kısa
2 – mevcut			1 – mevcut			2 – kontrolden %20 daha kısa

Tablo 1: Crohn hastalığının TNBS kaynaklı modeli ile farelerin bağırsak makroskopik skorlama.

6. Ülserin uzunluğu santimetre olarak bir puan ölçeğine dönüştürülür, yani ülserher 0.5 cm 0.5 nokta olarak sayılır. Bir nokta ölçeğine milimetre kolon kalınlığı dönüştürmek, yani, her n mm n noktalarına karşılık gelir.
7. Üç noktalı bir ölçekte santimetre olarak kolon uzunluğu dönüştürün. TNBS'ye bağlı Crohn hastalığı olan her fareden elde edilen kolon uzunluğu, kontrol grubu için ortalama kolon uzunluğuna göre değerlendirilir (0:
8. Denkleme göre toplam makroskopik skoru hesaplayın: Toplam makroskopik skor = yapışma (puan) + eritem/kanama (puan) + dışkı kanı (puan) + ishal (puan) + ülser uzunluğu (puan) + kolon kalınlığı (puan) + kolon uzunluğu (puan).

3. Kolon numunesi hazırlama

1. 1-2 cm parçalar halinde kolon kesin ve uygun etiketli histolojik kaset sünger her yerleştirin.
   NOT: Histolojik kasetler için süngerler sıvı parafin dehidratasyon ve kuluçka sırasında kolon katlanmasını önler.
2. Kolon parçasını %4 formaldehit ve 4 °C'de en az 24 saat kuluçkaya yatırın.
3. Doku işlemcisini %50, %70, %90, %95, %100 etanol, ksilen/100% etanol (1:1; v/v) ve sadece ksilen ve sıvı parafinde en az 3 saat kuluçka için hazırlayın ve programlayın.
   NOT: Dehidratasyon etanol ve ksilen artan konsantrasyonlarda yapılmalıdır, ancak etanol konsantrasyonu değiştirilebilir. Ksilen/etanol karışımı önerilir ancak gerekli değildir.
4. Kolon parçasını histolojik bir kutuya aktarın ve önceden programlanmış doku işlemcisine yerleştirin.
5. Doku işlemcisini çalıştırın.
6. Kuluçka adımlarından sonra, kolon parçasını metal bir kalıba yerleştirin, böylece kolon iki ucu dik bir konumda dır ve kalıbın üçte birini sıvı parafinle doldurun.
7. Kalıbı soğutma alanına (-5 °C) birkaç saniye yerleştirin ve sonra kalıbı ısınma alanına (70 °C) taşıyın. Histolojik kutunun alt kısmına yerleştirin ve sıvı parafin ile tüm kolon parçası kapağı.
8. Soğutma alanında birkaç dakika için parafin kolon parçası ile metal kalıp bırakın. Metal kalıbı parafin bloğundan çıkarın ve 4 °C'de en az 24 saat kuluçkaya yatırın.
9. Bloktaki fazla parafini çıkarın ve tam otomatik bir döner mikrotome takın.
   NOT: Parafin bloğu bu adımdan önce -20 °C'de birkaç dakika saklanabilir.
10. Kolon parçasını 5 μm'lik bölümlere kesin.
11. Kolon bölümünü önceden ısıtılmış bir su banyosuna 40 °C'ye aktarın.
12. Su banyosu ndan kolon bölümünü kaldırmak için etiketli cam slayt kullanın.
    NOT: Kolon bölümleri su üzerinde yüzer. Kolon bölümünün altındaki suya etiketli cam kaydırağı koyun ve cam kaydırağı dikkatlice çekin.
13. Cam kaydırağı oda sıcaklığında 24 saat bekletin. Uzun süreli depolama için, oda sıcaklığında kuluçka 24 saat sonra 4 °C'de cam slayt tutun.

4. İmmünofloresan boyama ile immünohistokimya

NOT: İşlem sırasında kolon bölümünün herhangi bir adımda kurumasını beklemeyin.

1. 5 dakika ksilen cam slayt kuluçka parafin çıkarın.
2. Cam kaydırağı 5 dk.
3. Azalan etanol konsantrasyonları bir dizi kolon bölümü rehydrate, yani, 70%, 50%, 30% ve 10% etanol 5 dakika. Her adımı üç kez tekrarlayın.
4. 5 dakika boyunca akan suyun altında cam kaydırağı durulayın.
5. Ön ısıtma antijen alma tamponu (10 mM sodyum sitrat; %0.05 Ara 20, pH 6.0) ile 95-98 °C arasında ısıtın ve cam kaydırağı kaynayan antijen alma çözeltisinde 10 dakika ısıtın.
   NOT: Antijen alma adımı isteğe bağlıdır ancak önerilir. Maskeyi maskeleme solüsyonu, deneyde kullanılan antikora bağlı olarak optimize edilmelidir.
6. Bir hidrofobik kalem kullanarak kolon bölümü etrafında bir daire çizin.
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ancak önerilir. Hidrofobik kalem daire işaretlenmiş küçük bir hacim içinde havuzlu sıvı tutarak reaktiflerin israfını önler.
7. 10 dakika boyunca hidrojen peroksidaz% 3 su çözeltisi bölümü kuluçka.
8. Yıkama çözeltisinde yıkama solüsyonu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; %0.05 Ara 20) 5 dk.
9. Bloklama çözeltisinde kuluçka (5% normal keçi serumu; 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% Triton X-100) oda sıcaklığında 1 saat.
   NOT: Blokaj çözeltisinde normal serum ikincil antikorla aynı türe ait olmalıdır. Kuluçka gerektiren aşamalarda, aşırı buharlaşmayı önlemek için cam kaydırağı nem odasına yerleştirin.
10. Engelleme çözeltisini çıkarın ve 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, %0.05 Triton X-100 ile %1 büyükbaş serum albumininde seyreltilmiş ERα, ERβ veya GPER'a karşı 20-50 μL primer antikor ekleyin.
    NOT: Primer antikorların önerilen seyreltmeleri Tablo 2'degösterilmiştir.

Antikor tipi	Antikor karşı	Klonlama	Ev sahibi türler	Türlerin reaktivitesi	Seyreltme
Birincil	ERα	Poliklonal	Tavşan	Insan	1:100
				Fare
				Kaplumbağa
				Capybara
	ERβ	Poliklonal	Tavşan	Insan
				Maymun
				Sıçan
				Fare
				Koyun
				Domuz
	GPER	Poliklonal	Tavşan	Insan
				Sıçan
				Fare
Ikincil	DyLight 650	Poliklonal	Keçi	Tavşan	1:250

Tablo 2: Antikorların özellikleri.

11. Karanlıkta 4 °C'de bir gecede birincil antikor ile kuluçka.
12. 5 dk. Yıkama çözeltisi (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; %0.05 Ara 20) için antikor solüsyonu çıkarın ve yıkayın.
13. %1 büyükbaş serum albuminde seyreltilmiş 20-50 μL DyLight 650 sekonder antikor ekleyin (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, %0.05 Triton X-100 içeren). Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boya ile konjuge ikincil antikor ile kuluçka.
    NOT: İkincil antikorların önerilen seyreltilmesi Tablo 2'degösterilmiştir.
14. 5 dk. Yıkama çözeltisi (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, %0.05 Ara 20) için antikor solüsyonu çıkarın ve yıkayın.
15. 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırılmış %2 DiOC6(3) ekleyin.
16. Çözeltiyi çıkarın ve yıkama çözeltisinde yıkayın (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, %0.05 Ara 20) 5 dk. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
17. Doğrudan kolon bölümüne DAPI ile gliserol bazlı sıvı birkaç damla ekleyin ve bir kapak slayt ile dikkatlice kaplayın. 4 °C'de en az 24 saat kolon bölümünü kuluçkaya yatırın.
    NOT: Kapağı slayt ile doku kapsayan hava kabarcıkları kaçının.
18. 20x veya 63x hedefleri ve yağ daldırma özel yazılım kullanarak sahip konfokal mikroskop altında kolon bölümü analiz edin.
    NOT: Tablo 3 bu çalışmada kullanılan florokromların özelliklerini listelemelidir.

Fluorochome tipi	Dalga boyu (nm)		Boya
	Uyarma	Emisyon
Demir	405	460 – 480	Mavi
DiOC6 (3)	485	538 – 595	Yeşil
DyLight 650	654	660 – 680	Kırmızı

Tablo 3: Florokromların özellikleri.

Sonuçlar

TNBS'ye bağlı Crohn hastalığı olan farelerde kolonların makroskopik özellikleri
Kontrolden alınan kolonlar ve TNBS ile tedavi edilen farelerin temsili görüntüleri Şekil 2'degösterilmiştir. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı modeli olan farelerde, kolon genişliği artarken kolon uzunluğu azalır.

Tartışmalar

Genetik, immünolojik veya spontan modeller de dahil olmak üzere IBD patofizyolojisi muayenesi için çok sayıda hayvan modeli, yanı sıra kimyasal olarak indüklenen modeller¹⁵vardır. Kolitin çeşitli hayvan modelleri arasında, bu protokolde açıklanan TNBS kaynaklı model gibi kimyasal kaynaklı modeller nispeten ucuz ve elde edilmesi kolaydır. Kolitin TNBS'ye bağlı murine modelinde CD'nin patolojik temeli ile ilgili çeşitli klinik semptomlar vardır. İndüklenen kolit olan hayvanla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
BALB/C mice	University of Lodz	NA
Equipment
Caliper	VWR	62379-531
Cardboard block	NA	NA
Confocal microscope - TCS SP8	Leica Biosystems	NA
Fully automated rotary microtome - RM2255	Leica Biosystems	NA
Glass slide	Thermo Scientific	J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H	Leica Biosystems	NA
Histological box	Marfour	LN.138747
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Laboratory balance	Radwag	WL-104-0048
LAS X software	Leica Biosystems	NA
Metal mold	Marfour	CP.5105
Sterile gauze	NA	NA
Sterile scissor	NA	NA
Sterile tweezer	NA	NA
Tissue processor - TP1020	Leica Biosystems	NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid	Sigma-Aldrich	92822
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3294
DiOC6 (3)	Sigma-Aldrich	318426
DyLight 650 secondary antibody	Abcam	ab96886
ERα primary antibody	Abcam	ab75635
ERβ primary antibody	Abcam	ab3576
Ethanol	Avantor Performance Materials Poland	396480111
Formaldehyde	Avantor Performance Materials Poland	432173111
GPER primary antibody	Abcam	ab39742
Hydrochloric acid	Avantor Performance Materials Poland	575283421
Hydrogen peroxidase	Avantor Performance Materials Poland	885193111
isoflurane (forane)	Baxter	1001936040
Normal goat serum	Gibco	16210064
Paraffin	Leica Biosystems	39602012
Petrie dish	Nest Scientific	705001
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich	P3813
Physiological saline	Sigma-Aldrich	7982
Primocin (antibiotic)	Invitrogen	ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI)	Invitrogen	P36971
Sodium chloride	Chempur	WE/231-598-3
Sodium citrate	Avantor Performance Materials Poland	795780429
Tris	Avantor Performance Materials Poland	853470115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Xylene	Avantor Performance Materials Poland	BA0860119